Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Dit protocol vergemakkelijkt kwantitatieve kleinschalige analyses van cellulaire opslag lipide inhoud in een verscheidenheid van gist soorten en doet dit op een onpartijdige en gestandaardiseerde manier. De techniek maakt een snelle verwerking van microscopischkleine beelden mogelijk en biedt gedetailleerde kwantitatieve outputs om gemakkelijk monsters te vergelijken, zoals verschillende mutanten en cellen die onder uiteenlopende omstandigheden worden geteeld. Om te beginnen, volg mee in het bijbehorende tekstprotocol om de kleuroplossingen, cultuurmedia en cellen voor te bereiden.

Zorg ervoor dat de cellen gezond zijn en in de gewenste groeifase voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Bereid vervolgens een microscoopcoverslip voor elk monster dat moet worden afgebeeld. Spreid een microliter van schuifcoating oplossing op een schone coverslip met behulp van de lange kant van een horizontaal geplaatste pipet tip.

Laat de coatingoplossing volledig drogen en bewaar de covers in een stofvrije omgeving. Vervolgens, meet de optische dichtheden van de celculturen, en voor culturen worden geanalyseerd in dezelfde groeifase, proberen om vergelijkbare waarden te bereiken onder alle geteste culturen om vergelijkbare experimentele omstandigheden te garanderen. Dan, pipet een milliliter van de celcultuur in een 1,5-milliliter microcentrifuge buis.

Voor de S.cerevisiae cellen alleen, voeg vijf microliters van de dia coating oplossing aan de buis ook. Dan, kort vortex alle microcentrifuge buizen, en uitbroeden ze op 30 graden Celsius met schudden gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens een microliter van de lipide kleuring oplossing aan elke cultuur aliquot, en vortex ze kort.

Voeg vervolgens 10 microliter van de celgrensvisualisatieoplossing toe en draai ze kort een tweede keer. Verzamel de cellen door ze te centrifugeren bij 1.000 keer zwaartekracht gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent met spinnen, verwijder 950 microliter uit de supernatant en resuspend de cellen in de resterende supernatant met behulp van een pipet.

Vervolgens pipette twee microliters van de dichte cel suspensie op een lectine gecoate coverslip. Plaats vervolgens de coverslip op een schone microscoopdia om een celmonolaag te vormen en ga zo snel mogelijk naar microscopie om artefacten in beeldvorming te minimaliseren. Het opzetten van de microscoop vereist lange blootstelling aan sterke lichtbronnen die schade aan het monster kunnen veroorzaken en de resultaten kunnen scheeftrekken.

Stel daarom de beeldvormingsvoorwaarden in met behulp van een speciale voorbeelddia die niet verder zal worden gebruikt voor kwantificering van lipidedruppels. Plaats het toegewezen monster op het stadium van een fasecontrast of differentiële interferentiecontrastmicroscoopopstelling en focus op de cellen. Stel in de software van de microscoop de Z-stack-instellingen zo in dat ze het hele celvolume overspannen.

De totale verticale afstand is afhankelijk van de celgrootte en het aantal optische segmenten is afhankelijk van het numerieke diafragma van de doelstelling. Stel vervolgens de focus in om ten opzichte van het centrale brandpuntsvlak te verplaatsen. Om lipide druppels in beeld te brengen, stel je experimenteel de lichtintensiteit en belichtingstijd in het groene kanaal in.

Wees voorzichtig bij beeldvorming, want BODIPY is een zeer helder fluorchroom dat snel kan worden gefotobleached. Bovendien, minimaliseer de blootstellingstijd om oververzadiging te vermijden. Leg eerst de volledige groene kanaalZ-stack vast voordat je overschakelt naar het blauwe kanaal om te voorkomen dat de mobiele lipidedruppels vervagen.

Als u celgrenzen wilt weergeven, stelt u de lichtintensiteit en belichtingstijd experimenteel in in het blauwe kanaal. Indien mogelijk, het opzetten en gebruiken van een geautomatiseerde experimentele workflow in de microscoop controle software om beeldvorming van meerdere monsters onder gestandaardiseerde omstandigheden te vergemakkelijken. Belangrijk is dat alle afbeeldingen moeten worden verkregen met dezelfde instellingen om een passende vergelijking tussen de monsters mogelijk te maken.

Zodra de beeldvorming voorwaarden zijn geoptimaliseerd, richten op de cellen en beeld ze in zowel de groene en blauwe kanalen. Afbeelding van meerdere weergavevelden per voorbeeld om robuuste, representatieve gegevens te verkrijgen. Sla de blauwe en groene Z-stack-afbeeldingen op als 16-bits, meerlaagse TIFF-bestanden.

Zorg ervoor dat u de woorden groen of blauw opneemt in de bijbehorende bestandsnamen. Open microscopische afbeeldingen in ImageJ en verwijder alle afbeeldingsstapels met een aanzienlijk aantal cellen die tijdens de acquisitie zijn verplaatst. Deze worden op verschillende posities in afzonderlijke Z-secties weergegeven.

Verwijder vervolgens alle afbeeldingsstapels die zeer fluorescerende niet-celdeeltjes in het blauwe kanaal bevatten. Dit wordt vaak veroorzaakt door vuil op het beeldoppervlak of onzuiverheden in het teeltmedium en kan interfereren met de detectie van cellen in hun omgeving. Verwijder ook afbeeldingenstapels met een groot deel van de dode cellen.

Deze beelden tonen cellen met verhoogde blauwe fluorescentie in vergelijking met de levende cellen. Hoewel de aanwezigheid van een paar dode cellen in het monster meestal geen probleem is en deze cellen automatisch worden verwijderd tijdens de analyse, kunnen sommige dode of stervende cellen af en toe worden herkend als levende cellen door het segmentatiealgoritme en dus de gerapporteerde resultaten scheeftrekken. Maak eerst een hoofdmap en kopieer alle MATLAB-scripts naar deze locatie om met de analyse in MATLAB te beginnen.

Maak vervolgens submappen met de namen van de verschillende gistsoorten en kopieer de respectievelijke TIFF-afbeeldingen naar deze locaties. Nu, start MATLAB, open het script MAIN. m, en voer het script.

Selecteer in het menu de te analyseren gistsoorten en start de beeldverwerking. Inspecteer en verwerk de uitvoerbestanden naar behoefte met behulp van een spreadsheeteditor of statistisch pakket. De werkstroom produceert puntkomma-gescheiden CSV-bestanden en gesegmenteerde TIFF-bestanden met gedetecteerde celobjecten en lipidedruppels.

Hier worden wild-type S.pombe cellen getoond die werden gekweekt in het complexe JA-medium of het gedefinieerde EMM-medium. In vergelijking met cellen die in het YES-medium worden gekweekt, werden in het EMM-medium minder lipidedruppels en een hogere kleurintensiteit per celvolume-eenheid gedetecteerd. Bovendien waren individuele lipidedruppels gevormd in het EMM-medium groter en vertoonden ze een verhoogde totale kleurintensiteit.

Dit is in overeenstemming met eerdere bevindingen van verhoogde opgeslagen lipide inhoud in cellen geteeld in EMM. Vervolgens tonen deze beelden S.japonicus cellen uit exponentiële en vroeg-stationaire culturen gekweekt in YES medium. Cellen die stationaire fase toonden een aanzienlijk verminderd aantal lipide druppeltjes per eenheid van celvolume, terwijl volume-genormaliseerde lipide druppelfluorescentie intensiteit licht gedaald tussen de twee voorwaarden.

De vroege stationaire fase lipide druppels waren meestal matig groter in omvang en had matig hogere totale fluorescentie intensiteit in vergelijking met druppels van exponentieel groeiende cellen. In S.cerevisiae cellen gegroeid tot exponentieel versus stationaire fase, stationaire cellen bevatte iets minder lipide druppels per eenheid van het volume in vergelijking met exponentieel groeiende cellen. Echter, hun volume-genormaliseerde druppelfluorescentie intensiteit bijna verdubbeld.

Deze sterke toename van het totale lipide druppelgehalte was te wijten aan de veel hogere fluorescentieintensiteit en het volume van individuele lipidedruppels in de stationaire fase. Na deze procedure kunnen uitvoergegevens worden samengevoegd in een statistisch pakket zoals R om plots van samengevatte resultaten te maken en statistische tests uit te voeren op eventuele waargenomen verschillen in lipidedruppelgehalte. In principe kan de pijplijn voor beeldverwerking worden gebruikt voor analyse van lipidedruppelgehalte in andere micro-organismen of voor het analyseren van andere puntachtige subcellulaire structuren.