Een roman Nicotinamide adenine dinucleotide correctiemethode voor intracellulaire CA2 + meting met Fura-2-analoog in levende cellen
20 september 2019
Vanwege de spectrale overlapping van de excitatie-en emissie golflengten van NADH en Fura-2-analogen, is de signaalstoring van beide chemicaliën in levende cellen onvermijdelijk tijdens de kwantitatieve meting van [ca.2 +]. Zo werd een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie op maat [CA2 +] ontwikkeld.
UV prikkelbare meervoudsondes, hebben een inherente signaalverontreiniging, vanwege de auto-meervoud geluiden. Het grootste deel van het probleem met NADH, is het beperken van het gebruik van een meervoud sonde. Een methode kan worden gebruikt om de buitenste florescentie van NADH nauwkeurig te corrigeren, om een echt, niet-verontreinigd meervoudsondesignaal te extraheren.
Het aantonen van de procedure zal Jeong Hoon Lee zijn, onze assistent-professor in mijn laboratorium. Nadat de myocyten zich op de bodem van de buis hebben laten vestigen, wordt de supernatant aangezogen. Label de cellen met twee milliliter vers bereide een millimolar fura-2-FFAM verdunningsoplossing gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius.
Plaats de buis aan het einde van de incubatie in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten rechtop voordat u de supernatant verwijdert. Voeg vervolgens vier milliliter kamertemperatuur cultuur medium voor opslag bij kamertemperatuur. Voor in situ isobestische fura-2-ffa punt identificatie mount de verdunde cellen op de microscoop stadium en wacht drie minuten voor de cellen te zinken naar de bodem.
Profuse NADH-vrije 37 graden Celsius calciumvrije oplossing in de celcultuur en zoek een doelcel. Overvloedige saponineoplossing gedurende 60 seconden voordat u opnieuw profusing met de NADH-vrije calciumvrije oplossing. Meet tegelijkertijd de fura-2-ff uitgezonden signalen op 450 en 500 nanometer, met behulp van een excitatiescan van 350 tot 365 nanometer met een stap van 0,1 nanometer en opnieuw te overmatigen met NADH-vrije calciumvrije oplossing.
Trek vervolgens de signalen in de calciumverzadigde oplossing af van de signalen in de calciumvrije omstandigheden. Bereken vervolgens de standaarddeviaties van de emissie bij elke excitatie en selecteer de excitatiegolflengte met de minimale standaarddeviatiewaarden als afzonderlijke isobestische punten. Om een multi-parametrisch meetsysteem te gebruiken om het achtergrondsignaal te detecteren en het signaal binnen het celgebied te corrigeren, monteer je kleurstofvrije cellen in het microscoopbad en laat je de cellen drie minuten vestigen.
Profuse NADH calcium-vrije oplossing in het bad voor ongeveer vijf minuten op een twee tot drie milliliter per minuut tarief en stel het object veld om de beoogde cel te dekken. Na het verplaatsen van de cel uit het veld meten de achtergrondsignalen van de cel-vrij venster en stel de signalen als verschuivingen. Breng vervolgens de cel terug naar de oorspronkelijke positie en meet de achtergrondsignalen van de cel en het celgebied.
Om de R-factor te berekenen gebruik maken van de verworven cel achtergrond en gebied signalen voor het opnieuw monteren van de kleurstof-vrije cellen op de microscoop en profusing met calcium-vrije oplossing. Meet de signalen zoals aangegeven voordat de celsuspensie wordt uitgemaakt met malateoplossing. Na het meten van de signalen overvloedig de cellen met pyruvaat oplossing gevolgd door overvloed met malate-pyruvaat oplossing en rotenone oplossing.
Bereken vervolgens de helling voor elk signaal. Hier worden de veranderingen in mitochondriaal calcium voor en na de correctie getoond. De resultaten tonen duidelijk aanzienlijke veranderingen in het mitochondriale calcium met een mitochondriale rustende calciumconcentratie zonder cytosolische calcium van 1,03 plus of min 0,13 micromolar en maximaal mitochondriaal calcium bij één micromolar calcium van 29,6 plus of min 1,61 micromolar.
Het mitochondriale transmembranepotentieel werd gemonitord met een overvloed aan twee nanomolars TMRE. De verandering in het mitochondriale potentieel werd berekend op basis van een veronderstelde initiële mitochondriale membraanpotentieel van min 150 millivolt, wat een afname van nadh in reactie op calciumtoevoeging aantoonde, met een negbaar effect op het mitochondriale membraanpotentieel. De mitochonddirale pH werd niet uitgevoerd door de toename van mitochondriaal calcium veroorzaakt door carboxy SNARF-1 laden.
Onjuiste isobestische punten resulteren in onjuiste R- en NADH-correctie. Zorg er dus voor dat je altijd de celvrije achtergrond en het celgebied correct meet. Deze techniek wordt gebruikt om mitochondriale calcium dynamische studies in de bioanalytische morsen bereid.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie pakt de uitdaging aan van signaalinterferentie door NADH- en fura-2-analogen bij het meten van calciumconcentraties in levende cellen. Er is een nieuwe online correctiemethode ontwikkeld om de nauwkeurigheid van [Ca2+]-metingen te verbeteren bij de aanwezigheid van NADH-signaalcontaminatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Signaalinterferentie bij fluorescentiemetingen
- Calciummeting in levende cellen
- Ontwikkeling van correctietechnieken
Achtergrond
- De spectrale overlap van excitatie- en emissiegolflengten compliceert de metingen.
- NADH kan het nut van meerdere probes bij fluorescentiemicroscopie beperken.
- Nauwkeurige metingen van [Ca2+] zijn cruciaal in cellulaire studies.
Gebruikte methoden
- Fluorescentiemeting met fura-2
- Cellulaire assays met myocyten
- Signaalcorrectietechnieken en achtergrondmeting
Belangrijkste resultaten
- Aanzienlijke veranderingen in mitochondriale calciumconcentraties zijn waargenomen.
- Een systematische aanpak is ontwikkeld om NADH-interferentie te corrigeren.
- De techniek is gevalideerd door middel van strikte experimentele procedures.
Conclusies
- De studie demonstreert met succes een methode om de nauwkeurigheid van fluorescentiemetingen te verbeteren.
- Dit heeft implicaties voor kwantitatieve analyses in de celbiologie.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige intracellulaire calciummeting is cruciaal voor doelwitvalidatie bij geneesmiddelenontwikkeling, in het bijzonder voor mitochondriale signaleringspaden. NADH-autofluorescentie veroorzaakt aanzienlijke interferentie in assays op basis van fura-2, wat de betrouwbaarheid van de gegevens in gevaar brengt en leidt tot een hoger percentage fout-positieven bij vroege screening. Deze NADH-correctiemethode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door ware calciumsignalen te isoleren, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in programma's gericht op cardiovasculaire en metabole doelwitten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om mitochondriale calciumhuishouding te onderzoeken als therapeutische hypothese in ziektemodellen.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door NADH-autofluorescentie te scheiden van echte fura-2-signalen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van het doelwit door kwantitatieve, interferentievrije metingen van de calciumflux.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound screening door een baseline van NADH-gecorrigeerde fluorescentie vast te stellen.
- Reproduceerbaarheid: Standardiseert de selectie van de excitatiegolflengte via bepaling van het isobestisch punt, waardoor variabiliteit tussen assays wordt geminimaliseerd.
- Multiplexing-capaciteit: Ondersteunt gelijktijdige meting van NADH, calcium en pH of membraanpotentiaal met behulp van verschillende excitatie-/emissiesets.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Direct toepasbaar op modellen van mitochondriële dysfunctie bij neurodegeneratieve en metabole aandoeningen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen observaties van calciumflux in de ontdekkingsfase en preklinische validatie met behulp van gecorrigeerde fura-2-FF-signalen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt betrouwbaardere go/no-go-beslissingen mogelijk door het verminderen van valse signalen in mitochondriële calciumassays.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van target-hypothesen via lead-identificatie tot preklinische mechanistische validatie, specifiek voor mitochondriële targets.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door calciumafhankelijke signalen te isoleren van metabole interferentie in live-cell assays.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid via achtergrondaftrekking en offset-correctie, waardoor de signaal-ruisverhouding voor de evaluatie van verbindingen wordt geoptimaliseerd.
- Analytics: Maakt kwantitatieve ratiometrische metingen mogelijk via de berekening van de R-factor met behulp van gecorrigeerde emissie bij 450 nm en 500 nm.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk door gelijktijdige monitoring van calcium en het mitochondriale membraanpotentiaal met behulp van TMRE.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar correctiekader dat toepasbaar is op diverse celtypen en fluorescentie-sondes die gevoelig zijn voor NADH-interferentie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door NADH-geïnduceerde fout-positieven in calciumsignalering te elimineren.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door systematische identificatie van het isobestisch punt en achtergrondsubtractie.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door biologische ruis in screeningscascades in een vroeg stadium te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van mitochondriale targets mogelijk door betrouwbare, interferentievrije functionele read-outs.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en de hantering van ratiometrische probes.
- Vereist instrumentatie die in staat is tot golflengtescan-excitatie (350–365 nm) en duale emissiedetectie (450 nm, 500 nm).
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de meting van het achtergrondsignaal en protocollen voor offsetcorrectie.
- Houdt rekening met adaptaties bij het toepassen van de methode op verschillende workflows voor celpreparatie zonder kleurstoffen.
- Afhankelijk van een nauwkeurige meting van de celvrije achtergrond en de signalen van het celoppervlak om een onjuiste selectie van het isobestisch punt te voorkomen.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
