Synthese van een Deuterated norm voor de kwantificering van 2-arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Endocannabinoïden zijn geconserveerde lipidemedia mediators die meerdere biologische processen in een verscheidenheid van organismen reguleren. De eerste ontdekte endocannabinoïden zijn anandamide en 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. De nematode C.elegans is een krachtig diermodel om een grote verscheidenheid aan biologische processen te bestuderen.

Onlangs ontdekten we dat 2-AG een fundamentele rol speelt bij de regulering van de cholesterolhandel in C.elegans. Daarom werd het noodzakelijk om een methode te ontwerpen en te optimaliseren om endogene 2-AG te bestuderen door detectie en kwantificering in C.elegans. Eerder gerapporteerde analysemethoden voor het kwantificeren van 2-AG in biologische monsters omvatten meestal het gebruik van gedeuterde normen die commercieel zijn verworven, zijn vereist om ze beschikbaar te hebben voor aankoop.

Niettemin, ze zijn duur, en als gevolg van de aanwezigheid van meerdere dubbele obligaties, zijn gevoelig voor geoxideerd na verloop van tijd. De meest voorkomende versie van de normen zijn gebaseerd op de octadeuterated arachidonic zuur geschikt is voor kwantificering door isotoop verdunning, door vloeibare chromatografie, en achterste massa spectroscopie. Om de moeilijkheden in verband met de kosten en stabiliteit van de gedeuterated normen om 2-AG te kwantificeren te overwinnen, gebruikten we een handige en eenvoudige methode om een analytische standaard op basis van deuterium-5-glycerol voor te bereiden.

De volgorde voor de voorbereiding van de pendeuterated standaard vereist een procedure van drie stappen. Mogelijk worden gehouden in de beschermde vorm totdat het nodig is. Het belangrijkste doel van dit werk is om een volledige methode te tonen om 2-AG in C.elegans te bestuderen van de synthese van de analytische deuterated standaard tot de voorbereiding en extractie van de nematodemonsters en ten slotte de analyse door vloeibare chromatografie en massaspectroscopie.

Voor het verkrijgen van deuterated 1-AG als een deuterated interne standaard voor kwantificering testen volgen een drie stappen protocol. Om alleen primaire alcoholen te beschermen, voeg eerst 38 milligram glycerol deuterated aan een 10 milliliter reactiebuis met behulp van een Pasteur pipet en voeg een magnetische roerder. Voeg vervolgens vijf milliliter watervrije DCM toe met een Hamilton-spuit van vijf milliliter en vul de buis met droge stikstof om een inerte atmosfeer te geven.

Bereid een bad met behulp van een ondiepe Dewar fles gevuld met gedestilleerd ethylacetaat. Vul de hermetisch gesloten reactiebuis in het bad en koel deze af door langzaam de toevoeging van vloeibare stikstof aan ethylacetaat toe te voegen totdat het oplosmiddel is bevroren. Let op, vloeistof kookt hevig bij kamertemperatuur en kan ernstige brandwonden veroorzaken bij contact met ogen en huid.

Voeg vervolgens 54 milligram watervrije collidine toe met behulp van een Hamilton spuit. Let op, collidine is vluchtig en heeft een zeer sterke en onaangename geur. Bij 70 milligram terbutile-dimethyl-cetylchloride en roer alles gedurende drie uur bij min 78 graden op een magnetische roerder.

Voeg twee milliliter pekel toe om de reactie te doven. Haal de oplossing met twee milliliter gedistilleerd dichloormethaan drie keer met behulp van een gescheiden trechter houden van de organische extracten elke keer. Combineer vervolgens de drie organische extracten en droog over natriumsulfaat.

Zuiver het ruwe mengsel door kolomchromatografie met silicagel als de stationaire fase en een 10% toenemende hexaan ethylacetaat gradiënt vanaf 100% hexaan en afwerking met 100% ethylacetaat. Voor deze esterificatiestap voegt u 10 milligram van het product toe die eerder aan een 10 milliliter reactiebuis is vermeld met behulp van een Pasteur pippette en voeg een magnetische roerder toe. Voeg twee milliliter watervrije DCM met behulp van een vijf milliliter Hamilton spuit en vul de buis met droge stikstof om een inerte atmosfeer te geven.

Koel de oplossing tot nul graden met behulp van een ijsbad. Advertentie 36 milligram arachidonic zuur met behulp van een multi-volume verstelbare micropipet en roer. Voeg vervolgens 15 milligram 40-methyl-aminopyridine toe en roer.

Voeg 15 milligram diacylpropylcarbodiimid toe met behulp van een multi-volume verstelbare micropipet en roer. Voeg twee milliliter water toe om de reactie te blussen en haal de oplossing vervolgens drie keer met twee milliliter gedestilleerde DCM uit met behulp van een scheidingstrechter. Combineer de drie organische extracten en droog over natriumsulfaat, zuiver het ruwe mengsel door kolomchromatografie met behulp van silica gel als een stationaire fase een dan 10% toenemende hexaan ethylacetaat gradiënt vanaf 100%hexaan en afwerking met 50 50%hexaan ethylacetaat.

Tot slot, voor de deprotectie stap, voeg 15 milligram van het eerder gesynthetiseerde product aan een 10 milliliter reactiebuis met behulp van een Pasteur pipet en voeg een magnetische roerder. Voeg twee milliliter watervrije tetrahydrofuran toe met behulp van een Hamilton-spuit van vijf milliliter en vul de buis met droge stikstof om een inerte atmosfeer te geven. Koel vervolgens de oplossing af tot nul graden met behulp van een ijsbad.

Voeg 150 microliters drop-wise van een molaire oplossing van tetrabutylammonium fluoride in THF met behulp van een Hamilton spuit. Voeg na een uur twee milliliter water toe om de reactie te doven. Haal de oplossing met twee milliliter gedestilleerde DCM drie keer met behulp van een scheidingstrechter.

Combineer de drie organische extracten en droog over natriumsulfaat. Voor de bleekprocedure, draai wormen op gezaaide zes centimeter NGM platen. Laat de worm groeien van twee tot drie dagen, zodat er veel eieren en gravid volwassenen op het bord.

Zodra u veel eieren en volwassenen, giet vijf milliliter M9 op het bord. Met behulp van een glazen pipet, breng de wormen naar een 15 milliliter valk buis. Centrifuge de buis gedurende twee minuten op 2,000 G en pellet de wormen.

Zuig het grootste deel van de M9 zonder de worm pellet te verstoren. Voeg drie milliliter bleekoplossing toe en meng de oplossing voorzichtig door ongeveer vijf minuten om te keren of totdat u een afname van het aantal intacte volwassen wormen ziet. Zodra de meeste lichamen zijn opgelost, centrifuge op 2,000 G gedurende een minuut.

Zuig het grootste deel van de bleekoplossing zonder de wormpellet te verstoren. Voeg 15 milliliter M9 toe aan de buis en meng goed. Centrifuge weer op 2.000 G voor een minuut.

Zuig het grootste deel van de M9 zonder de worm pellet te verstoren. Voor worm monster voorbereiding, laat N2 embryo's verkregen door bleken procedure had in 's nachts in M9 buffer op 20 graden. Oogst vervolgens gesynchroniseerde L1's door de buis twee minuten te centrifugeren op 2.000 G.Was de wormen nog een keer met M9-buffer en kwantificeer het aantal levende L1. Zaad ongeveer 10.000 wormen in NGM-platen met een milliliter OP 50 Escherichia coli eerder gedroogd.

Broed de platen minstens 48 uur bij 20 graden tot de wormen het L4-stadium bereiken. Oogst de wormen met behulp van koude M9 buffer in een 50 milliliter valk buis. Was ze nog een keer en breng ze in een 1,5 milliliter buis.

Pellet de wormen door centrifugatie op 2,000 G gedurende een minuut. Elimineer het grootste deel van de supernatant. Dompelen vervolgens de buis onder in vloeibare stikstof en roer bij min 80 graden.

Ontdooi ongeveer 100 microliter bevroren wormpellets die behoren tot N2 en voeg vervolgens 1,3 milliliter methanol toe. Daarna, sonicate het monster voor vier minuten. Voeg na sonicatie 1.000 ppb van de interne deuterated norm, 2,6 milliliter chloroform en 1,3 milliliter van 0,5 molair kaliumchloride, 0,08 molar fosforzuur toe aan een definitieve verhouding van één op één.

Vortex de monsters voor een minuut en vervolgens sonicate ze in een ultrasoon waterbad voor 15 minuten op ijs. Vortex de monsters opnieuw twee keer gedurende een minuut en centrifugeren ze gedurende 10 minuten op 2,000 G om fasescheiding te induceren. Verzamel de onderste fase in een schone glazen buis, droog het onder stikstof, en resuspend het in 100 microliter van acetonitril.

Om een succesvolle kwantificering van de endogene 2-AG te bereiken, was het noodzakelijk om het verzadigde analoge te synthetiseren met behulp van een driestapsmethode. Daarna werd het toegevoegd aan wormmonsters, geëxtraheerd en geanalyseerd door hoogwaardige vloeibare chromatografie, gekoppeld aan massaspectrometrie. Gebruikt als een interne standaard, de synthetische deuterated 1-AG was het instrument om de endogene metaboliet kwantificeren.

De methode werd geoptimaliseerd met behulp van de overgangen voor 2-AG en voor deuterated 1-AG waar glycerol moleculen verloren gaan. 2-AG endogene uit de C.elegans monsters werd met succes gedetecteerd en gekwantificeerd door isotopenverdunning met de chemisch gesynthetiseerde gedeuteriseerde 1-AG met behulp van high performance vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Monster één werd bereid met de deuterated standaard 1-AG, terwijl monster twee zonder de norm.

Aangezien de oorspronkelijke concentratie van de standaard in monster één en drie van 1,000 ppb per stuk bedroeg, is het uit de piekareaalverhouding mogelijk om de endogene concentratie van 2-AG te berekenen in het monster van 340 ppb voor monster één en 360 ppb voor monster drie, wat een gemiddelde van 350 ppb geeft. De verhoudingen werden berekend als een kwaliteit tussen de piekgebieden van respectievelijk 2-AG en dedeuterated 1-AG voor twee geïsoleerde monsters. Beide met de deuterated standaard toegevoegd voorafgaand aan de extractie.

Gezien het onlangs ontdekte belang van 2-AG in de verbetering van de cholesterolhandel en het gebrek aan informatie over hoe lipiden dat proces beïnvloeden, was het noodzakelijk een betrouwbare detectiemethode voor deze endocannabinoïde. De succesvolle ontwikkeling van een eenvoudige en robuuste synthetische methode die hier wordt gerapporteerd om deuterated analoge 2-AG te verkrijgen was een belangrijke stap van dit protocol. De meeste van de gerapporteerde methoden voor het kwantificeren van monoacylglycerols omvatten het gebruik van commercieel beschikbare analytische normen, die meestal duur en instabiel zijn onder reguliere opslagomstandigheden, waardoor ze onbereikbaar zijn voor laboratoria met een lager budget.

Deze methode lost dit echter op door een synthese van de standaard voor te stellen met behulp van meer toegankelijke uitgangsmaterialen. De synthetische methode is rechttoe rechtaan zonder geavanceerde omstandigheden nodig, waardoor het ideaal is om te worden uitgevoerd in elk laboratorium met minimale apparatuur en toegang tot reactanten, zelfs in een beperkt budget. Samengevat beschrijft deze nieuwe procedure een rechttoe rechtaan en reproduceerbare manier om 2-AG op te sporen en te kwantificeren, die zal helpen om een aantal van de vragen te beantwoorden die naar aanleiding van de beschrijving van de rol van deze endocannabinoïden bij de cholesterolhandel in C.elegans worden gesteld.