Name: Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Leer hoe je BIRFLU gebruikt voor het volgen van Influenza A-virusinfecties in muizen met luciferase- en fluorescentie-reporters. Deze methode maakt zowel in vitro als in vivo analyse van virale dynamiek en antivirale effectiviteit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek naar het influenzavirus in LM-S-laboratorium wordt deels gefinancierd door het New York influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), een lid van de NIAID Centers of Excellence for influenza Research and Surveillance (CEIRS) Contractnr. HHSN272201400005C (NYICE) en door het ministerie van defensie (DoD) peer reviewed medisch onderzoeksprogramma (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onderzoekers hebben vertrouwd op recombinant reporter-het uitdrukken van virussen als vitale moleculaire instrumenten te begrijpen en uit te breiden op het huidige begrip van virale replicatie en pathogenese26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. de meest begunstigd reporter genen zijn luciferasen en fluorescerende eiwitten, voornamelijk als gevolg van de technologische vooruitgang in hun identificatie, ontwikkeling van verbeterde varianten en detectie door imaging Technologies43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. recombinant reporter virussen worden vaak gebruikt om virologische testen te versnellen, de dynamiek van virussen in vitro en in vivo te bestuderen en de effectiviteit van momenteel goedgekeurde of nieuwe vaccin-en therapeutische benaderingen te testen26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Helaas, in het geval van iav, waren eerdere studies beperkt tot de uitdrukking van één reporter-gen, wat het type studie dat zou kunnen worden uitgevoerd, belemmert dat 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. om deze beperking te vermijden, hebben we een replicatie-competente bi-reporter iav gegenereerd die een nluc plaats en een Venus TL-eiwit (birflu) uitdrukt.
In dit rapport beschrijven we de in vitro karakterisatie van BIRFLU en de experimentele benaderingen om BIRFLU te gebruiken om virale infectie in vivo te volgen met behulp van een muismodel van IAV-infectie. BIRFLU Nluc en Venus expressie correleerde met virale titers. Bovendien bleef de BIRFLU stabiel en bleef hij beide reporter genen uitdrukken na te zijn hersteld uit de longen van geïnfecteerde muizen. Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekende gelegenheid om IAV te bestuderen in gekweekte cellen en in diermodellen, met inbegrip van de identificatie en ontwikkeling van nieuwe therapeutische alternatieven voor de behandeling van IAV-infecties.
Hoewel birflu is gegenereerd met behulp van de ruggengraat van PR8, kan andere recombinant iav met behulp van verschillende type, subtype of virale stam wervels worden gegenereerd met behulp van dezelfde experimentele benadering. Evenzo hebben we in dit verslag de experimentele procedures voor het gebruik van BIRFLU beschreven in een muismodel van IAV. BIRFLU kan echter een waardevolle technologie zijn om de IAV-infectie in andere diermodellen te evalueren.

Influenza A virus (IAV) is een gehuld enkelvoudig, negatief-zintuig gesegmenteerd RNA-virus van de orthomyxoviridae familie1,2,3. De World Health Organization (WHO) schat 3-5 miljoen jaarlijkse influenza cases en meer dan 250.000 sterfgevallen van influenza wereldwijd4,5,6. Groepen die bijzonder kwetsbaar zijn voor influenza zijn ouderen, immuungecompromitteerde individuen en kinderen7,8,9,10,11. Hoewel vaccins beschikbaar zijn en de meest voorkomende en effectieve interventie tegen virale infectie vormen, kan iav zich snel ontwikkelen en ontsnappen aan de bestaande immuniteit3,12,13, 14 , 15. de heropkomst van een pandemie H1N1-stam in 2009 en de opkomst van pathogene iav herhaalt de voortdurende bedreiging voor de volksgezondheid van de mens wereldwijd4,16.
Tijdens een epidemie of pandemie is het van cruciaal belang om snel de pathogeniteit en overdraagbaarheid van nieuw geïsoleerde virussen te bepalen. Momenteel beschikbare technieken om het virus te detecteren zijn tijdrovend en vereisen soms het gebruik van moeizame benaderingen, die de voltooiing van deze analyses kunnen vertragen17,18,19,20. Bovendien zijn aanwezige virale testen moeilijk op te schalen, wat nodig kan zijn tijdens een uitbraak. Ten slotte wordt het gebruik van gevalideerde diermodellen van infectie, zoals muizen, cavia's en fretten routinematig gebruikt en zijn ze van vitaal belang voor het bestuderen van influenza-infecties, immuunresponsen en de werkzaamheid van nieuwe vaccins en/of antivirale middelen. Echter, deze modellen zijn beperkend als gevolg van het onvermogen om te observeren virale dynamiek in real time; Dit beperkt de studies tot statische beeldvorming van virale infecties21,22,23,24,25. Dieren die in deze assays worden gebruikt, worden ook geëchaniseerd om de virale last te bepalen, waardoor het aantal dieren dat nodig is om deze studies af te ronden26toeneemt. Om al deze beperkingen te omzeilen, vertrouwen veel onderzoekers op het gebruik van recombinant replicatie-competent, reporter-uitdrukken van IAVs, die in staat zijn om virologische assays te versnellen en virale belasting en verspreiding in vivo in real-time te detecteren26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Belangrijk is dat deze verslaggevende iavs op dezelfde manier kan repliceren naar wild-type (WT) iavs in celcultuur en in diermodellen van infectie33,42.
Fluorescerende en bioluminescente eiwitten zijn twee reporter systemen die vaak worden gebruikt door onderzoekers vanwege hun gevoeligheid, stabiliteit en gebruiksgemak. Daarnaast is er enorme ondersteuning en vooruitgang in fluorescerende en bioluminescente proteïne detectietechnologieën43,44,45,46,47,48 . Fluorescerende eiwitten en plaats hebben verschillende eigenschappen die hen in staat stellen om te gloeien, specifiek verschillend in hoe opgewonden toestanden worden gegenereerd en hoe licht wordt gedetecteerd43,44,45, 46,47,48. Fluorescerende eiwitten worden eerst opgewekt door het absorberen van energie, die vervolgens wordt vrijgegeven als licht op een andere golflengte als de moleculen dalen tot een lagere energietoestand43. Aan de andere kant, bioluminescentie is afgeleid van een chemische exotherme reactie waarbij een substraat, zuurstof, en soms ATP met het oog op de productie van licht45. Als gevolg van de verschillende eigenschappen van deze twee soorten reporter eiwitten, een misschien voordeliger dan de andere afhankelijk van de studie van belang. Terwijl fluorescerende eiwitten op grote schaal worden gebruikt om cellulaire lokalisatie te observeren28,41, hun in vivo signalen hebben onvoldoende intensiteit en zijn vaak verduisterd door autofluorescentie in levende weefsels49. Daarom vertrouwen onderzoekers op luciferasen om de virale dynamiek in levende organismen te evalueren, hoewel fluorescerende eiwitten de voorkeur kunnen krijgen voor ex-vivo-studies50,51,52,53. In tegenstelling tot fluorescerende eiwitten, luciferases zijn handiger voor in vivo studies en meer toepasbaar in niet-invasieve benaderingen26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. uiteindelijk, op basis van het type studie, moeten onderzoekers kiezen tussen het gebruik van een fluorescerende of een plaats reporter-eiwit als hun uitlezen, die hun studie onderwerpt aan een trade-off van functionaliteiten en gevoeligheden, en ernstig het nut van de recombinant reporter virussen beperkt. Bovendien is er bezorgdheid over de correlatie tussen de uitdrukking van verschillende reporter genen met behulp van fluorescentie-of plaats-systemen en virale replicatie of verspreiding, die de interpretatie van de verkregen gegevens met Reporter-het uitdrukken van IAVs.
We hebben deze beperking overwonnen door het genereren van een recombinant replicatie-competente bi-reporter iav (birflu) die codeert voor zowel een fluorescerende als een plaats eiwit in hetzelfde virale genoom55 (Figuur 1). Hier werd nanoluc plaats (nluc), een klein en helder bioluminescente eiwit48, stroomopwaarts geplaatst van de hemagglutinine (ha) sequentie in het virale ha segment van influenza a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Daarnaast werd Venus, een veelgebruikt monomere fluorescerende proteïne, ingebracht in het niet-structurele (NS) virale segment32,33,36,41,55. Aangezien birflu codeert voor zowel fluorescerende als plaats-reporter genen, kan ofwel reporter proteïne signaal worden gebruikt als uitlezen om virale replicatie en verspreiding in vitro of in vivo55te bepalen. Meer informatie over het genereren en in vitro of in vivo karakterisering van BIRFLU vindt u in onze recente publicatie55. BIRFLU kan worden gebruikt om de effectiviteit van antivirale geneesmiddelen te testen of om antilichamen te neutraliseren via een nieuwe fluorescentie-en bioluminescente gebaseerde microneutralisatie test55. Bovendien kan BIRFLU ook gebruikt worden om de virale dynamiek te evalueren in een muismodel van infectie55. In dit manuscript beschrijven we de procedures voor het karakteriseren van BIRFLU55 in vitro en het bestuderen van birflu infectie bij muizen met behulp van in vivo luminescentie beeldvormingssystemen voor de detectie van nluc in vivo of van Venus ex vivo.
De combinatie van geavanceerde technieken in de moleculaire biologie, dierlijke onderzoeks-en beeldvormings technologieën, brengt onderzoekers de unieke kans om BIRFLU te gebruiken voor IAV-onderzoek, inclusief de studie van interacties met virus-host, dynamiek van virale infectie; de ontwikkeling van nieuwe vaccin benaderingen voor de therapeutische behandeling van IAV-infecties of het mogelijke gebruik van IAV als vaccin vector voor de behandeling van andere pathogenen infecties.

<table><tbody><tr><td>12-well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6-well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96-well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>Deze software wordt gebruikt in 3.1.10 en 4.4.7</td></tr><tr><td>Bovin Albumin solution (BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Bewaar bij 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Cell Culture dishes 100mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>BioRad</td><td></td><td>Dit instrument wordt gebruikt in 4.4.7</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinders</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>5 tot 7 weken oude vrouwelijke BALB/c muizen</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>Dit instrument wordt gebruikt voor in vivo beeldvorming (4.2 en 4.3)</td></tr><tr><td>IX81 Motorized Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX81</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 4.7.2 software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Dit instrument wordt gebruikt voor in vivo beeldvorming (4.2 en 4.3)</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td><td>Dit instrument wordt gebruikt voor het kwantificeren van luciferase-activiteit (3.2.6)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagent</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Dit reagens wordt gebruikt om Nluc-activiteit te meten. Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Neutral Buffered Formalin 10%</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394 Camera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies</td><td>Jackson</td><td>715-075-150</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Vmax Kinetic plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A virussen (IAVs) veroorzaken menselijke respiratoire aandoeningen die gepaard gaat met aanzienlijke gezondheids-en economische gevolgen. Net als bij andere virussen, het bestuderen van IAV vereist het gebruik van moeizame secundaire benaderingen voor het opsporen van de aanwezigheid van het virus in geïnfecteerde cellen en/of in diermodellen van infectie. Deze beperking is onlangs omzeild met de generatie van recombinant IAVs uitdrukken gemakkelijk traceerbaar fluorescerende of bioluminescente (Luciferase) reporter eiwitten. Echter, onderzoekers zijn gedwongen te selecteren fluorescentie of plaats reporter genen als gevolg van de beperkte capaciteit van de iav genoom voor het opnemen van buitenlandse sequenties. Om deze beperking te overwinnen, hebben we een recombinant replicatie-competente bi-reporter iav (birflu) die stabiel zowel een fluorescerende als een plaats reporter gen uitdrukken om iav-infecties in vitro en in vivo gemakkelijk bij te houden. Hiertoe werden de virale niet-structurele (NS) en hemagglutininen (ha) virale segmenten van influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) aangepast om respectievelijk de fluorescerende Venus en de bioluminescente nanoluc plaats eiwitten te coderen. Hier beschrijven we het gebruik van BIRFLU in een muismodel van IAV-infectie en de detectie van beide reporter genen met behulp van een in vivo imaging System. Met name hebben we een goede correlatie waargenomen tussen de uitingen van zowel verslaggevers als virale replicatie. De combinatie van geavanceerde technieken in de moleculaire biologie, dierlijke onderzoeks-en beeldvormings technologieën, biedt onderzoekers de unieke kans om deze tool te gebruiken voor influenza onderzoek, waaronder de studie van interacties met virus-host en dynamiek van virale infecties. Belangrijk is dat de haalbaarheid om het virale genoom genetisch te veranderen om twee vreemde genen uit verschillende virale segmenten uit te drukken, mogelijkheden biedt om deze aanpak te gebruiken voor: (i) de ontwikkeling van nieuwe IAV-vaccins, (II) de generatie van recombinante IAVs die kan worden gebruikt als vaccin vectoren voor de behandeling van andere humane pathogenen infecties.

Aanmaak en karakterisering van de BIRFLU in vitro (figuur 1 en figuur 2)
Een recombinant replicatie-competente IAV die twee verschillende reporter genen (BIRFLU) uitdrukt, werd geconstrueerd met behulp van State of the art moleculaire biologie en op plasmide gebaseerde technieken voor reverse genetica (Figuur 1). Hier hebben we ervoor gekozen om nluc te gebruiken vanwege verschillende voordelen ten opzichte van andere luciferases, waaronder zijn kleine formaat, ATP-onafhankelijkheid, grotere intensiteit en geoptimaliseerde ondergrond48,60. Nluc werd gekloond in het ha-segment van de iav PR8 gevolgd door de varkens teschovirus (PTV) 2a decolleté plaats (2a) voor het open Lees frame (ORF) van ha (Figuur 1). De ORF van HA omvatte stille mutaties om de oorspronkelijke verpakkings signalen te verwijderen en elke mogelijke recombinatie te vermijden. Het volledige HA-verpakkings signaal werd voor Nluc toegevoegd om de juiste opname van het gemodificeerde HA-segment in de virion-en Nluc-en HA-expressie uit hetzelfde virale RNA-segment (Figuur 1) mogelijk te maken. Daarnaast werd de fluorescerende proteïne Venus gekloond in een gemodificeerd iav PR8 NS-segment dat de twee virale eiwitten ns1 en nep codeert uit één transcript32,36,41,54, 57. Daartoe werd Venus gefuseerd tot de C-terminal van NS1 en de gehele NEP ORF werd stroomafwaarts gekloond van de PTV 2A decolleté site die werd geplaatst tussen de NS1-Venus en de NEP sequenties (Figuur 1). Uiteindelijk werden deze twee gemodificeerde ha en NS virale plasmide constructies gebruikt in combinatie met de rest van de iav PR8 reverse genetics plasmiden om birflu te genereren (Figuur 1). De in vitro en in vivo karakterisering van BIRFLU is eerder beschreven55.
In Figuur 2hebben we in vitro birflu gekarakteriseerd door de expressieniveaus van Venus, NLUC en NP te bepalen met behulp van fluorescentie en indirecte immunofluorescentie benaderingen (Figuur 2a, B). De confluente monolagen van MDCK-cellen waren ofwel mock-geïnfecteerd of geïnfecteerd (MOI 0,1) met WT-of birflu PR8 virussen en bij 18 uur na de infectie werd de Venus expressie direct geëvalueerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (Figuur 2a, B). Nluc (Figuur 2a) en NP (Figuur 2b) expressie werden gevisualiseerd door middel van indirecte immunofluorescentie met antilichamen die specifiek waren voor elk eiwit. Zoals verwacht, Venus en Nluc uitdrukking werden gedetecteerd alleen in cellen geïnfecteerd door BIRFLU en niet in cellen geïnfecteerd door WT PR8 virus. Bovendien, indirecte immunofluorescentie microscopie onthuld NP expressie in zowel WT en BIRFLU PR8-geïnfecteerde cellen. Geen expressie van Venus, Nluc of NP werden gedetecteerd, zoals verwacht, in mock-geïnfecteerde cellen (figuur A, B).
Om de nluc-uitdrukkings niveaus in vitro te evalueren, werden MDCK-cellen geïnfecteerd (MOI 0,001) met WT-of birflu PR8 virussen en nluc-activiteit in weefselkweek supernatanten werd beoordeeld op 24, 48, 72 en 96 h post-infectie (figuur 2c). Alleen nluc activiteit werd ontdekt in weefselkweek supernatanten van MDCK cellen geïnfecteerd met birflu (figuur 2c). Activiteit van nluc in de weefselkweek supernatanten werd gedetecteerd al 24 h na infectie met hogere expressieniveaus bij 96 h na infectie, hoogstwaarschijnlijk omdat het cytopathische effect (CPE) geïnduceerd tijdens virale infectie het nluc-eiwit behouden in de cel. Om de geschiktheid van de birflu in gekweekte cellen te evalueren, werden groei kinetiek van WT en birflu PR8 virussen ook geëvalueerd (figuur 2D) en de aanwezigheid van infectieuze virus in weefselkweek supernatanten werd bepaald door immuunfocus assay (figuur 2D ). Met name, BIRFLU replicatie kinetiek waren vergelijkbaar met die van WT PR8 virus, hoewel BIRFLU replicatie was enigszins vertraagd en niet bereiken dezelfde virale Antilichaamtiters als WT PR8. BIRFLU was echter in staat om Antilichaamtiters van 5 x 107 Pfu/ml (figuur 2D) te bereiken, wat aangeeft dat de uitdrukking van twee reporter genen in het virale genoom niet significant INTERFEREERT met de BIRFLU replicatie in MDCK-cellen.
Het volgen van de BIRFLU infectie bij muizen (Figuur 3 en Figuur 4)
Figuur 3 is een schematisch stroomdiagram voor de beoordeling van de birflu dynamiek in een muismodel van iav-infectie. Vijf-tot-zeven weken oude vrouwelijke BALB/C muizen waren ofwel mock-geïnfecteerde met 1x PBS of geïnfecteerd met 1 x 106 Pfu van birflu intra-tranasaal. Op 3 dagen na de infectie werden muizen verdouseerd met Isofluraan en vervolgens geïnjecteerd met Nluc-substraat retro-orbitaal. Alle muizen werden onmiddellijk in het IVIS-instrument geplaatst en het Nluc-signaal werd in vivo beoordeeld met behulp van het IVIS. Vervolgens werden muizen geëerd en longen geoogst. De uitblinkte longen werden vervolgens ex vivo geanalyseerd met behulp van de in vivo Imager om de intensiteit van de fluorescentie via Venus expressie te bepalen. Ten slotte werden muizen longen gehomogeniseerd en werden virale Antilichaamtiters en stabiliteit bepaald door plaque assay. Plaques werden beoordeeld door de directe fluorescentie van Venus, door immunokleuring met antilichamen specifiek voor Nluc en door kristalviolet kleuring.
Eerder beschreven replicatie-bevoegde reporter-uitdrukken van IAVs Express een single reporter gen, meestal ofwel een fluorescerende of een bioluminescente eiwit, als surrogaat voor virale infectie en replicatie. Echter, BIRFLU, is in staat om beide soorten reporter genen uit te drukken op virale infectie. Om de correlatie tussen bioluminescentie (in vivo imaging) en fluorescentie (ex vivo imaging) na de BIRFLU infectie te beoordelen, waren vijf tot zeven weken durende vrouwelijke BALB/c-muizen met een mock-besmetting met 1x PBS of geënt met BIRFLU (106 Pfu) intranasaal . Nluc activiteit (figuur 4a) werd geëvalueerd door toediening van nluc substraat geïnjecteerd retro-orbitaal op 3 dagen na infectie met behulp van een in vivo beeld instrument. We kozen ervoor om te evalueren bioluminescentie op dag 3 omdat eerdere studies aangegeven dat iav-replicatie, met inbegrip van PR8, pieken tussen de dagen 2 en 4 post-infectie24,54. Bioluminescentie werd gemonitord (Fig. 4a, boven) en gebruikt om de gemiddelde totale flux (flux (Log10 p/s) (Fig.4a, onder) te berekenen. Zoals voorspeld, geënt muizen met BIRFLU weergegeven hoge bioluminescentie activiteit, maar geen signaal werd gedetecteerd in mock-geïnfecteerde muizen. Daarna werden de longen van geïnfecteerde muizen geoogst en werd de Venus expressie beoordeeld met ex vivo imaging (figuur 4b, boven). Bovendien werd de gemiddelde stralings efficiëntie van de fluorescentie berekend (figuur 4b, onder). De uitblinkte muizen longen werden ook gehomogeniseerd om de virale Antilichaamtiters en de genetische stabiliteit van de BIRFLU in vivo te bepalen (figuur 4c, D). De genetische stabiliteit van de VOGELGRIEP werd geanalyseerd via plaque assay met behulp van de virussen geïsoleerd uit muizen longen en fluorescerende microscopie (Venus, top), immunokleuring (Nluc, Middle) en Crystal Violet kleuring (onder). BIRFLU herstelde van muizen longen kon plaques vormen en drukt stabiel beide reporter genen uit (figuur 4c). Met name observeerden we een goede correlatie tussen bioluminescentie en fluorescentie signalen met virale replicatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van IAV PR8 WT en BIRFLU virion structuur en genoom segmenten. IAV worden omgeven door een lipide-dubbellaag met de twee belangrijkste virale glycoproteïnen hemagglutinine (HA; zwart) en neuraminidase (NA; blauw). IAV bevatten acht enkel-streng, negatief-Sense, RNA segmenten (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, en NS). Elk virale segment bevat niet-coderende regio's (NCR) aan de uiteinden 3 ' en 5 ' (zwarte dozen). Ook op het 3 ' en 5 ' uiteinde van de virale (v) Rna's zijn de verpakkings signalen, verantwoordelijk voor de efficiënte encapsidatie van Vrna's in ontluikende virionen (witte dozen). IAV PR8 HA en NS virale segmenten en producten zijn in het zwart aangegeven. Sequenties van Nluc, Venus en PTV 2A zijn respectievelijk aangegeven in de vakken rood, groen en gestreept. Ook de schematische weergave van de gewijzigde HA-en NS-segmenten die respectievelijk Nluc en Venus uitdrukken in BIRFLU, is geïndiceerd. Dit cijfer is aangepast van Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Figuur 2: in vitro karakteriseren van de vogelgriep. (a, B) Analyse van eiwit expressie door directe fluorescentie en immunofluorescentie. MDCK-cellen waren mock-geïnfecteerd of geïnfecteerd (MOI 0,1) met PR8 WT of BIRFLU virussen. Geïnfecteerde cellen werden vastgesteld op 18 h na infectie om de Venus uitdrukking direct te visualiseren door directe fluorescerende microscopie en om Nluc (A) en virale NP (B) expressie te visualiseren met behulp van specifieke antilichamen en indirecte immunofluorescentie. Nuclei waren bevlekt met DAPI. Representatieve afbeeldingen (vergroting van 20x) worden weergegeven. Schaal staven = 100 μm. (C, D) Groei kinetiek van PR8 WT en BIRFLU. Activiteit van nluc (C) en virale Antilichaamtiters (D) in weefselkweek supernatanten van MDCK cellen geïnfecteerd (MOI 0,001) met WT en birflu PR8 virussen werden beoordeeld op de aangegeven tijdstippen na infectie. Gegevens vertegenwoordigen het middel ± SD van triplicaten. Virale Antilichaamtiters werden bepaald door immuunfocus assay (FFU/mL). Gestippelde lijn staat voor de aantoonbaarheidsgrens (200 FFU/ml). Dit cijfer is aangepast van Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Figuur 3: schematische weergave van de studie van de vogelgriep bij muizen. Uitdrukking van Nluc en Venus reporter genen werd geëvalueerd bij muizen geïnfecteerd met 1 x 106 Pfu van birflu met behulp van in vivo of ex vivo beeldvorming. Kort, op dag 1, 5 tot 7 week-oude vrouwelijke BALB/c muizen waren mock-geïnfecteerde (1x PBS) of geënt met 1 x 106 Pfu van birflu intranasally. Op dag 3 na infectie werden muizen mild verdouseerd met behulp van Isofluraan en Nluc substraat werd retro-orbitaal geïnjecteerd. Het nluc-signaal werd direct beoordeeld met behulp van in vivo beeldvorming. Onmiddellijk na de beeldvorming werden muizen geëveniseerd en werd de uitdrukking van Venus in de gehele, uitblinkte longen geanalyseerd met ex vivo beeldvorming. Herstelde muizen longen werden gehomogeniseerd om virale replicatie en stabiliteit te evalueren door plaque test. Pijlen geven correlatie aan tussen fluorescentie (Venus), immunokleuring (Nluc) en kristalviolet kleuring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Figuur 4: in vivo bioluminescentie en fluorescentie expressie. Vrouwelijke vijf-tot-zeven weken durende BALB/c muizen waren met een mock-geïnfecteerde (1x PBS) of geënt met 1 x 106 Pfu van de birflu intranasally. Na infectie van dag 3 werd de Nluc-activiteit (a) in de hele muis bepaald. Representatieve afbeeldingen van één muis met een stralende schaal (p/sec/cm2/SR). De stralingswaarden van bioluminescentie werden gekwantificeerd en de gemiddelde totale flux wordt weergegeven (flux (Log10 p/s). Na Nluc Imaging werden longen geoogst voor ex vivo imaging (B). Representatieve Foto's uit hele longen worden weergegeven. Om Venus uitdrukking te kwantificeren, werden de gemiddelde waarden van de interessegebieden (ROIs) genormaliseerd naar Long auto-fluorescentie van mock-geïnfecteerde muizen en vouwen veranderingen werden berekend. Om de genetische stabiliteit van de BIRFLU in vivo te analyseren, werden bij muizen longen herstelde virussen geanalyseerd door plaque assay met behulp van fluorescerende microscopie (Venus, top), immunokleuring (Nluc, Middle) en Crystal Violet kleuring (onder) (C). Representatieve afbeeldingen van één muis worden weergegeven. Om de virusreplicatie te evalueren, werden hele longen gehomogeniseerd na beeldvorming en gebruikt om MDCK-cellen te infecteren en virale Antilichaamtiters te bepalen met plaque assay (PFU/mL) (D). Pijlen geven correlatie aan tussen fluorescentie (Venus), immunokleuring (Nluc) en kristalviolet kleuring. Staven vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van Long virus titers. Dit cijfer is aangepast van Logales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Media en oplossingen voor weefselkweek</td>
			<td>Samenstelling</td>
			<td>Opslag</td>
			<td>Gebruiken</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Weefselkweek media: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% Penicillaire-streptomycine-L-glutamine (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 mL FBS en 5 mL 100x PSG.</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Onderhoud van MDCK-cellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Post-infectie media: dmem 0,3% Runderalbumine (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% Ba 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA en 5 ml 100x PSG</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Onderhoud van MDCK-cellen na virale infectie</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td>
			<td>80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g van na2HPO4. 7h2O, 2 g van KH2po4. Voeg ddH2O toe tot 1 L. Pas de pH aan 7,3</td>
			<td>Kamertemperatuur</td>
			<td>1x PBS voorbereiden</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>Verdun 10x PBS met ddH2O</td>
			<td>Kamertemperatuur</td>
			<td>Wash cellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Infectie media: 1x PBS, 0,3% BA, 1% penicilline-streptomycine (PS) (PBS/ba/PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS steriel, 4,2 mL 35% BA en 5 ml 100x 1% PS (100 U/mL)</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Virale infecties</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Fixatie/permeabilization oplossing: 4% formaldehyde, 0,5% Triton X-100 verdund in 1x PBS.</td>
			<td>400 mL neutraal gebufferde formaline 10%, 5 ml Triton X-100 en 595 mL 1x PBS</td>
			<td>Kamertemperatuur</td>
			<td>Fix en permeabilization van MDCK cellen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Blokkerende oplossing: 2,5% boviene serum albumine (BSA) in 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g BSA in 97,5 mL 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Blokkerende oplossing voor immunofluorescentie en plaque-assays.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antilichaam verdunnings oplossing (1% BSA in 1x PBS)</td>
			<td>1 g BSA in 99 mL 1x PBS</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>Verdunning van primaire en secundaire antilichamen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% Kristalvioletoplossing</td>
			<td>1 g kristalviolet in 400 mL methanol. Voeg 600 ml ddH2O toe</td>
			<td>Kamertemperatuur</td>
			<td>Kleuring van MDCK-cellen in plaque-assays.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonyl-fenylalanyl-chlooromethylketone (TPCK)-behandelde trypsine</td>
			<td>Bereid een 1, 000x stockoplossing bij 1 mg/mL in ddH2O</td>
			<td>-20 °C</td>
			<td>Voor virale infecties.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: weefselkweek media en oplossingen.

Influenza A virussen (IAVs) zijn besmettelijke respiratoire pathogenen die jaarlijkse epidemieën en occasionele pandemie veroorzaken. Hier beschrijven we een protocol voor het opsporen van virale infecties in vivo met behulp van een roman recombinant plaats en fluorescentie-uitdrukken van bi-reporter iav (birflu). Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekend hulpmiddel om IAV in vivo te bestuderen.

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Onderzoekers hebben eerder gegenereerd recombinant influenza virussen die ofwel fluorescerende of bioluminescente eiwit verslaggevers uitdrukken. Een deel van onze enige expressie van reporter genen in influenza virus ernstig beperkt het gebruik ervan in experimenten. Ons protocol beschrijft het gebruik van bireporter influenza virus dat zowel fluorescerend als bioluminescent reporter genen uitdrukt, en dus overtreft de beperking ervan.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van één recombinant influenzavirus voor in vitro en in vivo studies. Bij het uitvoeren van deze techniek is een snelle injectie van luciferase substraat en een goede planning van muizenbehandeling belangrijk, omdat het substraat snel wordt gemetaboliseerd. Ook wordt het scheren van muizen aanbevolen om de detectie van bioluminescent signaal te verbeteren.Om de muizen te infecteren, begin met het voorbereiden van de BIRFLU in 1X PBS. Houd het virus op ijs tot inenting. Controleer op de afwezigheid van de teenknijpreflex om ervoor te zorgen dat de muis verdoofd is en inentuleer deze intranasaal met de voorbereide BIRFLU verdunning.Zorg ervoor dat alle muizen goed ademen voordat ze terugkeren naar hun kooien. Open de beeldsoftware en druk op Initialiseren en stel vervolgens de parameters in die voor de beeldvorming worden gebruikt. Om de muizen die besmet zijn met BIRFLU te controleren, scheert u hun borst om de detectie van het bioluminescente signaal te verbeteren.Zodra de muizen zijn verdoofd, gebruik dan een 22-meter naald om retro-orbitaal toedienen 100 microliters van Nluc luciferase substraat, verdund een tot 10 in PBS. Plaats de dieren onmiddellijk na de injectie in de isolatiekamer met hun borst naar boven gericht. Plaats vervolgens de isolatiekamer in het beeldinstrument, sluit de deur en verwerf beelden.Na beeldvorming, breng de muizen terug naar hun kooien en controleer ze totdat ze volledig hersteld zijn. Gebruik de imaging software ROI tool om de verworven bioluminescentie gegevens te analyseren door het aanwijzen van een regio van belang en klikken maatregel. Om ex vivo beeldvorming van muislongen uit te voeren, verzamelt u de longen volgens de aanwijzingen van het manuscript, start u de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en stelt u de parameters voor beeldvorming in.Zodra de machine is geïnitialiseerd, plaats de longen in een zwarte achtergrond lade, en ervoor te zorgen dat de weefsels worden gescheiden van elkaar. Introduceer de lade in de imager, sluit de deur en verwerf afbeeldingen. Na beeldvorming, verwijder de weefsels onmiddellijk en bewaar ze op ijs op vier graden Celsius als de monsters zullen worden verwerkt op dezelfde dag.Als ze later worden verwerkt, vries ze snel in een buis op droogijs, en bewaar ze op 80 graden Celsius. Als u de afbeeldingen wilt verwerken, selecteert u het hulpprogramma ROI, trekt u interessegebieden rond elk van de afzonderlijke longen en klikt u op meten. BIRFLU is in vitro gekenmerkt door het bepalen van Venus, Nluc en NP expressieniveaus in geïnfecteerde cellen.Venus en Nluc expressie worden alleen gedetecteerd in cellen besmet met BIRFLU, terwijl NP wordt uitgedrukt in zowel wild-type PR8 en BIRFLU-geïnfecteerde cellen. Er wordt geen expressie waargenomen in met de nep geïnfecteerde cellen. Bovendien is de Activiteit van Nluc gemeten in weefselkweeksupernatants op 24, 48, 72 en 96 uur na infectie.Het wordt gedetecteerd zo vroeg als 24 uur na infectie, en de expressie niveaus toenemen op 96 uur. Het kan ook worden aangetoond dat replicatiekinetiek van BIRFLU vergelijkbaar is met het wild-type PR8-virus. BIRFLU heeft de mogelijkheid om zowel fluorescerende als bioluminescente reportergenen uit te drukken, en de correlatie tussen de twee kan worden beoordeeld met behulp van in vivo en ex vivo beeldvorming van een muislong.De longen van muizen besmet met BIRFLU vertoonde hoge bioluminescentie in vivo en fluorescentie ex vivo. Virale titers en genetische stabiliteit van BIRFLU in vivo zijn ook vastgesteld. Plaque testen op de virussen uit de muis longen bleek dat het virus plaques kan vormen en uitdrukken beide verslaggever genen.BIRFLU kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van antivirale en neutraliserende antilichamen tegen influenza te evalueren. De output van deze tests waren allemaal gecorreleerd met elkaar en zijn snel en gemakkelijk te doen.

a-luciferase-fluorescent-reporter-influenza-virus-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan ​​om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan ​​om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte...

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Bron: Garcia, V., et al. High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).Deze video demonstreert de bereiding van celkweekmonsters om de virale load te bepalen met behulp van een luciferase-gebaseerde assay. Er wordt een overzicht gegeven van het proces van het infecteren van epitheelcellen met een genetisch gemodificeerd virus, het overbrengen van virale supernatanten en standaarden naar assay-wells, en het bevorderen...

Monsterpreparatie voor luciferase-gebaseerde virale kwantificering

This video demonstrates a method to track viral infections in mouse models using a recombinant luciferase and fluorescence protein-expressing bi-reporter Influenza A virus. This method enables both in vivo and ex vivo studies, enabling researchers to gain insights into viral dynamics and the effects of interventions.

A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Dit artikel presenteert een methode op basis van luciferase-expressie met hoge doorvoer voor het titreren van verschillende RNA- en DNA-virussen met behulp van geautomatiseerde en handmatige vloeistofbewogen.

High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Dit protocol beschrijft de dynamiek van virale infecties met behulp van luciferase- en fluorescentie-expresserende recombinant (r)SARS-CoV-2 en een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) in K18 hACE2 transgene muizen om de behoefte aan secundaire benaderingen te overwinnen die nodig zijn om SARS-CoV-2-infecties in vivo te bestuderen.

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

Leer hoe je BIRFLU gebruikt voor het volgen van Influenza A-virusinfecties in muizen met luciferase- en fluorescentie-reporters. Deze methode maakt zowel in vitro als in vivo analyse van virale dynamiek en antivirale effectiviteit mogelijk.

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Meer video's verkennen