Name: Een roman Nicotinamide adenine dinucleotide correctiemethode voor intracellulaire CA2 + meting met Fura-2-analoog in levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer een nieuwe NADH-correctiemethode voor accurate calciummeting met fura-2-analoog in levende myocyten. Deze techniek verbetert fluorescentiemicroscopie door signaalvervuiling te elimineren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd deels ondersteund door het basisprogramma voor wetenschappelijk onderzoek via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2018R1A6A3A01011832), door het ministerie van Wetenschappen, ICT & toekomstige planning (NRF-2016M3C1A6936606) en door het ministerie van handel, industrie & energie (10068076).

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het lokale Comité voor dierenverzorging en-gebruik.
1. voorbereiding van de oplossing
<ol><li>Bereid één vers geïsoleerde cardiale myocytes11. Opmerking: elk laboratorium kan een andere oplossing voor celopslag hebben. Hier worden de myocyten opgeslagen in kweekmedium (DMEM).</li>
	<li>Bereid 100 mL CA2 +-vrije oplossing (tabel 1).</li>
	<li>Bereid 50 mL kweekmedium in een bekerglas van 50 mL. Aliquot 5 mL en zet het in een waterbad van 37 °C. Houd de resterende oplossing bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid 50 mL van de saponine oplossing door 5 mg saponine toe te voegen aan 50 mL CA2 +-vrije oplossing. Opmerking: saponine wordt gebruikt voor cardiale myocyten, om cytosolische compartimenten te verwijderen, en om de mitochondriale fluorescentie alleen te visualiseren.</li>
	<li>Bereid 16 μL van 1 mM Fura-2-FF-AM opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO). Opmerking: Maak 1 mM stockoplossing van Fura-2-FF-AM opgelost in DMSO en aliquot 16 μL in een 2 mL Tube. Bewaar ze bij-20 °C tot het gebruik.</li>
	<li>Bereid 50 mL NADH-vrije CA2 +-vrije oplossing (tabel 1) en 50 ml NADH-vrije CA2 +verzadigde oplossing (tabel 1) wanneer isosbestic punten moeten worden gemeten. Stel de pH in op 7,0 met KOH. Opmerking: NADH-gratis CA2 +-vrije oplossing (tabel 1) bevat 10 μM FCCP en 100 μM ADP zonder enige mitochondriale substraten om NADH in mitochondriën te minimaliseren.</li>
	<li>Bereid 50 ml van CA2 +-vrije oplossing, 50 ml malaat oplossing, 50 ml pyruvaat oplossing, 50 ml malaat-pyruvaat oplossing, en 50 ml rotenon oplossing voor NADH correctiefactor metingen (tabel 1).</li>
</ol>2. fluoroprobe laadprocedure in de mitochondriën
<ol><li>Bereid de kleurstof laadoplossing door 2 mL van het kweekmedium toe te voegen aan 16 μL van 1 mM Fura-2-FF-AM. Opmerking: fluorescerende kleurstof is kwetsbaar onder het licht. Bereid de oplossing vlak voor gebruik. Bewaar de oplossing met de fluorescerende kleurstof op een donkere plaats. De uiteindelijke concentratie van Fura-2-FF-AM is 8 μM. Als Carboxy-SNARF-1 werd gebruikt, bereidt u de kleurstof ladings oplossing voor met 2 μM Carboxy-SNARF-1-AM.</li>
	<li>Neem 2 mL van de geïsoleerde cellen en plaats in een 5 mL reageerbuis in een rechtopstaande positie.</li>
	<li>Wacht 15 minuten tot de myocyten naar beneden zinken en verwijder het supernatant. Opmerking: het supernatant kan celresten bevatten. Centrifugeer de buis niet om celbeschadiging te voorkomen.</li>
	<li>Voeg 2 mL van de kleurstof laadoplossing toe.</li>
	<li>Inbroed de kleurstof laadoplossing met cellen voor 60 min bij 4 °C.</li>
	<li>Zet de reageerbuis dan 30 min rechtop in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en voeg 4 mL voorverwarmde kweekmedium van 37 °C toe. Inincuberen de cellen voor 60 min in een 37 °C waterbad.</li>
	<li>Verwijder ten slotte het supernatant, Voeg 4 mL kweekmedium toe bij kamertemperatuur en houd de buis op kamertemperatuur.</li>
</ol>3. introductie van het multiparametrische meetsysteem
Opmerking: afbeelding 1 toont een diagram van het hele systeem.
<ol><li>Gebruik voor een excitatie lichtbron een snelle Monochromator (polychroom II) die het licht binnen 3 MS kan veranderen.</li>
	<li>Gebruik een olie Dompel lens (40x, NA 1,3) met een omgekeerde Microscoop om de signaalintensiteit te verhogen.</li>
	<li>Gebruik een Near-Infrared filter en een CCD-camera (Charge-gekoppelde apparaat) om het object veld te bewaken zonder fluorescerende signaalinterferentie.</li>
	<li>Leg de afbeelding van het object veld vast om het gebied te krijgen.</li>
	<li>Pas het object veld in het monitor scherm aan met een velddiafragma om de cel te tonen om de achtergrond te verkleinen.</li>
	<li>Gebruik vier fotomultiplicator-buizen met elk band-pass-filter (450, 500, 590 en 640 nm) om emissie golflengten te detecteren met de telmethode foton. Gebruik de juiste dichroïde spiegels om het emissie licht te splitsen en om te buigen. Opmerking: het excitatie lampje is zeer sterk in vergelijking met het emissie licht. Kies dus de band-pass filter met de hoogste Blokkeer karakteristieken om de achtergrond te verkleinen. Een foton tellings systeem bestaat uit een combinatie van pmts, foton teller units en een High-Speed teller. Om het systeem te controleren en om de gegevens te proeven, werd een Custom-Made rijsoftware gebruikt. Het is noodzakelijk een manier te vinden om deze methode met andere systemen toe te passen.</li>
</ol>4. NADH correctiemethoden met een multiparametrisch meetsysteem
<ol><li>Identificatie van de isosbestic punten van Fura-2-FF in situ. Opmerking: veel rapporten hebben verklaard dat fluorescentie kenmerken in cellen worden gewijzigd. Voer daarom alle procedures uit om de parameters te verkrijgen om de storing in situ te corrigeren.
	<ol>
<li>Monteer de kleurstof geladen cel op de Microscoop en wacht 3 min om de cellen naar de bodem te zinken. Opmerking: pas de celnummers aan om ongeveer één cel per objectief veld te zien met een 40x objectief objectief.</li>
		<li>Parfuseer de NADH-vrije CA2 +-vrije oplossing bij 37 °c.</li>
		<li>Na het targeten van cel meet u de celvrije achtergrond en het celgebied zoals weergegeven in paragraaf 4,1. Bereken de celachtergrond uit het celgebied. Opmerking: beide achtergrond signalen moeten in elk experiment worden gecorrigeerd.</li>
		<li>Parfuseer de saponine oplossing voor 60 s en keer terug naar de NADH-vrije CA2 +-vrije oplossing.</li>
		<li>Meet Fura-2-FF-uitgezonden signalen bij 450 nm en 500 nm gelijktijdig door de excitatie scan van 350 nm naar 365 nm met de 0,1 nm-stap.</li>
		<li>Parfuseer de NADH-vrije CA2 +-verzadigde oplossing en herhaal stap 4.2.5.</li>
		<li>Aftrekken van de signalen in de CA2 +-verzadigde oplossing van de signalen in de CA2 +-vrije voorwaarden.</li>
		<li>Herhaal de procedures van 4.2.2 tot 4.2.7 met andere enkelvoudige cardiale myocyten. Opmerking: als de signaalintensiteit zwakker wordt, herhaalt u vanaf 4.2.1. Herhaal de procedure voor ten minste 5 verschillende cellen.</li>
		<li>Bereken vanaf alle verkregen signalen de standaarddeviaties van de emissie bij elke excitatie en kies de excitatie golflengte die de minimale standaarddeviatie (SD)-waarde als een isosbestic-punt weergeeft. Opmerking: de representatieve cijfers worden weergegeven in Figuur 2.</li>
	</ol></li>
	<li>De achtergrond Signaaldetectie en de correctiemethoden met het celgebied Opmerking: er zijn twee soorten achtergronden. Een komt uit de cellen en de andere komt van de reflectie op de cover slip (de cel-vrije achtergrond). Beide achtergronden moeten worden gecorrigeerd in elk experiment.<ol>
<li>Monteer de kleurstof vrije cellen in het bad op de Microscoop en wacht 3 minuten om de cellen naar de bodem te zinken. Perfuse NADH-gratis CA2 +-gratis oplossing voor ongeveer 5 minuten. Opmerking: alle perfusie snelheid van de oplossing is 2-3 mL/min bij 37 °C. Opmerking: pas de celnummers aan om ongeveer één cel per objectief veld te zien met een 40x objectief objectief.</li>
		<li>Stel het veldobject in om de beoogde cel te bedekken.</li>
		<li>Nadat u de cel uit het veld hebt verplaatst, meet u de achtergrond signalen van het cel-vrije venster en stelt u deze in als offsets. Opmerking: het signaal betekent dat het lichtsignaal in het foon telsysteem wordt gedetecteerd.</li>
		<li>Retourneer de cel naar de oorspronkelijke positie en meet de celachtergrond signalen en het celgebied. Opmerking: Hoewel het excitatie lampje met het band pass filter wordt gefilterd, bevat het nog steeds een vrij grote hoeveelheid gefilterd licht. Dit licht wordt gedispergeerd bij het raken van de cellen en veroorzaakt een aanzienlijk achtergrond signaal, omdat het telsysteem van foton zeer gevoelig is. Het moet worden gecorrigeerd. Opmerking: het celgebied kan worden berekend met een vastgelegde celafbeelding en een beschikbare beeldvormings software. De eenheid van het celgebied kan elke eenheid zijn, inclusief het aantal pixels. Alleen standaardisatie is noodzakelijk.</li>
		<li>Herhaal van 4.1.1 tot 4.1.4 gedurende 10 keer om de relatie tussen het celgebied en de achtergrond signalen van de cel te verkrijgen. Notes: later kunnen de celachtergrond signalen worden berekend op basis van het celgebied van de relatie. Aangezien de excitatie gloeilamp veroudert, moet deze procedure worden herhaald, tenminste, elke maand.</li>
	</ol></li>
	<li>Meting van R-factoren<ol>
<li>Bereken RF met de vergelijking 4 van de signalen verkregen in punt 4,2.</li>
		<li>Monteer de kleurstof vrije cellen op de Microscoop en parfumeer de CA2 +-vrije oplossing.</li>
		<li>Meet de signalen zoals F361, 450, nadh, f400, 500, NADH, f361, 450, NADH, en f353, 500, NADH.</li>
		<li>Parfumeer de malaat oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen.</li>
		<li>Parfumeer de pyruvaat oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen.</li>
		<li>Parfuseer de Malate-pyruvate oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen.</li>
		<li>Parfuseer de rotenon-oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen. Opmerking: het voorbeeld van het NADH-signaal opgenomen op 5 mm pyruvate, 5 mm malaat plus 5 mm pyruvate en 10 μM rotenon-toevoeging wordt weergegeven in Figuur 3.</li>
		<li>Bereken elke helling van F361, 450, nadh vs. f400, 500, NADH en f361, 450, NADH vs. f353, 500, NADH. Zoals weergegeven in Figuur 3. Elke helling geeft RN1 en rN2aan.</li>
	</ol></li>
</ol>5. selectie van de excitatie en het emissie licht voor TMRE of Carboxy-SNARF-1
<ol><li>Als ook TMRE voor het meten van het mitochondriale potentieel werd gebruikt, gebruik maken van de 530 nm excitatie golflengte en de 590 nm emissie golflengte.</li>
	<li>Als Carboxy-SNARF-1 voor het meten van het mitochondriale potentieel werd gebruikt in aanvulling, gebruik maken van de excitatie golflengte van 540 nm en emissie golflengten van 590 nm en 640 nm12.</li>
</ol>6. selectie van de Kd -waarde van Fura-2-FF
<ol><li>De verandering van pH kan invloed hebben op Kd -waarden voor CA2 + binding op FURA-2-FF10. Gebruik de Kd -waarde van 5,28 bij pH 7,5 voor de mitochondriën.</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).</li>
<li>Miyata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+free+Ca2%2B+concentration+in+living+single+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).</li>
<li>Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loading+of+fura-2+into+mitochondria+in+the+intact+perfused+rat+heart+and+its+use+to+estimate+matrix+Ca2%2B+under+various+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).</li>
<li>Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate+metabolism+in+the+perfused+heart+and+isolated+heart+mitochondria+and+its+role+in+regulation+of+mitochondrial+function+by+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium.</a> Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).</li>
<li>Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interrelations+between+the+transport+of+sodium+and+calcium+in+mitochondria+of+various+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues.</a> European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).</li>
<li>Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+ratio+studies+of+mitochondria+in+freeze-trapped+samples.+NADH+and+flavoprotein+fluorescence+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals.</a> The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).</li>
<li>Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+spectroscopy+and+imaging+of+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes.</a> Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).</li>
<li>Brandes, R., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurements+of+mitochondrial+NADH+and+Ca%282%2B%29+during+increased+work+in+intact+rat+heart+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae.</a> Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).</li>
<li>Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+coupling+between+mitochondrial+substrate+dehydrogenation+and+cardiac+workload+in+single+guinea-pig+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes.</a> Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).</li>
<li>Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Nicotinamide+Adenine+Dinucleotide+Correction+Method+for+Mitochondrial+Ca2%2B+Measurement+with+FURA-2-FF+in+Single+Permeabilized+Ventricular+Myocytes+of+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat.</a> Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).</li>
<li>Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+individual+cells+isolated+from+adult+rat+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium.</a> Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).</li>
<li>Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride-dependent+acid+loader+in+the+guinea-pig+ventricular+myocyte%3A+part+of+a+dual+acid-loading+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism.</a> Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).</li>
<li>Page, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ultrastructural+analysis+in+cardiac+membrane+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology.</a> American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).</li>
<li>Page, E., McCallister, L. P., Power, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterological+measurements+of+cardiac+ultrastructures+implicated+in+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

De storings correctiemethode werd met succes ontwikkeld voor het meten van de signalen van NADH en Fura-2 analogen. Exacte meting van de signalen is essentieel voor exacte correctie. De inherente aard van het fluorescerende apparaat produceert echter een achtergrond signaal dat geen verband houdt met dat van NADH van Fura-2. De hoogste kwaliteit band-pass filter kan alleen passeren tot 10− 8 van de ongewenste golflengten van het licht. Het fluorescerende signaal van een enkele cel is echter erg klein, en de re...

De belangrijke rol van intracellulaire CA2 + is algemeen bekend1. De kwantificering van [CA2 +] is essentieel om de processen van de cellulaire fysiologische functies te begrijpen. Fura-2-analogen zijn zeer nuttig omdat ze enthousiast zijn in het UV-bereik (< 400 nm), en de ratiometrische methode kan worden toegepast voor de kwantitatieve meting. Daarom kunnen andere fysiologische parameters zoals pH, membraanpotentiaal, enz., worden gemeten met andere fluorescerende kleurstoffen. De mitochondriale CA2 + concentratie ([CA. 2 +]m) was naar verluidt 0,08 − 20μM 2,3,4,5. Bij Fura-2-analogen is Fura-2-FF geschikt voor het meten van dit bereik van [CA2 +]. Echter, de levende cellen bevatten helaas NADH/NADPH voor hun metabole processen, en NADH genereert signaalinterferentie vanwege de overlappende excitatie en emissiespectra met de Fura-2 analoog. Deze interferentie beperkt het gebruik van Fura-2-analogen sterk. Specifiek, als de analoge wordt toegepast om te meten mitochondriale [CA2 +], deze interferentie is het grootste obstakel, omdat de hoogste hoeveelheid NADH in de mitochondriën. Dit wordt verder bemoeilijkt door NADH veranderingen gerelateerd aan het Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψm) en de verandering van Ψm beïnvloedt [CA2 +]m6,7,8 , 9. Bovendien is het voor het bestuderen van [CA2 +]m dynamiek essentieel om de status van andere mitochondriale parameters te kennen, zoals NADH, Ψmen Ph.
De emissies bij 450 nm en 500 nm met excitaties bij 353 nm, 361 nm en 400 nm bevatten de signalen van NADH en Fura-2-FF, en de vergelijkingen zijn als volgt. Hierin zijn 353 nm en 361 nm de isosbestic punten van Fura-2-FF voor emissies bij 450 nm en bij respectievelijk 500 nm.
F361.450 = f361450, NADH + f361450, Fura vergelijking 1 F353.500 = f353500, NADH + f353500, Fura vergelijking 2 F400.500 = f400500, NADH + f400500, Fura vergelijking 3
waar Fx, y de gemeten emissie-intensiteit is bij y-nm door x-nm excitatie, fx, y, is NADH de zuivere NADH-afhankelijke emissie-intensiteit, en Fx, y, Fura vertegenwoordigt de zuivere Fura-2-FF-afhankelijke emissie-intensiteit. Onder dezelfde concentratie van de fluorescerende kleurstof moet een bepaalde excitatie intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. CA2 + en Fura-2 hadden geen invloed op de eigenschappen van NADH fluorescentie; Daarom was de verhouding van de emissie bij 450 nm en bij 500 nm van NADH constant bij elke excitatie golflengte. Dezelfde regel kan worden gebruikt voor Fura-2-FF op basis van de veronderstelling dat NADH of [CA2 +] heeft geen invloed op de emissie en excitatie spectra van Fura-2-FF. CA2 + veroorzaakte echter een spectrale verschuiving van de Fura-2-FF-emissie. Daarom, om het effect van CA2 +te verwijderen, moet isosbestic excitatie, die onafhankelijk is van CA2 +, worden gebruikt. Elke emissie golflengte (d.w.z. 450 nm en 500 nm) heeft een verschillend isosbestic punt, en uit onze experimentele opstelling werden 353 Nm bij 500 nm en 361 Nm bij 450 nm gekozen. Hieruit zijn de volgende vergelijkingen geldig10.
Rf = f361450, Fura/F353500, Fura vergelijking 4 RN1 = f400500, NADH/F361450, NADH vergelijking 5 RN2 = f353500, NADH/F361450, NADH vergelijking 6
Met deze constanten zijn de volgende vergelijkingen van (vergelijking 1) (vergelijking 2) en (vergelijking 3) geldig.
F361.450 = f361450, NADH + Rf × f353500, Fura vergelijking 7 F353.450 = RN2 × f361450, NADH + f353500, Fura vergelijking 8 F400.500 = RN1 × f361450, NADH + F400500, Fura vergelijking 9
Uit deze vergelijkingen, indien Rf, rN1en rN2 bekend zijn, kunnen zuivere signalen van NADH en Fura-2 als volgt worden verkregen.
F361450, NADH = (f361.450 -rf × f353.500)/(1 − rf × rN2) vergelijking 10 F353500, Fura = (rN2 × F361.450 − f353.500)/(rF × rN2 − 1) vergelijking 11 F400500, Fura = f400.500 − RN1 × f361450, NADH vergelijking 12 RFura = F353500, Fura/F400500, Fura vergelijking 13
De CA2 +-gebonden vorm van Fura-2-FF was praktisch niet-fluorescerend bij de 400 nm excitatie golflengte. Op basis van deze eigenschap kan de volgende nieuwe kalibratie vergelijking worden afgeleid.
[CA2 +] = Kd ∙ (F400500, Max/f353500, Max) × (RFura − rmin) vergelijking 14
waarbij Kd een dissociatieconstante is, F400500, Max en f353500, Max zijn de maximale waarden van de uitgestoten signalen bij 500 nm met excitaties bij respectievelijk 400 nm en 353 nm, en rmin is de minimale rFura in CA2 +-gratis conditie. Aangezien de isosbestic-excitaties werden gebruikt, kan de vergelijking als volgt verder worden vereenvoudigd.
[CA2 +] = Kd ∙ (1/Rmin) ∙ (rFura − Rmin) vergelijking 15
Daarom zijn alleen Kd -en Rmin -waarden vereist om [CA2 +] te berekenen.

<table><tbody><tr><td>2 mL eppendorf tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>2 mL Tube</td></tr><tr><td>AD/DA converter</td><td>Instrutech</td><td>ITC-18</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>ADP, Adenosine 5&prime;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A5285</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Band pass filter</td><td>Ealing Electro-Optics, Inc</td><td>35-3920</td><td>Equipment, 640&plusmn;11nm</td></tr><tr><td>Band pass filter</td><td>Omega Optical</td><td>690-9823</td><td>Equipment, 590&plusmn;15nm</td></tr><tr><td>Band pass filter</td><td>Omega Optical</td><td>500DF20-9916</td><td>Equipment, 500&plusmn;20nm</td></tr><tr><td>Band pass filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>60685</td><td>Equipment, 450&plusmn;30nm</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21114</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>carboxy-SNARF-1(AM)</td><td>Invitrogen</td><td>C1272</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Charge-coupled device (CCD) camera</td><td>Philips</td><td>FTM1800NH/HGI</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>86009</td><td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &lt;400nm, 490&plusmn;10, 560&plusmn;10, Transmission : 460&plusmn;15, 510&plusmn;20, >580nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>567DCXRU</td><td>Equipment, Reflection : &lt;560nm, Transmission : > 580 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>480dclp</td><td>Equipment, Reflection : &lt;470nm, Transmission : > 490 nm</td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>20728</td><td>Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : &lt;405nm, 470&plusmn;30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>154938</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>DMEM, Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D5030</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E4378</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21857</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>field diaphragm</td><td>Nikon</td><td>86506</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Fura-2-FF(AM)</td><td>TEFLABS</td><td>137</td><td>chemicals</td></tr><tr><td>Green tube</td><td>DWM</td><td></td><td>test tube</td></tr><tr><td>HEPES,&nbsp; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime;-(2-ethanesulfonic acid)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3375</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>High-speed counter</td><td>National Instruments</td><td>NI-6022</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Hot mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>21002</td><td>Equipment, 50:50</td></tr><tr><td>Inverted microscope </td><td>Nikon</td><td>TE-300</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Malate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>27606</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Near infrared filter </td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>D750/100X</td><td>Equipment, 750&plusmn;100nm</td></tr><tr><td>Oil immersion lens </td><td>Nikon</td><td>MRF01400</td><td>40x, NA 1.3; Equipment</td></tr><tr><td>Photon counter unit</td><td>Hamamatsu</td><td>C3866</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Photon multiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td>R2949</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Polychrome II</td><td>Till Photonics</td><td>SA3/MG04</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P4494</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>107360</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-aldrich</td><td>R8875</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S4521</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester </td><td>Molecular probes</td><td>T669</td><td>Chemicals</td></tr></tbody></table>

een roman nicotinamide adenine dinucleotide correctiemethode voor intracellulaire ca2 + meting met fura-2-analoog in levende cellen

A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Intracellular Ca2+ Measurement with Fura-2-Analog in Live Cells

Om [ca.2 +] kwantitatief te meten, worden Fura-2-analogen, die ratiometrische fluoroprobes zijn, vaak gebruikt. Het gebruik van de kleurstof is echter intrinsiek beperkt in levende cellen vanwege interferentie met autofluorescentie, voornamelijk van Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). Specifieker, dit is een groot obstakel bij het meten van de mitochondriale [CA2 +] kwantitatief met behulp van Fura-2 analogen omdat de meerderheid van NADH in de mitochondriën. Als de fluorescerende kleurstof concentratie hetzelfde is, moet een bepaalde excitatie-intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. Op basis van dit principe is een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie voor het meten van [CA2 +] ontwikkeld, en de werkelijke signaalintensiteit van NADH en Fura-2 kunnen worden verkregen. Verder werd een nieuwe vergelijking voor de berekening van [CA2 +] ontwikkeld met isosbestic excitatie of excitatie bij 400 nm. Met deze methode, veranderingen in de mitochondriale [CA2 +] kan met succes worden gemeten. Bovendien, met een andere set van de excitatie en emissie golflengten, meerdere parameters, met inbegrip van NADH, [CA2 +], en pH of Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψm), gelijktijdig kunnen worden gemeten. Mitochondriale [CA2 +] en Ψm of pH werden gemeten met behulp van FURA-2-FF en tetramethylrhodamine ethyl ester (tmre) of Carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (Carboxy-snarf-1).

Mitochondriale CA2 + wijzigingen als gevolg van correctie10 Figuur 4 toont de wijzigingen in [CA2 +]m voor en na de correctie. De resultaten toonden duidelijk de substantiële veranderingen in [ca.2 +]m. De mitochondriale rust calciumconcentratie zonder cytosolische CA2 + ([ca.2 +]c) was 1,03 ± 0,13 μm (gemiddelde ± 1g , n = 32), en het maximum [CA2 +] m bij[ca.</su...

Vanwege de spectrale overlapping van de excitatie-en emissie golflengten van NADH en Fura-2-analogen, is de signaalstoring van beide chemicaliën in levende cellen onvermijdelijk tijdens de kwantitatieve meting van [ca.2 +]. Zo werd een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie op maat [CA2 +] ontwikkeld.

Een roman Nicotinamide adenine dinucleotide correctiemethode voor intracellulaire CA2 + meting met Fura-2-analoog in levende cellen

To measure [Ca2+] quantitatively, fura-2 analogs, which are ratiometric fluoroprobes, are frequently used. However, dye usage is intrinsically limited in ...

UV prikkelbare meervoudsondes, hebben een inherente signaalverontreiniging, vanwege de auto-meervoud geluiden. Het grootste deel van het probleem met NADH, is het beperken van het gebruik van een meervoud sonde. Een methode kan worden gebruikt om de buitenste florescentie van NADH nauwkeurig te corrigeren, om een echt, niet-verontreinigd meervoudsondesignaal te extraheren.Het aantonen van de procedure zal Jeong Hoon Lee zijn, onze assistent-professor in mijn laboratorium. Nadat de myocyten zich op de bodem van de buis hebben laten vestigen, wordt de supernatant aangezogen. Label de cellen met twee milliliter vers bereide een millimolar fura-2-FFAM verdunningsoplossing gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius.Plaats de buis aan het einde van de incubatie in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten rechtop voordat u de supernatant verwijdert. Voeg vervolgens vier milliliter kamertemperatuur cultuur medium voor opslag bij kamertemperatuur. Voor in situ isobestische fura-2-ffa punt identificatie mount de verdunde cellen op de microscoop stadium en wacht drie minuten voor de cellen te zinken naar de bodem.Profuse NADH-vrije 37 graden Celsius calciumvrije oplossing in de celcultuur en zoek een doelcel. Overvloedige saponineoplossing gedurende 60 seconden voordat u opnieuw profusing met de NADH-vrije calciumvrije oplossing. Meet tegelijkertijd de fura-2-ff uitgezonden signalen op 450 en 500 nanometer, met behulp van een excitatiescan van 350 tot 365 nanometer met een stap van 0,1 nanometer en opnieuw te overmatigen met NADH-vrije calciumvrije oplossing.Trek vervolgens de signalen in de calciumverzadigde oplossing af van de signalen in de calciumvrije omstandigheden. Bereken vervolgens de standaarddeviaties van de emissie bij elke excitatie en selecteer de excitatiegolflengte met de minimale standaarddeviatiewaarden als afzonderlijke isobestische punten. Om een multi-parametrisch meetsysteem te gebruiken om het achtergrondsignaal te detecteren en het signaal binnen het celgebied te corrigeren, monteer je kleurstofvrije cellen in het microscoopbad en laat je de cellen drie minuten vestigen.Profuse NADH calcium-vrije oplossing in het bad voor ongeveer vijf minuten op een twee tot drie milliliter per minuut tarief en stel het object veld om de beoogde cel te dekken. Na het verplaatsen van de cel uit het veld meten de achtergrondsignalen van de cel-vrij venster en stel de signalen als verschuivingen. Breng vervolgens de cel terug naar de oorspronkelijke positie en meet de achtergrondsignalen van de cel en het celgebied.Om de R-factor te berekenen gebruik maken van de verworven cel achtergrond en gebied signalen voor het opnieuw monteren van de kleurstof-vrije cellen op de microscoop en profusing met calcium-vrije oplossing. Meet de signalen zoals aangegeven voordat de celsuspensie wordt uitgemaakt met malateoplossing. Na het meten van de signalen overvloedig de cellen met pyruvaat oplossing gevolgd door overvloed met malate-pyruvaat oplossing en rotenone oplossing.Bereken vervolgens de helling voor elk signaal. Hier worden de veranderingen in mitochondriaal calcium voor en na de correctie getoond. De resultaten tonen duidelijk aanzienlijke veranderingen in het mitochondriale calcium met een mitochondriale rustende calciumconcentratie zonder cytosolische calcium van 1,03 plus of min 0,13 micromolar en maximaal mitochondriaal calcium bij één micromolar calcium van 29,6 plus of min 1,61 micromolar.Het mitochondriale transmembranepotentieel werd gemonitord met een overvloed aan twee nanomolars TMRE. De verandering in het mitochondriale potentieel werd berekend op basis van een veronderstelde initiële mitochondriale membraanpotentieel van min 150 millivolt, wat een afname van nadh in reactie op calciumtoevoeging aantoonde, met een negbaar effect op het mitochondriale membraanpotentieel. De mitochonddirale pH werd niet uitgevoerd door de toename van mitochondriaal calcium veroorzaakt door carboxy SNARF-1 laden.Onjuiste isobestische punten resulteren in onjuiste R- en NADH-correctie. Zorg er dus voor dat je altijd de celvrije achtergrond en het celgebied correct meet. Deze techniek wordt gebruikt om mitochondriale calcium dynamische studies in de bioanalytische morsen bereid.

a-novel-nicotinamide-adenine-dinucleotide-correction-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Calcium-signalen spelen een belangrijke rol in vele cellulaire processen zoals genexpressie, overleving en differentiatie. Hier laten we zien hoe calcium beeldvorming met behulp van Fura-2 AM uit te voeren. Calcium beeldvorming is een waardevol instrument om de regulering van intracellulair calcium in real time en de regulering van de signaaltransductie cascades studie.

Calcium beeldvorming van corticale neuronen met behulp van Fura-2 AM

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

This video describes a confocal microscopy imaging-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in cultured cells. The assay uses the calcium-sensitive fluorescent dye Rhod-2/AM to measure the mitochondrial calcium in permeabilized cultured cells.

Calcium Influx Assay to Measure Mitochondrial Calcium Uptake in Cultured Cells

Procedures worden beschreven om gelijktijdige opnamen van membraanpotentiaal of stroom en veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie uit te voeren. Suprachiasmatische nucleus-neuronen worden gevuld met de calciumindicator bis-fura-2 met behulp van een patch clamp-elektrode in de whole cell patch clamp-configuratie.

Gelijktijdige elektrofysiologisch registratie en calciumbeeldvorming van neuronen in de suprachiasmatische kern

Dit document beschrijft een protocol dat de veranderingen in de myofilament Ca2+ gevoeligheid tijdens contractie in geïsoleerde hartspiercellen van rattenhart beoordeelt. Samen met cardiale elektrofysiologie, systolische/diastolische cytosol Ca2+ niveaus en contractie/relaxatie, is deze meting onmisbaar voor het onderbouwen van de mechanismen die de excitatie-contractiekoppeling in gezonde en zieke harten mediëren.

Beoordeling van Myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Celcalciumbeeldvorming is een veelzijdige methodologie om dynamische signalering van individuele cellen te bestuderen, op gemengde populaties in cultuur of zelfs op ontwaakte dieren, gebaseerd op de expressie van calciumdoorlatende kanalen / receptoren die unieke functionele handtekeningen geven.

Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.

Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten

Dit protocol beschrijft een methode om tegelijkertijd cytosolisch, vrij calcium [Ca2+]i en vaatdiameter in samentrekkende lymfevaten in realtime te meten en vervolgens absolute Ca2+- concentraties te berekenen, evenals contractiliteits-/ritmiekparameters. Dit protocol kan worden gebruikt om Ca2+ en contractiele dynamiek te bestuderen in verschillende experimentele omstandigheden.

Real-time evaluatie van absolute, cytosolische, vrije Ca2+ en overeenkomstige contractiliteit in geïsoleerde, onder druk staande lymfevaten

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Leer een nieuwe NADH-correctiemethode voor accurate calciummeting met fura-2-analoog in levende myocyten. Deze techniek verbetert fluorescentiemicroscopie door signaalvervuiling te elimineren.

Een roman Nicotinamide adenine dinucleotide correctiemethode voor intracellulaire CA2 + meting met Fura-2-analoog in levende cellen (Video) | JoVE Journal

Een roman Nicotinamide adenine dinucleotide correctiemethode voor intracellulaire CA^{2 +} meting met Fura-2-analoog in levende cellen

Meer video's verkennen