Presynapse vorming assay met Presynapse Organizer kralen en "neuron Ball" cultuur

Dit protocol is geschikt om te onderzoeken waar presynaptische eiwitten vandaan komen: cellichamen of axonen. En hoe presynaptische eiwitten zich ophopen in presynapses op een georganiseerde manier tijdens de synapsvorming. Deze techniek kan duizenden presynapses tegelijkertijd veroorzaken, en gebruikt geen speciaal apparaat om axonen in cultuur te handhaven toestaand efficiënte analyse van de vorming van vele presynapses in axonen.

Samen met afgestudeerde student, Honami, het aantonen van deze procedure zal Rie Ishii, een student in mijn laboratorium. Begin deze procedure met muis euthanasie zoals beschreven in het tekstprotocol. Ontleed de buik om E16 embryo's te verkrijgen.

Verwijder de hersenen voorzichtig uit embryo's met behulp van fijngepunte tangen en breng ze over naar 60-millimeter celkweekschotels met vier milliliter HEPES gebufferde zoutoplossing of HBSS. Verwijder de hersenvliezen en snijd de olfactorische bol. Scheid cortices van elke hersenhelft met behulp van de fijne uiteinden van tangen onder de stereomicroscoop en over te dragen aan een andere 60-millimeter schotel met verse HBSS.

Gebruik ten minste drie tot vijf embryo's voor elke afzonderlijke neuron bal cultuur. Snijd de cortices in kleine stukjes met microdissecting lente schaar in een laminaire stroom cel cultuur kap. Breng gehakte cortices over naar een buis van 15 milliliter.

Probeer de gehakte cortices in vier milliliter van 0,125% trypsine in HBSS gedurende 4,5 minuten in een waterbad bij 37 graden Celsius. Breng de celaggregaten over naar een nieuwe buis van 15 milliliter met 10 milliliter HBSS door een steriele transferpipet. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten voor het herhalen van deze stap nog een keer.

Breng vervolgens de celaggregaten over naar een nieuwe buis van 15 milliliter met twee milliliter NGB-medium, 0,01%DNase I en 10%paardenserum. Triturate de trypsinized cortices door herhaaldelijk pipetten ze op en neer drie tot vijf keer met behulp van een brandgepolijste fijn glas Pasteur pipet. Voor de voorbereiding van neuron ballen, pas de celdichtheid in de cel suspensie tot een miljoen cellen per milliliter met behulp van NGB medium.

Voeg zeven milliliter PBS toe aan het onderste deel van de kweekgerechten. Kweek de corticale neuronen als 10 microliter hangende druppels met 10.000 cellen per druppel in de bovenste deksels van 10-centimeter cultuurschotels. Bewaar de gerechten drie dagen in een couveuse bij 37 graden Celsius met 5% CO2 onder bevochtigde omstandigheden om neuronbalvorming mogelijk te maken.

Coat poly-L-lysine of PLL op de paraffine-kralen glazen deksel slips in 60-millimeter schotels met behulp van een 15 microgram per milliliter PLL oplossing in borate buffer. Bewaar ze minstens een uur in een CO2-incubator op 37 graden Celsius. Breng na het wassen vier keer met PBS de PLL-gecoate afglijders over naar een vierputige plaat met 350 microliter ngb-medium met drie micromolar AraC in elke put.

AraC wordt toegevoegd aan de media om delende cellen te doden. Incubeer de vier-put platen met de PLL-gecoate deksel glijdt in de CO2 incubator gedurende ten minste 20 minuten om ervoor te zorgen dat de temperatuur van het medium bereikt 37 graden Celsius voor de overdracht van de neuron ballen. Bij DIV 3 wanneer neuron ballen worden gevormd zeer goed, breng ze op PLL-gecoate cover slips.

In de vier-put plaat, voeg vijf neuron ballen per goed. Bij DIV 11 brengen 20 microliter van de suspensie van met streptavidin gecoate magnetische deeltjes naar een microcentrifugebuis. Immobiliseer de kralen op een handgemaakt apparaat bevestigd met neodymium permanente magneten en was drie keer met 100 microliter pbs-MCBC in 1,5-milliliter microcentrifugebuizen.

Na het volledig verwijderen van PBS-MCBC uit de kralen, voeg een vooraf bepaald volume van LRRTM2 voorraad aan de gewassen kralen. Incubeer het mengsel met behulp van een rotator op vier graden Celsius gedurende een tot twee uur. Na incubatie, was de kralen twee keer met 100 microliters van PBS-MCBC.

Was vervolgens de kralen met 100 microliter van NGB-medium. Resuspend de LRRTM2 kralen in 50 microliters van NGB medium voor toepassing op de neuron bal cultuur. Knip nu het uiteinde van een gele punt onder een hoek van 45 graden met een scheermesje onder de stereomicroscoop.

Zet de gele punt einde op de cel lichaam gebied van een neuron bal en verwijder de cel lichamen door zuigkracht. Breng de LRRTM2 en controle kralen op de neuron bal cultuur. Vervolgens dompel de kralen aan de onderkant van de platen van de neuron bal cultuur voor een minuut met behulp van ferriet magneten om pre-synaps vorming te starten.

Deze procedure zorgt ervoor dat alle kralen tegelijkertijd worden ge touchdown. Fix en vlek van de neuronen in de neuron bal cultuur na pre-synaps vorming met kralen zoals beschreven in het tekstprotocol. Leg differentiële interferentiecontrast- en immunofluorescentiebeelden vast onder een omgekeerde fluorescerende microscoop met een gekoelde CCD-camera met behulp van een 60X olieonderdompelingslens.

Meet de immunofluorescentieintensiteit in pre-synapsen in de axon. Gebruik immunofluorescentieintensiteiten van het interessegebied op kralen. Minus de off kralen regio intensiteit gedeeld door de axonale intensiteit, langs 20 micron van de kralen.

Minus achtergrondintensiteit. Deze ratio-intensiteit zorgt voor de eiwitaccumulatie-index. Als u het accumulatieniveau van een bepaald eiwit in een presynapse wilt kwantificeren die is geïnduceerd met LRRTM2-kralen, selecteert u altijd het gebied dat twee gezichtsvelden of meer is, afgezien van het cellichaam.

Kies voor nauwkeurige meting vijf verschillende axonale velden per coverslip. Hier is de toepassing van LRRTM2 kralen in neuron bal cultuur op DIV 11 geïnduceerde accumulatie van Munc18-1 in presynapses van axonen van neuron ballen. De kralen op axonen van neuron ballen zijn zichtbaar in de fase microscopie beelden.

En de accumulatie van presynaptische eiwitten wordt waargenomen door de immunofluorescentiebeelden. Zelfs in axonen die worden verwijderd cellichamen, accumulatie van Munc18-1 werd waargenomen onder de kralen, vergelijkbaar met axonen van neuron ballen met cellichamen. Toen het perifere gebied van het axonale blad werd geanalyseerd door hoge vergroting objectieve lens, vGlut1 en Munc18-1 duidelijk verzameld in presynapses van axonen onder de kralen met en zonder cellichamen.

Time course experimenten toonden aan dat de accumulatie van vGlut1 in presynapses aanzienlijk steeg met 30 minuten. Aan de andere kant, Munc18-1 accumulatie begon aanzienlijk te verhogen op twee uur en bereikte een plateau op vier uur. Deze gegevens geven aan dat het synaptische blaasje eiwit vGlut1 zich ophoopt in presynapses eerder dan het actieve zone-eiwit Munc18-1.

De Munc18-1 accumulatie in presynapses van Fmr1-KO neuronen steeg 1,5 keer meer dan die in het wild type, wat wijst op betrokkenheid van FMRP in Munc18-1 accumulatie. Eiwitsynthese remmer, anisomycine, onderdrukt de Munc18-1 accumulatie aanzienlijk in axonen met en zonder cellichamen. Dit geeft aan dat de accumulatie eiwitsynthese afhankelijk is.

Pipetten van de trypsinized cortices met behulp van een brandgepolijst fijn glas Pasteur pipet is een belangrijke stap. Experimentatoren bereiden de vuurgepolijste pipetten met twee tot drie verschillende diameters, en kozen voor een pipet met een passende diameter. Met behulp van deze procedure wordt synaptische afgifte van presynapses veroorzaakt door LRRTM2-kralen gemeten door middel van live beeldvorming.

Deze aanvullende methode zou beantwoorden of eiwitsynthese in axonen betrokken is bij de regulering van synaptische afgifte. Met behulp van deze methode onderzoeken onderzoekers hoe presynaptische eiwitten zich op een georganiseerde manier ophopen in presynapses, evenals de locatie van de bron van presynaptische eiwitten.