Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoom is een zeldzame vorm van weke delen sarcomen histologisch gekenmerkt door weefselmorfologie en de expressie van myogene markers. Echter, gezien het bestaan van verschillende subtypes van deze tumoren en de heterogeniteit van de stimuli die bijdraagt aan de vorming ervan, is de identificatie van de cel van oorsprong zeer uitdagend geweest. Hier beschrijven we reproduceerbare en betrouwbare methoden voor de identificatie van de cel van oorsprong van rhabdomyosarcomen vanaf vers oogst tumorweefsels van muizen en deze test is de tumorsfeer vorming test.

De belangrijkste voordelen van tumorsfeer vorming test is dat het afhankelijk is van cellulaire eigenschappen waarvan bekend is dat aanwezig zijn in tumor-oorsprong cellen en het kan ook worden gebruikt voor uitbreiding en verrijking van de specifieke celpopulatie. Bovendien bootst de sferoïde structuur de tumoromgeving na, zodat ze kunnen worden gebruikt als drugscreeningstudies. Deze methode heeft het potentieel om te worden toegepast op anderen type tumoren, omdat het niet vereist voorkennis van moleculaire markers, maar het kan optimalisatie van de cultuur voorwaarden vereisen.

Tumorsfeer kan enige tijd duren om te vormen, vooral als het proberen om een zeldzame celpopulatie in uw tumor te identificeren. Het wordt dus niet voorgesteld om elke dag naar je subcultuurplaat te kijken, omdat het de resultaten van je experimenten negatief kan beïnvloeden. Begin met het opwarmen van een plaat van 10 centimeter met vijf milliliter isolatiemedia in een couveuse bij 37 graden Celsius.

Weeg 500 tot 1.000 milligram van het tumorweefsel af en leg het in de plaat. Breng de plaat met het tumorweefsel naar een steriele kweekkap en maak er gehakt van met een scheermesje. Voor een optimale vertering, zorg ervoor dat de maten van de gehakte stukken uniform zijn.

Breng het gehakte weefsel en celisolatiemedia over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Was de plaat met nog eens vier milliliter media en voeg dat toe aan de buis. Voeg 700 eenheden per milliliter collagenase oplossing aan de buis en uitbroed het in een schudden waterbad op 37 graden Celsius voor 1 1/2 uur.

Na de incubatie, draai het weefsel op 300 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet, dan resuspend de pellet in 10 milliliter van de tweede spijsvertering oplossing en incubaal in het schudden water bad voor 30 minuten. Na de tweede spijsvertering, pipette de cel schorsing op en neer en geef het door middel van een 70-micrometer nylon filter op een 50-milliliter centrifuge buis.

Was vervolgens het filter met 10 milliliter celisolatiemedia en draai het weefsel vijf minuten lang op 300 keer g. Aspirate de supernatant en resuspend de pellet in 20 milliliter van tumorcel media. Breng de suspensie over naar een kweekplaat van 15 centimeter en plaats de cellen 's nachts in een couveuse van 37 graden Celsius.

Op de volgende dag, verander de media om puin en dode cellen die een negatieve invloed kunnen hebben op de overleving van cellen te verwijderen. Op dit punt, beoordeel cel samenvloeiing en laat de cellen groeien in de incubator totdat het bereikt 90%Monitor de cellen elke dag en verander de media om de twee dagen. Voor de afleiding van de tumorsfeer, gebruik cellen bij Passage P1 of P2 om celselectie door meerdere passages te vermijden.

Was de celschotel met PBS en bedek ze vervolgens met onthechtingsoplossing. Plaats ze in de couveuse voor vijf tot 10 minuten en bevestig vervolgens loslating door te kijken naar de plaat onder een helderveld microscoop. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voeg tumorcel media aan de plaat en de overdracht van de cel suspensie naar een centrifuge buis.

Draai de cellen vijf minuten naar beneden op 300 keer g, verwijder supernatant en zet de cellen opnieuw op in tumorsfeermedia. Nadat u de cellen opnieuw hebt gebruikt, telt u ze met Trypan-blauw en berekent u de celconcentratie. Plaats het juiste aantal cellen in een 96-well lage bevestigingsplaat en plaats de cellen in de couveuse tot het einde van het experiment, waarbij u ervoor zorgt dat de plaat niet wordt verstoord, tenzij de media worden aangevuld.

Na voltooiing van het experiment, identificeren tumorsferen handmatig onder een brightfield microscoop of met behulp van Celigo software. Het aantal en de grootte van de tumorsferen kunnen worden geëvalueerd als gevolg van deze test. Om tumorsferen voor te bereiden op allografttransplantatie, trek alle tumorsferen samen verkregen uit een specifiek celtype of behandeling.

Centrifugeer de tumorsferen en verwijder voorzichtig de supernatant met een pipet van één millimeter, gevolgd door een pipet van 200 microliter, en was ze vervolgens met 10 milliliter steriele PBS. Draai de tumorsferen weer naar beneden en aanzuigen de PBS. Voeg 500 microliter toe aan een milliliter celloslatingsoplossing bovenop de tumorsfeerpellet en broed de cellen in een schuddend waterbad bij 37 graden Celsius.

Controleer de progressie van de spijsvertering om de 10 minuten. Het hele proces duurt maximaal 30 minuten. Als de vertering van de tumorsfeer in het schudden waterbad is niet genoeg om een eencellige oplossing te verkrijgen, mechanische verstoring door pipetting op en neer wordt voorgesteld.

Merk op dat na het spinnen van de tumorsferen geen stabiele pellet vormen, dus het aspireren van de supernatant moet zorgvuldig worden gedaan met een pipet van één milliliter en pipetten van 200 microliter. Zodra een eencellige oplossing is verkregen, voeg een volume van tumorcel media en draai het naar beneden op 300 keer g gedurende vijf minuten op 4 graden Celsius. Na deze centrifugatie moeten alle volgende stappen op ijs worden uitgevoerd.

Resuspend de cellen in koude tumorcel media en tellen levende cellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting. Bepaal het juiste aantal cellen voor de allograft en verdun het in 50 microliters van koude tumorcelmedia. Plaats een pipet tip in koude tumorcel media om het te koelen en vervolgens gebruiken om 50 microliters van koude ECM oplossing te nemen en toe te voegen aan de buis met cellen, ervoor te zorgen niet om de ECM buis te verwijderen uit ijs tijdens dit proces.

Houd de cellen op ijs tot transplantatie en plaats een afgetopte, 0,5-milliliter insulinespuit met een 29-gauge naald op ijs. Nadat u heeft bevestigd dat de muis goed is verdoofd, scheert u de rechterkant van het dier, zuigt u de celoplossing in de afgekoelde spuit en injecteert u de cellen onderhuids in het geschoren gebied. Als de injectie correct wordt uitgevoerd, vormt zich een zichtbare bult onder de huid.

Dit protocol kan worden gebruikt om op betrouwbare wijze tumorsferen te vormen voor de identificatie van zeldzame celpopulaties die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van sarcoomontwikkeling met weke delen. Een fundamenteel onderdeel van deze test is discriminatie tussen tumorsferen en celclusters, die duidelijke morfologische verschillen vertonen. Om de optimale concentratie te bepalen waarbij een eiwit van belang een effect op tumorcellen teweeg brengt, is het noodzakelijk om het expressieniveau van de downstreamdoelen van het eiwit te beoordelen.

Drie van de geteste genen vertoonden een dosisafhankelijke reactie op recombinant eiwitbehandeling en één niet. Om een efficiënt protocol vast te stellen, werden de effecten van transfectie op inherente tumorcellen geanalyseerd;twee verschillende hoeveelheden reagens werden getest en de efficiëntie werd beoordeeld met een GFP-reporter plasmid. Lagere hoeveelheden reagens resulteerden in een hogere transfectie-efficiëntie.

Er moest een protocol in twee stappen worden geïmplementeerd om transfectie uit te voeren op cellen in suspensie. Transfectie werd uitgevoerd op aanhangende cellen en 24 uur later werden ze losgemaakt en verguld in suspensie;na zeven dagen, gecontroleerde tumorsferen waren het uitdrukken van GFP. Nadat tumorsferen zijn verkregen, behandeld en getransplanteerd is het mogelijk om het effect van deze verschillende behandeling in tumorgroei in vivo te vergelijken.

Deze methoden zullen wetenschappers in staat stellen om de nog bestaande vragen van de cel van oorsprong van rhabdomyosarcomen te beantwoorden en tegelijkertijd de basis te leggen voor drugsscreening.