Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils
September 28th, 2019
Hier is een protocol voor het onderzoek van de interacties tussen inheemse vorm, prefibrillar, en volwassen amyloïde fibrillen van verschillende peptiden en eiwitten met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels en verschillende gebieden van de hersenen.
In deze video beschrijven we een modelstudie voor het mechanisme van amyloïde toxiciteit op membraanniveau met behulp van rattenhersenmitochondriën als een in vitro biologisch model. Ondanks het accumuleren van rapport beschrijft mechanisme van membraan verstoringen door amyloïde aggregaat in fosfolipid model systemen onderzocht rechtstreeks gericht op de gebeurtenissen die beginnen bij de ontwikkeling van biologisch membraan. In de huidige video beschrijven we amyloïde fibrils van alfa-synuclein die het ratzwantantiochonmembraan analyseren als een in vitro biologisch model.
Wij geloven dat mitochondriën als organezel met goed gekarakteriseerde membranen een uiterst nuttig biologisch modelsysteem kunnen bieden voor moleculaire studies met betrekking tot het mechanisme van amyloïde cytotoxiciteit op membraanniveau met betrekking tot neurodegeneratieve ziekten. Onthoofd de rat met een klein dier guillotine en verwijder de hersenen van de schaal binnen een minuut na de onthoofding van de rat om mogelijke verslechtering van mitochondriale eigenschappen te beperken. Het is belangrijk om snel te werken en alles in de loop van de procedure op ijs te houden.
Was het weefsel twee keer met 30 milliliter isolatiebuffer. Breng over op een beker met koude isolatiebuffer en maak fijn gehakt van de hersenen met een schaar. Breng de weefselsuspensie over naar een 20 milliliter koude dounce homogenisator.
Homogenize het weefsel stukken met behulp van negen op en neer slagen met een gemotoriseerde stamper. Laat het mengsel ongeveer 30 seconden op ijs na elke set van drie homogenisatieslagen om ervoor te zorgen dat het homogenaat koud blijft. Breng het homogenaat over op een voorgekoelde centrifugebuis en centrifuge bij 1, 300 G bij vier Centigrade gedurende drie minuten.
Decanteer de supernatant voorzichtig en breng het over naar een voorgekoelde centrifugebuis. Centrifuge op 21.000 G bij vier Centigrade gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verhoog de pellet in een dichtheidsgradiënt medium door het mengsel voorzichtig met de pipet te roeren.
Centrifuge in een vaste hoek rotor op 30, 700 G bij vier Centigrade gedurende vijf minuten. Verwijder met behulp van een Pasteur pipet het scherpe uiteinde van het aan de bovenkant opgehoopte materiaal, dat meestal myeline bevat. Voeg acht milliliter isolatiebuffer toe aan de mitochondriale fractie terwijl u het mengsel voorzichtig roert met de pipet.
Centrifuge op 16, 700 G bij vier Centigrade gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant, waardoor de onderste losse pellet ongestoord. Voeg een milliliter 10 milligram per milliliter vetzuurvrije BSA toe aan de centrifugebuis terwijl u het mengsel voorzichtig roert met de punt van de pipet.
Maak het volume tot vijf milliliter door isolatiebuffer toe te voegen. Centrifuge op 6, 900 G op vier Centigrade gedurende 10 minuten. Dit moet een stevige pellet produceren.
Decanteer de supernatant en resuspend de mitochondriale pellet in isolatiebuffer. Verdun mitochondriaal homogenaat tot één milligram per milliliter met koude isolatiebuffer en plaats in twee buizen van 1,5 milliliter, meestal 195 microliter mitochondriën per buis. Voeg vijf microliter 20% volume per volume Triton X-100 toe aan de ene buis als positieve controle voor maximale enzymactiviteit en vijf microliter gedeïsoniseerd water aan een andere buis voor controle, gevolgd door het mengen met een roerder.
Broed de buizen gedurende 10 minuten in warm water bad ingesteld op 30 Centigrade. Pellet mitochondriën door centrifugatie van buizen in een vaste hoek rotor op 16, 000 G vier Centigrade gedurende 15 minuten. Verzamel zorgvuldig resulterende supernatants voor het beoordelen van de activiteit van mitochondriale malate dehydrogenase met behulp van een standaard spectrofotometrische test beschreven op het volgende deel.
Bereken de integriteit van het mitochondriale membraan als volgt. Voor de bepaling van malate dehydrogenaseactiviteit, pipet 890 en 880 microliter 50 millimolar Tris-HCL buffer tot blanco en monster test cuvettes respectievelijk gevolgd door 100 microliter 50 millimolar oxaloacetaat en 10 microliter van 10 millimolar beta-NADH. Zet de cuvettes in een spectrofotometer en referentie tegen blanco.
Voeg 10 microliter mitochondriaal homogenaat een milligram per milliliter toe om cuvette te proeven. Meng onmiddellijk door inversie. Record afname van de absorptie als gevolg van NADH oxidatie op 340 nanometer gedurende een minuut.
Voor alpha-synuclein amyloïde fibrillatie, voeg 294 microliter eiwitoplossing, 200 micromolar aan elke 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens zes microliter ThT oplossing een millimolar. Meng de oplossingen en ontcubeer de buizen in een thermomixer bij 37 Graden celsius onder constant roeren bij 800 RPM.
Voeg voor boviene insuline amyloïde fibrillatie 637 microliter eiwitoplossing, 250 micromolar aan 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens 13 microliter ThT oplossing een millimolar, gevolgd door roeren. Voeg aliquots 200 microliter eiwitoplossingen toe aan elke put van een duidelijke bodem 96-put plaat.
Verzegel de plaat met kristalheldere afdichtingstape. Laad de plaat in Cytation 5 fluorescentieplaatlezer. Meet ThT fluorescentie met intervallen van 30 minuten gedurende 12 uur.
Gebruik excitatie op 440 nanometer en emissie op 485 nanometer. Selecteer de putten. Schud de plaat vijf seconden voor elke meting.
Stel de temperatuur in op 57 Graden Celsius zonder agitatie. Bereid twee series van 1,5 milliliter buizen met mitochondriale homogenaten, een serie voor MDH release assay en andere voor mitochondriale ROS-meting. Voeg aliquots verse of amyloïde fibrils alfa-synuclein, runder insuline of kippeneiwit lysozyme toe aan mitochondriaal homogenaat, gevolgd door zachtjes pipetten.
Incubeerbuizen met mitochondriale suspensies gedurende 30 minuten in warm water bad ingesteld op 30 Centigrade. Voor malate dehydrogenase release test, centrifuge geïncubeerde mitochondriale homogenates op 16,000 G gedurende 15 minuten. Verzamel zorgvuldig resulterende supernatants voor het testen van de activiteit van mitochondriale MDH zoals beschreven op protocolsectie deel vier.
Bereken de release van MDH als volgt. Voor mitochondriale ROS-meting, pipet 191 microliter van geïncubeerde mitochondriale homogenaat aan elke put van een 96-put plaat. Voeg vier microliter van 50 micromolar DCFDA toe.
Voeg vervolgens vijf microliter van 200 millimolar succinate. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in warm water bad ingesteld op 30 Centigrade terwijl zachtjes roeren. Laad de plaat in een Cytation 5 fluorescentieplaatlezer en meet de fluorescentieintensiteit volgens de protocolsectie.
Mitochondriale membraanintegriteit werd beoordeeld door de MDH-activiteit in de geïsoleerde mitochondriën voor en na membraanverstoring en enzymafgifte door Triton X-100 te meten. Zoals u ziet, vonden we meestal dat mitochondriale preparaten zijn ongeveer 93% intact. ThT fluorescentietest werd uitgevoerd om de groei van amyloïde fibrils te monitoren.
De curve voor amyloïde fibrillatie van drie eiwitten toonde een typisch sigmoïdaal patroon, dat op ongeveer 96, 12 en 96 uur naar een plateau reikte voor respectievelijk alfa-synuclein, runder insuline en kippeneiwit lysozyme, wat suggereert dat amyloïde fibrils meer werden bevestigd door de AFM-meting. Mogelijke permeabilisatie en schade van mitochondriaal membraan door amyloïde fibrils werd onderzocht door het vrijkomen van mitochondriale MDH en mitochondriale ROS-meting. Zoals u ziet in de linker grafiek, aanzienlijke release van MDH werd waargenomen bij toevoeging van de alpha-synuclein amyloïde fibrils aan mitochondriën.
Terwijl een lichte afgifte werd gedetecteerd door insulinefibrils, bleken kippeneiwit lysozyme fibrils niet effectief te zijn. Rechter grafiek toont het effect van amyloïde fibrils op mitochondriale ROS-inhoud. Hoewel er geen significante verbetering in mitochondriale ROS werd waargenomen bij toevoeging van kippeneiwit lysozyme of insuline amyloïde fibrils, leidde de behandeling met alfa-synucleinfibrils tot een aanzienlijke toename van het ROS-gehalte van hersenmitochondriën.
De huidige video beschrijft een modelstudie voor het mechanisme van kuitbeenaggregaatcytotoxiciteit op membraanniveau, waaruit blijkt hoe amyloïde fibrils die voortvloeien uit verschillende eiwitten verschillende graden van membraanschade en permeabilisatie kunnen veroorzaken. Terwijl sommige onderwerpen van amyloïde fibrils en hun specifieke bindende membraan lijken te voorzien van de capaciteit om te interageren met en destabilisatie en daaropvolgende verstoringen van membranen veroorzaken. Na deze video u de interactie van inheemse vorm, prefibrilleren en volwassen amyloïde fibrils van verschillende peptiden en met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels of verschillende gebieden van de hersenen, onderzoeken.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol onderzoekt de interacties tussen amyloïde fibrillen en mitochondriën geïsoleerd uit verschillende hersenweefsels. Het richt zich op het mechanisme van amyloïde toxiciteit op membraanniveau met behulp van mitochondriën van rattenhersenen als in vitro model.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Neurodegeneratieve ziekten
Achtergrond
- Het is bekend dat amyloïde aggregaten biologische membranen verstoren.
- Het begrijpen van hun interactie met mitochondriën is cruciaal voor het bestuderen van neurodegeneratieve ziekten.
- De mitochondriën van rattenhersenen bieden een goed gekarakteriseerd model voor deze studies.
- Snelle isolatie van mitochondriën is essentieel om hun eigenschappen te behouden.
Doel van het onderzoek
- Om het mechanisme van amyloïde cytotoxiciteit op het mitochondriale membraan te onderzoeken.
- Om mitochondriën van rattenhersenen te gebruiken als biologisch model voor dit onderzoek.
- Om de effecten van verschillende amyloïde fibrillen op mitochondriale integriteit te analyseren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van mitochondriën uit rattenhersenweefsel.
- Analyse van amyloïde fibrillen van alpha-synucleïne.
- In vitro experimenten om membraanstoringen te beoordelen.
- Laag temperatuur behouden om mitochondriale verslechtering te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- Karakterisering van de effecten van amyloïde fibrillen op mitochondriale membranen.
- Bewijs van membraanstoringen veroorzaakt door amyloïde aggregaten.
- Inzichten in de relatie tussen amyloïde toxiciteit en mitochondriale functie.
- Totstandbrengen van een betrouwbaar in vitro model voor toekomstige studies.
Conclusies
- Mitochondriën dienen als een waardevol model voor het bestuderen van amyloïde toxiciteit.
- Het begrijpen van deze interacties kan leiden tot inzichten in neurodegeneratieve mechanismen.
- Toekomstig onderzoek kan op dit model voortbouwen om therapeutische strategieën te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol provides a biologically relevant in vitro model to assess amyloid-induced mitochondrial membrane permeabilization, a key mechanism in neurodegenerative disease pathology. By using isolated rat brain mitochondria, the approach enables direct evaluation of amyloid fibril interactions with native organelle membranes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The structure-dependent effects observed—particularly with alpha-synuclein fibrils—offer predictive insights for prioritizing therapeutic candidates based on mitochondrial toxicity profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of amyloid fibril interactions with mitochondrial membranes to clarify structure-toxicity relationships.
- Operational Value: Provides a reproducible assay for assessing mitochondrial integrity via MDH release and ROS generation as functional readouts.
- Predictive Value: Supports early identification of amyloid species with high membrane-disrupting potential, informing lead selection and de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized workflow for preparing brain mitochondria with confirmed membrane integrity for downstream compound or fibril screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable endpoints—MDH release and ROS fluorescence—that enable dose-response and comparative analysis across amyloid preparations.
- Scalability: The protocol supports multi-well formats (e.g., 96-well plates) for ROS measurement, facilitating medium-throughput screening of fibril variants or inhibitory compounds.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models a proposed mechanism of amyloid toxicity in neurodegenerative diseases, linking in vitro findings to pathophysiological processes.
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned studies by quantifying mitochondrial dysfunction, a feature observed in patient-derived models and clinical specimens.
- Preclinical De-risking: Helps prioritize amyloid-targeting interventions by identifying fibrillar forms most likely to impair mitochondrial function in relevant tissue contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, particularly after target engagement and before lead optimization, by providing mechanistic insight into amyloid-induced organelle damage. It complements biochemical and cellular assays by adding a native membrane context to toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on amyloid-mitochondria interactions and pathway clarification related to oxidative stress and bioenergetic failure.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility testing when evaluating compound effects on amyloid-induced mitochondrial permeabilization.
- Analytics: Generates quantitative readouts (MDH activity, ROS levels) that allow comparison of toxic potential across amyloid preparations or genetic variants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling a conserved mechanism of mitochondrial dysfunction seen in neurodegenerative disease models.
- Enterprise Reuse: The mitochondrial isolation and integrity validation steps create a reusable platform applicable to other amyloidogenic proteins or tissue-specific mitochondria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking amyloid fibril structure to mitochondrial membrane disruption.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized isolation, integrity confirmation (MDH activity), and controlled incubation conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying amyloid species with high mitochondrial toxicity potential, reducing investment in non-mechanistically relevant targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by flagging early signals of organelle-level toxicity that may predict late-stage safety concerns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation techniques and enzymatic activity assays to ensure preparation quality.
- Depends on centrifugation equipment capable of precise g-forces and temperature control (4°C) to maintain mitochondrial integrity.
- Necessitates standardization across teams for membrane integrity assessment (e.g., MDH activity thresholds) to enable cross-study comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the model to mitochondria from different brain regions or species, which may affect baseline susceptibility.
- Limited by the in vitro nature of the model, which may not fully capture dynamic cellular environments or compensatory mechanisms present in vivo.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Brain Homogenization and Mitochondrial Isolation
4:33
Mitochondrial Membrane Integrity Determination
5:58
Malate Dehydrogenase Activity Determination
7:07
In vitro α-synuclein, Bovine Insulin, and HEWL Fibril Formation
10:11
Treatment of Mitochondria with Amyloid Fibrils, MDH Release Assay, and ROS Measurement
12:14
Results
14:07
Conclusion
