Name: Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer een gestandaardiseerde workflow voor geautomatiseerde kwantitatieve analyse van lipidedruppels in gistcellen met behulp van fluorescentiemicroscopie en beeldverwerking. Deze methode levert onbevooroordeelde, hoogdoorvoergegevens voor statistische vergelijking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Karelsuniversiteit subsidies PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 en SVV 260310. We danken Ondřej Šebesta voor hulp met microscopie en ontwikkeling van de pijplijn voorbeeld analyse. We danken het ReGenEx Lab voor s. cerevisiae stammen, en Japonet en Hironori niki's Lab voor s. japonicus stammen. De ppc1-88 stam werd geleverd door het gist genetische hulpmiddel centrum Japan. Microscopie werd uitgevoerd in het laboratorium voor confocale en fluorescentiemicroscopie, gecofinancierd door het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling en de staatsbegroting van de Tsjechische Republiek (Projectnr. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 en CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. voorbereiding van oplossingen en media
<ol><li>
Bereid lipide-kleurings oplossing.
	<ol>
<li>Voor het bereiden van de lipide-kleurenoplossing Los 10 mg BODIPY 493/503 op in 10 mL watervrije DMSO (uiteindelijke concentratie 1 mg/mL). Los de volledige inhoud van een 10 mg BODIPY 493/503 injectieflacon op om verlies van materiaal tijdens het wegen te voorkomen. Let op: DMSO kan passeren de huid. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
		<li>Bereid werk lipiden kleurings oplossing voor door het mengen van 100 μL van de 1 mg/mL BODIPY 493/503 stockoplossing en 900 μL watervrij DMSO (eindconcentratie 0,1 mg/mL).</li>
		<li>Aliquot de voorraad en werkoplossingen, en bewaren bij-20 °C. Opmerking: Opgeloste BODIPY 493/503 is stabiel gedurende meerdere jaren bij-20 °C. De oplossing moet echter worden beschermd tegen vocht en licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om de voorraadoplossing voor de celgrens visualisatie te bereiden, lost u 25 mg Cascade Blue dextran (hele injectieflacon) op in 2,5 mL gedeïoniseerd water (eindconcentratie 10 mg/mL). Aliquot de stockoplossing en bewaren bij-20 °C beschermd tegen licht.</li>
	<li>Voor het bereiden van Microscoop dia coating oplossing, los 5 mg van soja lectine in 5 mL gedeïoniseerd water (uiteindelijke concentratie 1 mg/mL). Aliquot de lectine oplossing en bewaren bij-80 °C. Opmerking: De lectine oplossing is gedurende enkele jaren stabiel bij-80 °C. Aliquots die momenteel in gebruik zijn, kunnen bij-20 °C worden bewaard.</li>
	<li>
Bereid de teelt media voor.
	<ol>
<li>Om 400 mL complex YES teeltmedium voor s. pombe en s. japonicus te bereiden, los 2 g gistextract en 0,1 g van SP supplementen (indien nodig voor auxotrofische mutanten) op in 340 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 60 mL van 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe.</li>
		<li>Om 400 mL van het gedefinieerde EMM-kweekmedium voor s. pombe en s. japonicus te bereiden, lost u 4,9 g EMM-Bouillon zonder dextrose op in 360 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 40 mL van 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe. Opmerking: Zie voor de algemene richtlijnen voor de teelt van s. pombe en s. japonicus respectievelijk25 en26.</li>
		<li>Om 300 ml complex ypad teeltmedium voor Saccharomyces cerevisiaete bereiden, Los 3 g gistextract, 6 g pepton en 30 mg adenine sulfaat op in 270 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 30 mL 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe.</li>
		<li>Om 300 mL gedefinieerd minimaal medium voor S. cerevisiae te bereiden, los 2 g gist stikstof base (zonder aminozuren) op in 270 ml gedeïoniseerd water in een 500 ml fles en autoclaaf. Voeg in aseptische omstandigheden 30 mL 20% (w/v) van afzonderlijk geautoclaveerd of met filter gesteriliseerde glucose toe. Opmerking: Zie voor de algemene richtlijnen voor de teelt van S. cerevisiae 27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. celteelt
<ol><li>
De groei van s. pombe of s. japonicus naar een exponentiële of vroegtijdige stationaire fase.
	<ol>
<li>In de ochtend, inoculeren 5 mL ja medium met verse splijting gist biomassa. Incuberen bij 32 °C met schudden (180 rpm) gedurende enkele uren. Opmerking: Gebruik voor alle cultivaties erlenmeyerkolven met 10 maal het volume van de kweek om een goede beluchting te garanderen. Sommige laboratoria geven de voorkeur aan het kweken van fissie gisten bij 30 ° c, maar de kweek temperatuur van 32 °c resulteert in kortere Verdubbelings tijden zonder nadelige effecten voor de cellen, waardoor de totale tijd die nodig is om een experiment uit te voeren, wordt verkort25,28 .</li>
		<li>In de late namiddag van dezelfde dag (na ten minste 6 uur teelt), Verdun de cultuur met vers ja medium tot een 10 mL eind kweek volume, zodat het de volgende ochtend de gewenste extinctie (OD) (of aantal cellen/mL) bereikt en inbroed bij 32 °C met s Hacking (180 rpm). Het is van voordeel om de verdubbelingstijd van elke gebruikte stam te kennen om de verdunningsfactor nauwkeurig te bepalen (gebruik vergelijking 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> Waar v-cultuur het precultuur volume is dat nodig is voor verdunning, is v-finale het totale volume van de nieuwe cultuur (10 ml voor standaard cultivaties), odFinal is de gewenste od om de volgende ochtend, odstroom is de momenteel gemeten od van de precultuur, t is de tijd van celgroei tot het oogsten, tlag is de duur van de lag-fase (afhankelijk van de laboratoriumomstandigheden, moet empirisch gedefinieerd) en tDT is de verdubbelingstijd van de stam. Opmerking: Wanneer exponentiële-fase cellen moeten worden geanalyseerd, laat dan geen preculturen de stationaire fase bereiken, omdat dit de celfysiologie (inclusief LD-gehalte) voor verschillende volgende generaties drastisch verandert.</li>
		<li>In de ochtend van de beeldvormings dag, als de cultuur iets hoger is dan vereist (in het geval van exponentiële fase cellen), Verdun deze dan met verse Ja en ga verder met incubatie gedurende ten minste twee verdubbelde tijden vóór het vlekken van LDs. Ga anders rechtstreeks naar vlekken (punt 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Groei van S. cerevisiae naar exponentiële en stationaire fase.
	<ol>
<li>Inoculeren in de namiddag 10 mL YPAD medium met een kleine hoeveelheid verse ontluikende gist biomassa en incuberen 's nachts bij 30 °C met schudden (180 rpm).</li>
		<li>De ochtend van Imaging Day, Verdun de cultuur tot OD 0,1 in 10 mL YPAD medium en groei naar de vereiste OD (bijv., OD 1 voor exponentiële fase). Voer alle kweek verdunningen uit zoals beschreven in stap 2.1.2. Ga verder met vlekken (punt 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. lipide druppel kleuring
<ol><li>Bereid een Microscoop strook voor elk monster dat moet worden afgebeeld. Verdeel 1 μL dia-coating oplossing op een schone Afdekstrook met behulp van de lange zijde van een horizontaal geplaatste pipetpunt. Laat de coating oplossing volledig drogen en bewaar de afdek stroken in een stofvrije omgeving. Opmerking: Glazen glijbanen en dekstroken kunnen voor gebruik worden gereinigd, indien nodig. De reinigingsprocedure bestaat uit het wassen met afwasmiddel, spoelen met water, overnachten in 3% zoutzuur en wassen met gedistilleerd water. Gereinigde glijbanen en dekstroken worden tot gebruik in zuivere ethanol opgeslagen.</li>
	<li>Meet de OD van de celcultuur of het aantal cellen/mL, indien nodig. Probeer vergelijkbare waarden te bereiken tussen alle geteste stammen om vergelijkbare experimentele omstandigheden te garanderen.</li>
	<li>Pipetteer 1 mL van elke celkweek in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Alleen voor S. cerevisiae , voeg 5 μL van de coating oplossing van de dia, Vortex kort, en inbroed bij 30 ° c met schudden gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voeg 1 μL van de lipidenkleuringoplossing toe aan elke kweek aliquot en Vortex kort. Voeg vervolgens 10 μL van de cel grens visualisatie oplossing toe en Vortex kort. Opmerking: Bereid vooraf gemengde oplossingen van beide vlekken niet als dit leidt tot fluorescentie bluchen van BODIPY 493/503.</li>
	<li>Verzamel de cellen door centrifugeren (1.000 x g, 3 min, RT) en verwijder bijna alle supernatant (~ 950 μL). De cellen in de resterende supernatant hervatten.</li>
	<li>Pipetteer 2 μL van de dichte celsuspensie op een Afdekstrook met lectine coating en plaats deze op een schone Microscoop-dia. De cellen moeten een monolayer vormen. Ga zo snel mogelijk naar microscopie (sectie 4) om artefacten in beeldvorming te minimaliseren; maximaal twee monsters tegelijk verwerken.</li>
</ol>4. de Microscoop en de beeldvorming instellen
<ol><li>
Optimaliseer imaging voorwaarden. Opmerking: het instellen van de Microscoop vereist langdurige blootstelling aan sterke lichtbronnen die schade aan het monster kunnen veroorzaken en de resultaten scheeftrekken. Stel daarom de beeldvormings condities in met behulp van een speciale sample Slide die niet verder wordt gebruikt voor LD-kwantificering.<ol>
<li>Focus op de cellen met behulp van fase contrast of differentiële interferentie contrast (DIC). Opmerking: Fase contrast of DIC beelden kunnen worden genomen ter referentie, maar ze worden niet gebruikt tijdens de geautomatiseerde afbeelding analyse stap.</li>
		<li>Stel z-stack-instellingen in om het hele celvolume te overbruggen. De totale verticale afstand is afhankelijk van de celgrootte; het aantal optische segmenten is afhankelijk van het numerieke diafragma van de doelstelling (puntspreidingsfunctie in z-as). Stel de focus in ten opzichte van het centrale brandvlak. Opmerking: Het optimale aantal segmenten wordt vaak ingesteld door de Microscoop-besturingssoftware en hoeft niet handmatig te worden berekend. De typische celbreedtes zijn 3-5 μm voor s. pombe, 4-7 μm voor s . japonicusen 3-7 μm voor s. cerevisiae.</li>
		<li>Voorbeeld LDs stelt u de lichtintensiteit en de belichtingstijd in op het groene kanaal (excitatie en emissiemaxima van BODIPY zijn respectievelijk 493 en 503 nm). Opmerking: BODIPY 493/503 is een zeer helder fluorochrome; echter, het kan krijgen gebleekt snel met overdreven sterke lichtintensiteit. Bovendien zijn LDs mobiel in levende cellen, waardoor de belichtingstijd wordt beperkt en de volledige Green-Channel z-stack eerst wordt vastgelegd (voordat wordt overgeschakeld naar het blauwe kanaal) om vervaging-artefacten te voorkomen. Neem ook rekening met het lineaire bereik van de camera voor de signaalintensiteit om verzadigde pixels te voorkomen.</li>
		<li>Om celgrenzen te verleggen, stelt u de lichtintensiteit en de belichtingstijd in het blauwe kanaal in (excitatie en emissiemaxima van Cascade Blue dextran zijn respectievelijk 400 en 420 nm). Opmerking: De signaalintensiteit in het blauwe kanaal is vereist voorbeeld segmentatie, maar wordt niet gebruikt voor LD-kwantificering zelf. Daarom zijn optimale instellingen in dit kanaal niet cruciaal voor analyse.</li>
		<li>Maak indien mogelijk een geautomatiseerde experimentele workflow in de Microscoop besturingssoftware om beeldvorming van meerdere monsters onder gestandaardiseerde omstandigheden te vergemakkelijken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra imaging voorwaarden zijn geoptimaliseerd, beeld monsters worden gebruikt voor kwantificering. Concentreer u op de cellen en beeld ze in groene en blauwe kanalen zoals beschreven in stap 4,1. Opmerking: Alle afbeeldingen moeten worden verkregen met dezelfde instellingen om vergelijking tussen samples mogelijk te maken. Afbeelding meerdere weergavevelden per sample om robuuste, representatieve gegevens te verkrijgen.</li>
	<li>Sla de Blue en Green Channel z-stack-afbeeldingen op als 16-bits TIFF-bestanden met meerdere lagen (d.w.z. twee bestanden per gezichtsveld). Woorden "groen" of "blauw" in de corresponderende bestandsnamen opnemen. Ga verder met beeldanalyse (paragraaf 5).</li>
</ol>5. beeldanalyse
<ol><li>
Controleer visueel de kwaliteit van de verworven beelden.
	<ol>
<li>Open microscopische afbeeldingen in imagej29,30 of andere geschikte beeldanalyse software.</li>
		<li>Verwijder alle afbeeldingsstapels die een aanzienlijk aantal cellen bevatten die tijdens de overname zijn verplaatst (en zo gemaakte vervaging-artefacten).</li>
		<li>Verwijder alle afbeeldingsstapels met sterk fluorescerende niet-celdeeltjes in het blauwe kanaal (bijvoorbeeld vuil op de Microscoop-dia of Afdekstrook, verontreinigingen in het kweekmedium). Opmerking: Zeer heldere niet-cellige objecten in het blauwe kanaal kunnen celdetectieartefacten maken of kunnen interfereren met de detectie van cellen in hun omgeving.</li>
		<li>Verwijder alle afbeeldingsstapels met een groot deel van de dode cellen (d.w.z. cellen met een verhoogde blauwe fluorescentie in vergelijking met levende cellen). Opmerking: Hoewel de aanwezigheid van een klein deel van de dode cellen in het monster meestal geen probleem is en deze cellen automatisch worden verwijderd tijdens de analyse, kunnen sommige dode of stervende cellen af en toe worden herkend als levende cellen door het segmentatie algoritme en dus de gerapporteerde resultaten scheeftrekken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyseer afbeeldingen in de MATLAB-software.
	<ol>
<li>Maak een hoofdmap en kopieer alle MATLAB-scripts naar deze locatie.</li>
		<li>Maak een sub-map ("pombe", "cerevisiae" of "japonicus") en kopieer de invoer TIFF-afbeeldingsbestanden naar deze locatie.</li>
		<li>Start MATLAB, openscript MAIN. m en voer het uit. Selecteer in het menu de gist soorten die moeten worden geanalyseerd en start de beeldverwerking. Opmerking: Sommige parameters die nodig zijn voor de detectie van cellen en LD zijn vooraf ingesteld voor de specifieke soort, andere worden automatisch bepaald tijdens de beeldverwerking. De vooraf ingestelde waarden werden empirisch bepaald en zijn afhankelijk van verschillende factoren, zoals objectieve vergroting, cameratype en gevoeligheid, en imaging-instellingen. Indien nodig kunnen gebruikers de scriptbestanden bewerken om de specifieke voorinstellingen van het organisme te wijzigen om hun experimentele instellingen beter weer te geven. Namelijk, tijdens de celherkenning acceptabele object groottes worden gegeven door de parameters "minArea" en "maxArea", en de minimale Fractie van gevuld volume binnen de object grenzen wordt gegeven door de "solidity" parameter. Voor LD-herkenning wordt de helderheidsdrempel gegeven door de "th"-parameter (de waarde wordt meestal beïnvloed door de bitdiepte van de afbeelding en de intensiteit van het fluorescentie signaal) en de maximale acceptabele LD-grootte wordt gegeven door de parameter "MaxArea".</li>
		<li>Inspecteer en verwerk de uitvoerbestanden naar wens met een spreadsheet editor of statistisch pakket; de werkstroom produceert CSV-bestanden met puntkomma's gescheiden en gesegmenteerde TIFF-bestanden met gedetecteerde celobjecten en LDs. Opmerking: De werkstroom segmenteert afbeeldingen in achtergrond-en celobjecten, waarbij elk celobject kan bestaan uit meerdere aangrenzende cellen. Daarom de uitvoer in ' xxxx_cells. csv ' bestanden vertegenwoordigt geen eencellige gegevens en moet alleen worden gebruikt voor het berekenen van per eenheid-cel-volume metrische gegevens.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+lipids+of+yeasts%3A+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Pichia+pastoris%2C+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li>
<li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li>
<li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+deletion+collection%3A+a+decade+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast%2C+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%28Seoul%2C+Korea%29%22%5BJournal%5D)">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li>
<li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li>
<li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8(2016).</li>
<li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC%2FC+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+To+Cells%3A+Devoted+To+Molecular+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li>
<li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+%28BODIPY%29+Derivatives+in+Liquids%2C+Lipid+Membranes%2C+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li>
<li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li>
<li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li>
<li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li>
<li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast%3A+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li>
<li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li>
<li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1%2C6-diphenylhexatriene%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li>
<li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Quantifier%3A+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li>
<li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-content%2Fhigh-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li>
<li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta.+Molecular+and+Cell+Biology+Of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li>
<li>Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+%E2%80%9Ccut%E2%80%9D+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li>
<li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li>
<li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizosaccharomyces+japonicus%3A+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li>
<li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis%2C+quiescence-exit+failure%2C+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117(2012).</li>
<li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li>
<li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li>
<li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li>
<li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape%2C+microtubule+organization%2C+and+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het begrip van lipide metabolisme en de regulering ervan is belangrijk voor zowel de basis biologie, en klinische en biotechnologische toepassingen. LD-gehalte staat voor een handige uitlezen van de vetmetabolisme toestand van de cel, met fluorescentiemicroscopie als een van de belangrijkste methoden die worden gebruikt voor de bepaling van LD-inhoud. Het gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele LDs in drie verschillende en morfologisch verschillende gist soort...

Lipiden spelen cruciale rollen in cellulaire energie en koolstof metabolisme, synthese van membraan componenten, en productie van bioactieve stoffen. Lipide metabolisme is fijnafgesteld volgens omgevingscondities, beschikbaarheid van nutriënten en fase1van de celcyclus. Bij de mens, lipide metabolisme is verbonden met ziekten, zoals obesitas, diabetes type II en kanker2. In de industrie vormen lipiden die door micro-organismen worden geproduceerd, zoals gisten, een veelbelovende bron van hernieuwbare dieselbrandstoffen3. Cellen slaan neutrale lipiden op in zogenaamde lipide druppeltjes (LDs). Deze evolutionair behouden lichamen zijn samengesteld uit triacylglycerolen, steryl esters, een buitenste fosfolipide monolaag en geassocieerde eiwitten1. LDs zijn afkomstig uit het endoplasmisch reticulum, oefenen celcyclus of groeifase dynamiek, en zijn belangrijk voor cellulaire lipide homeostase1. LD-nummer en morfologie kan worden gebruikt als een handige proxy wanneer het lipide metabolisme onder verschillende groeiomstandigheden of bij het screenen van een panel van mutanten. Gezien hun dynamische karakter zijn technieken die de eigenschappen van individuele LDs kunnen analyseren van bijzonder belang in onderzoeken naar lipide-metabolisme.
Verschillende gist soorten zijn gebruikt om lipide-gerelateerde metabole trajecten en hun regulering te beschrijven, of gebruikt in de biotechnologie om interessante verbindingen of brandstoffen te produceren1. Bovendien zijn voor model gisten, zoals de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae of de ver verwante Splijtings gist schizosaccharomyces pombe, genoom-Wide deletie stam bibliotheken beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor hoge doorvoer schermen4,5. Onlangs is LD samenstelling en dynamiek beschreven in S. pombe6,7,8,9, en mutanten gerelateerd aan lipide metabolisme zijn geïsoleerd in de opkomende model gist Schizosaccharomyces japonicus10.
Er zijn tal van technieken beschikbaar om LD-inhoud en-dynamiek te bestuderen. De meesten gebruiken een soort kleuring van LDs met lipofiele kleurstoffen zoals Nile Red of BODIPY 493/503. De laatste toont meer nauwe excitatie en emissiespectra, en verhoogde specificiteit naar neutrale lipiden (LDs) in tegenstelling tot fosfolipiden (membranen)11. Fluorimetrische en flow-cytometrie methoden zijn met succes gebruikt in verschillende schimmelsoorten om genen en groeiomstandigheden te achterhalen die invloed hebben op opslag lipide-inhoud12,13,14,15. Hoewel deze methoden geschikt zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer, kunnen ze de aantallen en morfologie van afzonderlijke LDs in cellen niet meten, wat dramatisch kan verschillen tussen groeiomstandigheden en genotypes. Coherente Raman verstrooiing of digitale holografische microscopie zijn label vrije methoden die LD-niveau gegevens opleveren, maar vereisen gespecialiseerde dure apparatuur16,17,18. Fluorescentiemicroscopie, aan de andere kant, kan gedetailleerde gegevens verstrekken over LD-inhoud, terwijl gebruik wordt makend van algemeen beschikbare instrumenten en software tools voorbeeld analyse. Er bestaan verschillende analyse werkstromen met verschillende gradaties van verfijning en automatisering in cel/LD-detectie van afbeeldingsgegevens, en zijn geoptimaliseerd voor verschillende celtypen, zoals metazoan-cellen met grote LDS19,20 , 21, of ontluikende gisten17,22,23. Sommige van deze benaderingen werken alleen in 2D (bijvoorbeeld bij maximale projectie beelden), die de cellulaire LD-inhoud mogelijk niet betrouwbaar beschrijven. Voor onze kennis bestaan er geen hulpmiddelen voor de bepaling van LD-gehalte en morfologie van de analyse van microscopische gegevens van splijting. De ontwikkeling van geautomatiseerde en robuuste analyses op LD-niveau zou leiden tot meer gevoeligheid en meer statistisch vermogen, en biedt rijke informatie over neutraal lipide-inhoud, idealiter in meerdere gist soorten.
We hebben een workflow ontwikkeld voor LD content analyse van 3D fluorescentiemicroscopie beelden van gistcellen. Levende cellen zijn gekleurd met BODIPY 493/503 en Cascade blauwe dextran om LDs te visualiseren en celgrenzen te bepalen, respectievelijk. Cellen worden geïmmobiliseerd op glazen glijbanen en onderworpen aan z-stack beeldvorming met behulp van een standaard epifluorescentie Microscoop. Afbeeldingen worden vervolgens verwerkt door een geautomatiseerde pijplijn geïmplementeerd in MATLAB, een veelgebruikte (commerciële) pakket voor statistische analyses. De pijplijn voert de voor verwerking van afbeeldingen, segmentatie (cellen versus achtergrond, verwijdering van dode cellen) en LD-identificatie uit. Uitgebreide gegevens op LD-niveau, zoals LD-grootte en fluorescentie-intensiteit, worden vervolgens geleverd in tabelvorm die compatibel is met belangrijke spreadsheet softwaretools. De werkstroom werd met succes gebruikt om te bepalen van de impact van de beschikbaarheid van stikstofbron op lipide metabolisme in S. pombe24. We demonstreren nu de functionaliteit van de workflow in s. pombe, s. japonicus en s. cerevisiae, waarbij gebruik wordt gemaakt van groeicondities of mutanten die het cellulaire LD-gehalte beïnvloeden.

```html
<table><tbody><tr><td>12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&nbsp;</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Adenine hemisulfaat zout, &ge;99%</td><td>Merck</td><td>A9126-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>voor neutrale lipidevlekken</td></tr><tr><td>D-(+) - Glucose, &ge;99.5%</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, Anionisch, Lysine Fixable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>voor negatieve kleuring van cellen</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide, &ge;99.5%</td><td>Merck</td><td>D4540</td><td>of hogere zuiverheid, houd anhydrous op moleculaire zeef</td></tr><tr><td>EMM-bouillon zonder dextrose</td><td>Formedium</td><td>PMD0405</td><td>medium kan ook worden bereid uit afzonderlijke componenten</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ software</td><td>NIH</td><td>&nbsp;</td><td>of gelijkwaardig; voor visuele inspectie van microscopische gegevens</td></tr><tr><td>Hoge precisie dekglazen, 22 mm x 22 mm, No 1.5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>gebruik elk # 1.5 dekglas</td></tr><tr><td>Image Processing Toolbox voor MATLAB, versie 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lectin van Glycine max (sojabonen)</td><td>Merck</td><td>L1395</td><td>voor cel immobilisatie op slides</td></tr><tr><td>MATLAB software, versie 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscoopglaasje, 26 mm x 76 mm, 1 mm dikte</td><td>Knittel Glass</td><td>L762601.2</td><td>gebruik elk microscoopglaasje dat past op uw microscooptafel, grondig schoonmaken voor het laden van cellen</td></tr><tr><td>Olympus CellR-microscoop met automatische z-as objectiefbeweging</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Pentaband filterset</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td><td>helder veld, groene en blauwe kanalen zijn voldoende</td></tr><tr><td>Signal Processing Toolbox voor MATLAB, versie 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SP-supplementen</td><td>Formedium</td><td>PSU0101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Standaard kantoorcomputer die in staat is om MATLAB uit te voeren</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Statistics and Machine Learning Toolbox voor MATLAB, versie 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Universeel pepton M66 voor microbiologie</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UPLSAPO 60XO objectief</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Giststikstofbasis zonder aminozuren</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>
```

analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipide metabolisme en de regulering ervan zijn van belang voor zowel elementaire als toegepaste biowetenschappen en biotechnologie. In dit verband, verschillende gist soorten worden gebruikt als modellen in lipide metabolische onderzoek of voor industriële lipide productie. Lipide druppeltjes zijn zeer dynamische opslag lichamen en hun cellulaire inhoud vertegenwoordigt een handige uitlezen van de lipide metabolische toestand. Fluorescentiemicroscopie is een methode van keuze voor kwantitatieve analyse van cellulaire lipide druppeltjes, als het steunt op algemeen beschikbare apparatuur en maakt analyse van individuele lipide druppeltjes. Bovendien, microscopische beeldanalyse kan worden geautomatiseerd, sterk verhogen van de algehele analyse doorvoer. Hier beschrijven we een experimentele en analytische workflow voor geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van individuele lipidedrup pels in drie verschillende model gist soorten: de splijting gisten schizosaccharomyces pombe en Schizosaccharomyces japonicus, en de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Lipide druppeltjes worden gevisualiseerd met BODIPY 493/503, en cel-ondoorlatend fluorescerende dextran wordt toegevoegd aan de cultuur media om celgrenzen te identificeren. Cellen worden onderworpen aan 3D epifluorescentie microscopie in groene en blauwe kanalen en de resulterende z-stack beelden worden automatisch verwerkt door een MATLAB pipeline. De procedure levert uitgebreide kwantitatieve gegevens op cellulaire lipide druppel inhoud en individuele lipide druppel kenmerken in een tabelvorm formaat geschikt voor downstream analyses in grote spreadsheet of statistische pakketten. Wij bieden voorbeeld analyses van lipide druppel inhoud onder verschillende omstandigheden die invloed hebben op cellulaire lipide metabolisme.

De hele procedure wordt samengevat in Figuur 1 voor de fissie gisten (de ontluikende gist werkstroom is analoog), en hieronder geven we voorbeelden van hoe de workflow kan worden gebruikt om ld-gehalte te bestuderen in drie verschillende gist soorten onder verschillende omstandigheden die bekend zijn om de cellulaire LD-inhoud te beïnvloeden. Elk voorbeeld vertegenwoordigt één biologisch experiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigi...

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Dit protocol vergemakkelijkt kwantitatieve kleinschalige analyses van cellulaire opslag lipide inhoud in een verscheidenheid van gist soorten en doet dit op een onpartijdige en gestandaardiseerde manier. De techniek maakt een snelle verwerking van microscopischkleine beelden mogelijk en biedt gedetailleerde kwantitatieve outputs om gemakkelijk monsters te vergelijken, zoals verschillende mutanten en cellen die onder uiteenlopende omstandigheden worden geteeld. Om te beginnen, volg mee in het bijbehorende tekstprotocol om de kleuroplossingen, cultuurmedia en cellen voor te bereiden.Zorg ervoor dat de cellen gezond zijn en in de gewenste groeifase voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Bereid vervolgens een microscoopcoverslip voor elk monster dat moet worden afgebeeld. Spreid een microliter van schuifcoating oplossing op een schone coverslip met behulp van de lange kant van een horizontaal geplaatste pipet tip.Laat de coatingoplossing volledig drogen en bewaar de covers in een stofvrije omgeving. Vervolgens, meet de optische dichtheden van de celculturen, en voor culturen worden geanalyseerd in dezelfde groeifase, proberen om vergelijkbare waarden te bereiken onder alle geteste culturen om vergelijkbare experimentele omstandigheden te garanderen. Dan, pipet een milliliter van de celcultuur in een 1,5-milliliter microcentrifuge buis.Voor de S.cerevisiae cellen alleen, voeg vijf microliters van de dia coating oplossing aan de buis ook. Dan, kort vortex alle microcentrifuge buizen, en uitbroeden ze op 30 graden Celsius met schudden gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens een microliter van de lipide kleuring oplossing aan elke cultuur aliquot, en vortex ze kort.Voeg vervolgens 10 microliter van de celgrensvisualisatieoplossing toe en draai ze kort een tweede keer. Verzamel de cellen door ze te centrifugeren bij 1.000 keer zwaartekracht gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent met spinnen, verwijder 950 microliter uit de supernatant en resuspend de cellen in de resterende supernatant met behulp van een pipet.Vervolgens pipette twee microliters van de dichte cel suspensie op een lectine gecoate coverslip. Plaats vervolgens de coverslip op een schone microscoopdia om een celmonolaag te vormen en ga zo snel mogelijk naar microscopie om artefacten in beeldvorming te minimaliseren. Het opzetten van de microscoop vereist lange blootstelling aan sterke lichtbronnen die schade aan het monster kunnen veroorzaken en de resultaten kunnen scheeftrekken.Stel daarom de beeldvormingsvoorwaarden in met behulp van een speciale voorbeelddia die niet verder zal worden gebruikt voor kwantificering van lipidedruppels. Plaats het toegewezen monster op het stadium van een fasecontrast of differentiële interferentiecontrastmicroscoopopstelling en focus op de cellen. Stel in de software van de microscoop de Z-stack-instellingen zo in dat ze het hele celvolume overspannen.De totale verticale afstand is afhankelijk van de celgrootte en het aantal optische segmenten is afhankelijk van het numerieke diafragma van de doelstelling. Stel vervolgens de focus in om ten opzichte van het centrale brandpuntsvlak te verplaatsen. Om lipide druppels in beeld te brengen, stel je experimenteel de lichtintensiteit en belichtingstijd in het groene kanaal in.Wees voorzichtig bij beeldvorming, want BODIPY is een zeer helder fluorchroom dat snel kan worden gefotobleached. Bovendien, minimaliseer de blootstellingstijd om oververzadiging te vermijden. Leg eerst de volledige groene kanaalZ-stack vast voordat je overschakelt naar het blauwe kanaal om te voorkomen dat de mobiele lipidedruppels vervagen.Als u celgrenzen wilt weergeven, stelt u de lichtintensiteit en belichtingstijd experimenteel in in het blauwe kanaal. Indien mogelijk, het opzetten en gebruiken van een geautomatiseerde experimentele workflow in de microscoop controle software om beeldvorming van meerdere monsters onder gestandaardiseerde omstandigheden te vergemakkelijken. Belangrijk is dat alle afbeeldingen moeten worden verkregen met dezelfde instellingen om een passende vergelijking tussen de monsters mogelijk te maken.Zodra de beeldvorming voorwaarden zijn geoptimaliseerd, richten op de cellen en beeld ze in zowel de groene en blauwe kanalen. Afbeelding van meerdere weergavevelden per voorbeeld om robuuste, representatieve gegevens te verkrijgen. Sla de blauwe en groene Z-stack-afbeeldingen op als 16-bits, meerlaagse TIFF-bestanden.Zorg ervoor dat u de woorden groen of blauw opneemt in de bijbehorende bestandsnamen. Open microscopische afbeeldingen in ImageJ en verwijder alle afbeeldingsstapels met een aanzienlijk aantal cellen die tijdens de acquisitie zijn verplaatst. Deze worden op verschillende posities in afzonderlijke Z-secties weergegeven.Verwijder vervolgens alle afbeeldingsstapels die zeer fluorescerende niet-celdeeltjes in het blauwe kanaal bevatten. Dit wordt vaak veroorzaakt door vuil op het beeldoppervlak of onzuiverheden in het teeltmedium en kan interfereren met de detectie van cellen in hun omgeving. Verwijder ook afbeeldingenstapels met een groot deel van de dode cellen.Deze beelden tonen cellen met verhoogde blauwe fluorescentie in vergelijking met de levende cellen. Hoewel de aanwezigheid van een paar dode cellen in het monster meestal geen probleem is en deze cellen automatisch worden verwijderd tijdens de analyse, kunnen sommige dode of stervende cellen af en toe worden herkend als levende cellen door het segmentatiealgoritme en dus de gerapporteerde resultaten scheeftrekken. Maak eerst een hoofdmap en kopieer alle MATLAB-scripts naar deze locatie om met de analyse in MATLAB te beginnen.Maak vervolgens submappen met de namen van de verschillende gistsoorten en kopieer de respectievelijke TIFF-afbeeldingen naar deze locaties. Nu, start MATLAB, open het script MAIN. m, en voer het script.Selecteer in het menu de te analyseren gistsoorten en start de beeldverwerking. Inspecteer en verwerk de uitvoerbestanden naar behoefte met behulp van een spreadsheeteditor of statistisch pakket. De werkstroom produceert puntkomma-gescheiden CSV-bestanden en gesegmenteerde TIFF-bestanden met gedetecteerde celobjecten en lipidedruppels.Hier worden wild-type S.pombe cellen getoond die werden gekweekt in het complexe JA-medium of het gedefinieerde EMM-medium. In vergelijking met cellen die in het YES-medium worden gekweekt, werden in het EMM-medium minder lipidedruppels en een hogere kleurintensiteit per celvolume-eenheid gedetecteerd. Bovendien waren individuele lipidedruppels gevormd in het EMM-medium groter en vertoonden ze een verhoogde totale kleurintensiteit.Dit is in overeenstemming met eerdere bevindingen van verhoogde opgeslagen lipide inhoud in cellen geteeld in EMM. Vervolgens tonen deze beelden S.japonicus cellen uit exponentiële en vroeg-stationaire culturen gekweekt in YES medium. Cellen die stationaire fase toonden een aanzienlijk verminderd aantal lipide druppeltjes per eenheid van celvolume, terwijl volume-genormaliseerde lipide druppelfluorescentie intensiteit licht gedaald tussen de twee voorwaarden.De vroege stationaire fase lipide druppels waren meestal matig groter in omvang en had matig hogere totale fluorescentie intensiteit in vergelijking met druppels van exponentieel groeiende cellen. In S.cerevisiae cellen gegroeid tot exponentieel versus stationaire fase, stationaire cellen bevatte iets minder lipide druppels per eenheid van het volume in vergelijking met exponentieel groeiende cellen. Echter, hun volume-genormaliseerde druppelfluorescentie intensiteit bijna verdubbeld.Deze sterke toename van het totale lipide druppelgehalte was te wijten aan de veel hogere fluorescentieintensiteit en het volume van individuele lipidedruppels in de stationaire fase. Na deze procedure kunnen uitvoergegevens worden samengevoegd in een statistisch pakket zoals R om plots van samengevatte resultaten te maken en statistische tests uit te voeren op eventuele waargenomen verschillen in lipidedruppelgehalte. In principe kan de pijplijn voor beeldverwerking worden gebruikt voor analyse van lipidedruppelgehalte in andere micro-organismen of voor het analyseren van andere puntachtige subcellulaire structuren.

analysis-lipid-droplet-content-fission-budding-yeasts-using-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijven we een nieuwe kwantitatieve lipidomics methode voor het identificeren van een groot aantal soorten lipiden in gist met behulp van survey-scan electrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI / MS). Deze methode dan op dit moment beschikbare methoden voor lipide identificatie en kwantificering in de mogelijkheid om verschillende moleculaire vormen van lipiden, gevoeligheid en snelheid op te lossen.

Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.

Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta

Hier beschrijven we een protocol om te verkrijgen van de lipide druppel index (LD index) om te bestuderen van de dynamiek van triacylglycerolen in cellen gekweekt in high-throughput experimenten. De LD index bepaling is een gemakkelijke en betrouwbare methode die gebruikmaakt van BODIPY 493/503. Deze test hoeft niet dispendious lipide extractie of microscopie analyse.

Lipide Index bepaling door vloeibare fluorescentie herstel in de schimmel pathogeen Ustilago Maydis

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Hierin demonstreren we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503 fluorescentie-gebaseerd protocol voor lipidedruppelkarakterisering in leverweefsel. Door het gebruik van orthogonale projecties en 3D-reconstructies maakt de fluorofoor een succesvolle discriminatie tussen microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen voor de beoordeling van leversteatose.

Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling

De huidige studie beschrijft op decellularisatie gebaseerde methodologieën voor het visualiseren en kwantificeren van intramusculair vetweefsel (IMAT) afzetting door middel van intact spiervolume, evenals het kwantificeren van statistieken van individuele adipocyten waaruit IMAT bestaat.

Op decellularisatie gebaseerde kwantificering van vetinfiltratie van skeletspieren

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Lipofagie is een selectieve vorm van autofagie waarbij lipidedruppeltjes worden afgebroken. Disfuncties in dit proces worden in verband gebracht met de ontwikkeling van kanker. De precieze mechanismen zijn echter nog niet volledig begrepen. Dit protocol beschrijft kwantitatieve beeldvormingsbenaderingen om de wisselwerking tussen autofagie, lipidenmetabolisme en kankerprogressie beter te begrijpen.

Onderzoek naar de regulatie van katabolisme van lipidendruppels door middel van lipofagie

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer een gestandaardiseerde workflow voor geautomatiseerde kwantitatieve analyse van lipidedruppels in gistcellen met behulp van fluorescentiemicroscopie en beeldverwerking. Deze methode levert onbevooroordeelde, hoogdoorvoergegevens voor statistische vergelijking.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Meer video's verkennen