Name: Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer hemolymfecollectie en inoculatie van Metarhizium blastosporen in Rhipicephalus microplus teken voor immunologisch onderzoek. Deze methode onthult cruciale inzichten in teken-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd deels gefinancierd door de Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoaal de nível Superior (CAPEs) uit Brazilië, Finance code 001. CAPEs mits Ph.D. Scholarship voor A.F. Marciano. Wij danken de nationale Raad voor wetenschappelijke en technologische ontwikkeling (CNPq) van Brazilië voor het verstrekken van Ph.D. beurs voor J. Fiorotti. Dit onderzoek werd ook ondersteund door subsidies van Carlos Chagas Filho Stichting voor onderzoek van de staat Rio de Janeiro (FAPERJ) en CNPq. V.R.E.P. Bittencourt is een CNPq onderzoeker.

Teken gebruikt in de huidige studie werden verkregen uit een kunstmatige kolonie, onderhouden aan de federale rurale Universiteit van Rio de Janeiro, welke methoden zijn goedgekeurd door de Commissie ethiek voor het gebruik van gewervelde dieren (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Tick engorged vrouwtjes
<ol><li>Na het tikken verzamelen, wassen engorged vrouwtjes met behulp van leidingwater en dompel ze in 0,5% (v/v) natrium hypochloriet oplossing voor 3 min in een 500 mL glas beker ontvanger, voor de cuticula hygiëne (Figuur 1), dan drogen alle vrouwen met steriele papieren handdoeken (figuur 2).</li>
	<li>Verdeel wijfjes in homogene gewogen groepen (met 20 wijfjes elk): één groep zonder enige behandeling, één controlegroep ingeënt met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v), en één besmet-groep geënt met 5 µ L bij 1,0 x 10 7 blastospores ml-1. Opmerking: alleen onbehandelde teken werden gebruikt voor volume en hemocyte concentratie. Er zijn drie replica's van elke groep uitgevoerd.</li>
</ol>2. ziekteverwekkers inenting tussen Scutum en capitulum
Opmerking: in de huidige studie, entomopathogene schimmel schorsingen werden gebruikt als een voorbeeld.
<ol><li>Suspendeer schimmel blastospores in 1 mL van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v) en stel in op een eindconcentratie van 1,0 x 107 blastospores ml-1. Voeg een hoeveelheid van 5 µ L anisopliae Blastospores (Figuur 3) suspensie toe aan het oppervlak van een plastic paraffine folie. Opmerking: anisopliae blastospores schorsing werd aangepast met behulp van een Neubauer ´ s kamer. Om het inentings proces te versnellen, kunnen meerdere bubbels worden toegevoegd aan het plastic paraffine folie oppervlak, elke zeepbel die overeenkomt met 5 µ L.</li>
	<li>Gebruik een 1 mL ultra-fijne insuline spuit en een 0,3 mm naald om de vering te trekken en inoculeren het in de teek. Vergeet niet om alle lucht uit de spuit te nemen voordat u het.</li>
	<li>Inoculeren 5 µ L van schimmel schorsing in de teek vrouwtje tussen de Scutum en capitulum. Inoculeren vrouwtjes uit de controlegroep met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v) zonder schimmel. Opmerking: een klein volume van hemolymph kan aanwezig zijn op het foramen na de naald inbrengen. Wees voorzichtig om niet inoculeren lucht.</li>
</ol>3. inenting van entomopathogene schimmels tussen het been dij en de teek vrouwelijk lichaam
<ol><li>Inoculeren wijfjes met schimmel suspensie (5 µ L bij 1,0 x 107 blastospores ml-1) tussen het been Tigh en het vrouwelijk lichaam, met behulp van een 1 ml ultra-fijne insuline spuit gekoppeld aan een 0,3 mm naald. Inoculeren wijfjes van de controlegroep met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v). Nota: wanneer anisopliae blastospores inenting tussen het been Tigh en het lichaam van het teken wijfje wordt uitgevoerd, kan een klein volume van hemolymph op de Tigh na de naald toevoeging aanwezig zijn. Wees voorzichtig om niet inoculeren lucht.</li>
</ol>4. dorsale hemolymph collectie
<ol><li>Gebruik het rubberen deel van een gevleugelde infusie set, een 0,3 mm capillaire buis, en een gefilterde tip om de hemolymph collectie uit te voeren.</li>
	<li>Verstoort de vrouwelijke dorsale cuticula met behulp van een 0,3 mm naald.</li>
	<li>Na verstoring, van toepassing zijn zachte druk op de voorste deel van de teek lichaam. Observeer een bijna transparante vloeistof te trekken uit de ontwrichting site. Verzamel de hemolymph door het zuigen van de vloeistof door de filter Tip gekoppeld aan het rubberdeel van een gevleugelde infusie set, en een 0,3 mm capillaire buis. Opmerking: druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks tijdens de immobilisatie, omdat dit kan verstoren de middendarm en vervuilen de hemolymph. Wacht tot de zachte druk kan de vloeistof te verdrijven zonder vervuiling.</li>
</ol>5. Hemolymph collectie van het teek been
<ol><li>Immobiliseren de teek, snijd een stuk van een voorpoot met een schaar. Opmerking: een of meer poten kunnen worden gesneden, evenals, hetzelfde been kan worden gesneden meer dan een keer.</li>
	<li>Breng zachte druk op de achterste lichaamsdeel van de teek. Observeer een transparante vloeibare zeepbel die verschijnt op de cut site en het verzamelen met de capillaire buis, zoals beschreven in stap 4,3. Opmerking: druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks tijdens de immobilisatie, omdat dit kan verstoren de middendarm en vervuilen de hemolymph. Wacht tot de zachte druk kan de vloeistof te verdrijven zonder vervuiling.</li>
</ol>6. Hemolymph verwerking
<ol><li>Na hemolymph collectie, deponeren in 1,5 mL microtubes eerder gevuld met 30 µ L protease cocktail en 82 µ L Saline buffer. Houd de microtubes op het ijs in de hemolymph collectie.</li>
	<li>Centrifugeer monsters (500 x g voor 3 min bij 4 °c). Een zachte pellet van hemocytes zal worden gevormd na hemolymph centrifugeren. Opmerking: voor hemolymph kwantificatie, kwantificeren van de hemolymph volume verkregen door het tellen van het totale volume in de micro tube en discontering het volume van protease cocktail en zoute buffer.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de bovendrijvende (Cell-Free hemolymph). Voorzichtig de cellen opnieuw op te schorten in, bijvoorbeeld, Leibovitz L-15 cultuur aangepast aan pH 7.0-7.2. Kwantificeren hemocytes door het plaatsen van 10 µ L van resuspended hemocytes in een Neubauer kamer.</li>
</ol>7. Hemocyte bemonstering dia voorbereiding
<ol><li>Snijd de teek voorpoot met een schaar.</li>
	<li>Breng zachte druk op de achterste lichaamsdeel van de teek. Observeer een transparante vloeibare zeepbel die verschijnt op de cut site.</li>
	<li>Breng de hemolymph druppels direct op schone Microscoop dia's, na die, gebruik de juiste methoden om de cellen vlek.<ol>
<li>Aan vlek hemocytes gebruikend Giemsa, lucht-droog de hemolymph op de dia 30 min, bevestig het bij kamertemperatuur met methanol voor 3 min, en vlek in Giemsa oplossing (1:9 verhouding van de bufferoplossing van Sorensen, pH 7,2) 30 min bij kamertemperatuur. Was de dia's met stromend water om de overmaat van kleurstof te verwijderen, lucht-droog de dia en evalueer de cellen bij 400x in een optische Microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Parasitologia+Veterin%C3%A1ria%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).</li>
<li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li>
<li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li>
<li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li>
<li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+C%3A+Toxicology+and+Pharmacolpgy%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li>
<li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+on+the+surface%3A+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li>
<li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li>
<li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium%3A+unveiling+hemocyte+quantification%2C+GFP-fungi+virulence%2C+and+ovary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li>
<li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li>
<li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+%26+Environmental+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li>
<li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNation%2C+JL+%22Insect+Physiology+and+Biochemistry%22">Insect Physiology and Biochemistry</a>. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).</li>
<li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%A9moires+de+l%27Acad%C3%A9mie+royale+des+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Torino%22%5BJournal%5D)">Mémoires de l'Académie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751(1848).</li>
<li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+waxing+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Journal+of+the+Mythic+Society%22%5BJournal%5D)">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li>
<li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+%28Homarus+americanus%29+and+the+European+lobster+%28Homarus+gammarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Research%22%5BJournal%5D)">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li>
<li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immunity+and+its+signaling%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Survival+Journal%22%5BJournal%5D)">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li>
<li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li>
<li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%2C+salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Inenting van ziekteverwekkers is nuttig wanneer de studie poogt de in vivo actie van micro-organismen in experimentele geleedpotige modellen te onderzoeken omdat het verzekert dat de ziekteverwekker binnen de gastheer is. De techniek kan ook worden toegepast op inoculeren moleculen zoals RNA interferentie (RNAi). De inenting tussen Scutum en capitulum wordt beschouwd als gemakkelijker uit te voeren maar vaak beschadigt Gené's orgaan, dat de eieren levensvatbaarheid12,1...

Het vee Tick, Rhipicephalus Microplus, is een Hematophagus ectoparasite met een enorme negatieve invloed op de veestapel in tropische gebieden. Deze teek is de vector van pathogene agentia zoals Babesia bovis, Babesia Bigemina, en Anaplasma marginale dat, in combinatie met de directe hemofeeding schade, kan verminderen melk en vleesproductie, bloedarmoede veroorzaken en uiteindelijk de dood. De verliezen die door dit ectoparasite worden veroorzaakt werden geschat in 3.240.000.000 dollars jaarlijks in Brazilië1. Er worden duurzame methoden geëist en het gebruik van entomopathogene middelen wordt beschouwd als een veelbelovend alternatief om het gebruik van chemische acariciden2,3,4te verminderen.
Entomopathogene schimmels, zoals anisopliae spp., zijn natuurlijke vijanden van geleedpotigen met inbegrip van teken, en sommige isolaten kunnen worden gebruikt als biocontroller. Deze pathogenen infecteren actief de gastheer door de cuticula en koloniseren hun lichaam2,5,6. Naarmate de infectie zich ontwikkelt, cellulaire en humorale reacties worden bemiddeld door de teek immuunsysteem. Analyse van de teek hemolymph wordt gerapporteerd als een nuttig instrument om het immuunsysteem reacties na de uitdagende met pathogenen7,8te evalueren.
De immune reactie van geleedpotigen is verdeeld in humorale en cellulaire reacties. De humorale reactie betreft hemagglutination processen en de productie van antimicrobiële eiwitten/peptiden, terwijl de cellulaire immuunrespons wordt uitgevoerd door de hemocytes. Deze cellen zijn aanwezig in de hemolymph van alle geleedpotigen en worden gerapporteerd aan een expressieve rol in studies met innate immune response9te ontwikkelen, want het is direct gerelateerd aan de fagocytose en inkapseling processen. Dienovereenkomstig, kunnen de studies over hemocytes helpen om doods weg te onderzoeken en processen zoals autophagy, apoptosis, en necrose te begrijpen. In sommige ongewervelden als tweekleppigen, de hemocytes ' collectie gezichten beperkingen zoals cel verstoring, lage hemolymph volume verkregen, en lage concentratie van teruggewonnen cellen10. Zeer vaak, afhankelijk van de toegepaste methodologie, verminderde concentratie van cellen wordt verkregen, invloed rechtstreeks op de cellen kwantificering en analyse.
Het aantal hemocytes dat in hemolymph circuleert is veranderlijk onder verschillende geleedpotigen en het kan in de zelfde soort veranderen toe te schrijven aan verschillende fysiologische stadia zoals geslacht, leeftijd, en ontwikkelingsstadium11van de geleedpotige. Hemocytes kan ook worden gevonden gerespecteerd voor sommige organen en worden vrijgegeven in het verkeer net na de infectie proces11. Niettemin, rapporteerden de meeste studies gebruik insecten, terwijl de tikken minder onderzocht betreffende hun fysiologie en pathologie blijven. Ondanks pathogeen inenting en hemolymph collectie in teken zijn minder gebruikte technieken, het vaststellen van standaard methoden helpt de ontwikkeling van meer accurate studies.
Het doel van deze studie was het vergelijken van de meest gebruikte methoden voor hemolymph inzameling en inenting van pathogenen in R. Microplus teken, het evalueren van de werkzaamheid in de hemolymph acquisitie en hemocytes concentratie.

<table><tbody><tr><td>Alkaline Hypochlorite-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Flexibele rubber</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa-kleurstof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Glas capillair</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-sering (naald)</td><td>BD</td><td>SKU:&nbsp;324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 kweekmedium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>BRAND</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-kamer&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Protease-remmercocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

het onthullen van hemolymph inzameling en inenting van anisopliae blastospores in rhipicephalus microplus teken naar ongewervelde pathologie studies

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Teken zijn verplicht bloedzuigende ectoparasieten en Rhipicephalus Microplus heeft groot belang in de veterinaire geneeskunde, omdat het veroorzaakt bloedarmoede, gewichtsverlies, afschrijving van de dieren ' leer en kan ook fungeren als een vector van verschillende pathogenen. Wegens de exorbitante kosten om deze parasieten te controleren, schade aan het milieu dat door het ongepaste gebruik van chemische acariciden wordt veroorzaakt, en de verhoogde weerstand tegen traditionele parasieten bestrijdingsmiddelen uit, alternatieve controle van tikken, door het gebruik van entomopathogene schimmels, bijvoorbeeld, is beschouwd als een interessante aanpak. Niettemin, hebben weinig studies aangetoond hoe het immuunsysteem van de Tik handelt om deze entomopathogens te bestrijden. Daarom demonstreert dit protocol twee methodes die voor entomopathogen inenting in engorged wijfjes en twee technieken worden gebruikt die voor hemolymph inzameling en hemocytes het oogsten worden gebruikt. Inenting van ziekteverwekkers bij de been toevoeging in het lichaam van de Tik wijfje laat evaluatie van wijfjes biologische parameters in tegenstelling tot de inenting tussen Scutum en capitulum, die vaak Gené's orgaan beschadigen. Dorsale hemolymph collectie leverde een hoger volumeherstel dan de collectie door de benen. Enkele beperkingen van Tick hemolymph verzameling en verwerking omvatten i) hoge tarieven van hemocytes ' verstoring, II) hemolymph besmetting met verstoorde middendarm, en III) lage hemolymph volumeherstel. Wanneer hemolymph wordt verzameld door het been snijden, de hemolymph kost tijd om zich ophopen op het been opening, ten gunste van de stollingsproces. Bovendien worden in de collectie via het been minder hemocytes verkregen in vergelijking met de dorsale collectie, ook al wordt de eerste methode als gemakkelijker uitgevoerd. Inzicht in het immuunsysteem reactie in teken bemiddeld door entomopathogene agenten helpt om hun pathogenese onthullen en ontwikkelen van nieuwe doelen voor Tick Control. De hier beschreven inentings processen vereisen zeer lage technologische middelen en kunnen niet alleen worden gebruikt om teken aan pathogene micro-organismen bloot te stellen. Evenzo kan de collectie van Tick hemolymph vertegenwoordigen de eerste stap voor veel fysiologische studies.

Dit artikel benadert inenting en hemolymph inzamelings methodes die op tikken worden toegepast. Na de inenting tussen de been dij en het lichaam van de teken wijfje, wat vloeistof (hemolymph) kan tijdens het proces worden uitgescheiden; Nochtans, is het belangrijk om op te merken dat wanneer de inenting wordt gebeëindigd, geen vloeistof of weefsels in de naald uiteinde of bij de inentings plaats aanwezig waren, ervoor zorgend dat de schimmel opschorting volledig werd ingeënt. Toen het ine...

Analyse van Tick hemolymph vertegenwoordigt een belangrijke bron van informatie over hoe sommige ziekteverwekkers ziekte veroorzaken en hoe teken immunologisch reageren op deze infectie. De huidige studie toont aan hoe inoculeren schimmel propagulen en het verzamelen van hemolymph van Rhipicephalus Microplus engorged vrouwtjes.

Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Teken zijn hetolfachtige ectoparasieten, Rhipicephalus microplus, in de volksmond bekend als de runderen teek heeft een enorme negatieve economische impact op het vee in tropische gebieden. Bovendien stimuleren toenemende bezorgdheid over aangetaste milieuomstandigheden en zorgen over de volksgezondheid als gevolg van oneigenlijk gebruik van chemische acariciden en toenemende weerstand van tekenpopulaties tegen traditionele parasieten onderzoek naar alternatieve bestrijdingsmethoden, zoals het gebruik van entomopathogene schimmels. Deze entomopathogenen infecteren actief geleedpotige gastheren, door hun cuticula en koloniseren hun lichaam.De geleedpotigen kunnen verschillende reacties hebben op de schimmelinfectie. Geleedpotige immuunsysteem is verdeeld in humorale en cellulaire reacties. De humorale reactie omvat hemagglutinatie proces en de productie van antimicrobiële moleculen, terwijl hemocyten bemiddelen de cellulaire immuunrespons.De meeste studies over geleedpotige immuunrespons worden gemeld met behulp van insecten, terwijl de tikreacties minder onderzocht blijven. Ook zijn pathogeneninenting en teek hemolymph collectie slecht wijdverspreide technieken die nodig zijn om beter te begrijpen van de immuunrespons van de geleedpotigen. Daarom is deze video adres technieken \ gebruikt om de inenting film, hemolymph collectie en verwerking.Aangezien teek hemocyten oogsten geconfronteerd met een aantal beperkingen, zoals cellen verstoring, lage hemolymph waarde verkrijgen, en lage concentratie van herstelde cellen. Direct infecteren op de configuratie en analyse van cellen. Na het verzamelen van teken, wassen engorged vrouwtjes.Gebruik kraanwater en dompel ze onder in 0,5% natrium hypochloriet oplossing gedurende drie minuten in een 500 milliliter glazen beker ontvanger. Voor cuticula hygiëne, verdeel vrouwtjes in homogene groepen met 20 vrouwtjes elk. Drie replica's van elke groep werden uitgevoerd.Metarhizium robertsii blastospores werden gebruikt in het inentingsproces. Voeg op een vloeistof van vijf microliters metarhizium blastospores suspensie aan het oppervlak van een plastic paraffine film. Om het inentingsproces te versnellen, kunnen meerdere bellen worden toegevoegd aan het plastic paraffinefilmoppervlak, elke bel die overeenkomt met vijf microliters.Gebruik een ultrafijne insulinespuit van 1 millimeter en een naald van 0,3 millimeter om een suspensie te plaatsen en in te enten in de teek. Vergeet niet om alle lucht uit de spuit te halen voordat u deze gebruikt. Inenting 5 microliter schimmel suspensie in het teek vrouwtje tussen het scutum en capitulum.Een klein volume van hemolymph kan aanwezig zijn op de framing na de naald incisie. Wees voorzichtig om geen lucht inenten. Inenting vrouwtjes met schimmel suspensie tussen het been dij en het lichaam van het vrouwtje met behulp van een een-milliliter ultra-fijne insulinespuit gekoppeld aan een 0,3 millimeter naald.Wanneer de metarhizium blastospores inenting wordt uitgevoerd tussen het been dij en het lichaam van de teek vrouw, een klein volume van hemolymph kan aanwezig zijn op de dij na de naald inbrengen. Wees voorzichtig om geen lucht inenten. Gebruik het rubberen deel van een gevleugelde infusie set een 0,3 miliimeter capillaire buis en een filter tip om de hemolymph collectie uit te voeren.Verstoor de vrouwelijke dorsale cuticula met een naald van 0,3 millimeter. Na verstoring een zachte druk uitoefenen op het voorste deel van het tekenlichaam. Observeer een bijna transparante vloeistofpooling uit de storingsplaats.Verzamel de hemolymph door het zuigen van de vloeistof door het filter tip gekoppeld aan een rubberen deel van een gevleugelde infuus set en een 0,3 millimeter capillaire buis. Druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks tijdens het immobilisatie, omdat dit de midgut kan verstoren en de hemolymph kan besmetten. Wacht tot zachte druk de vloeistof zonder besmetting kan verdrijven.Immobiliseer de teek. Snijd een stuk van een voorbeen. Een of meer benen kunnen worden gesneden en hetzelfde been kan meer dan een keer worden gesneden.Breng zachte druk op het achterste lichaamsdeel van de teek. Observeer een transparante vloeibare bel verschijnen op de gesneden kant en het verzamelen met de capillaire buis. Druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks, tijdens het mobiliseren, omdat dit kan verstoren de midgut en vervuilen de hemolymph.Wacht tot zachte druk de vloeistof zonder besmetting kan verdrijven. Na hemolymph collectie, deponeren in 1,5 mililiters microtube eerder gevuld met 30 microliter protease cocktail en 82 microliter zoutoplossing buffer. Houd de microbuisjes op ijs in de hemolymph collectie.Centrifuge monsters en de zachte pellet van hemocyten zal worden gevormd na hemolymph centrifugatie. Voor hemolymph kwantificering kwantificeert u het hemolymphvolume dat wordt verkregen door het totale volume in de microbuis te tellen en het volume van de proteasecocktail en de zoutbuffer te verdisconteren. Verwijder voorzichtig de bovenliggende celvrije hemolymph en schors de cellen voorzichtig opnieuw.Kwantificeer de hemocyten door 10 microliter opnieuw opgehangen hemocyten in de Neubauerkamer te plaatsen. Voor cellen opnieuw opschorting werd een cultuurmedia gebruikt. Snijd het voorbeen van de teek, druk op het achterste lichaamsdeel van de teek, observeer een transparante vloeibare bel op de snijplaats.Breng de hemolymph druppels direct op schone microscoop dia's. Gebruik daarna de juiste methoden om de cellen te bevlekken. Inenting tussen het been dij en teek vrouwelijk lichaam kan ook schade teek inwendige organen zoals midgut en de malpighian tubuli.Wanneer de teek midgut wordt verstoord door de naald bij de rug hemolymph collectie de verkregen vloeistof is rood, niet transparant. Dit duidt op een onjuiste hemolymph-verzameling. In dit geval moet hemolymph worden weggegooid omdat deze verontreinigd is.Hemolymph besmetting kan ook worden waargenomen wanneer de teek van nature besmet is met hoge ladingen ziekteverwekkers, of in de laatste stappen na het overlijdensproces veroorzaakt door ingeënte ziekteverwekkers. Het hemolymphvolume dat na de rugverzameling wordt verkregen, is hoger dan het volume dat bij de collectie via het been wordt verkregen. Ondanks de gemak van verontreiniging is hoger in de eerste collectie methode.De hemocytenconcentratie was ook aanzienlijk hoger bij de rugcollectie. Wanneer de juiste hemocyten collectie wordt uitgevoerd een goede uitstrijkje kan worden verkregen en het is mogelijk om verschillende hemocyten te onderscheiden na het bevlekken. Deze video gaf informatie over methoden om inenting van ziekteverwekker, specifiek entomopathogene schimmels, uit te voeren in teken en hun hemolymph te verzamelen.De hier gepresenteerde technieken vereisen zeer lage technologische middelen in onze klassieke stappen voor studies over tekenfysiologie, tekenpathologie en de immuunrespons van teken. De juiste oogst van de geleedpotige cellen, en cel-vrije hemolymph is van cruciaal belang om betrouwbare informatie voor latere studies veroorloven. Daarom is het ook belangrijk om bewust te zijn van de meest voorkomende fouten die worden waargenomen bij de uitvoering van deze technieken.Bovendien wordt in de voorstellen van dit onderzoek de geschiktere plaats voor het verzamelen van hemolymph bepaald door vervormen of snijden van de poten, rekening houdend met het verschil in het verkregen volume en de kans op besmetting.

disclosing-hemolymph-collection-inoculation-metarhizium-blastospores

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De ziekte van Lyme studies vereisen vaak generatie van de teken besmet met de ziekteverwekker Borrelia burgdorferi, een proces dat normaal gesproken duurt enkele weken. Hier laten we zien een micro-injectie-based tick infectie procedure die kan worden bereikt binnen enkele uren. We tonen ook aan een immunofluorescentie methode voor het in situ lokalisatie van B. burgdorferi in teken.

Methoden voor snelle overdracht en localisatie van Lyme pathogenen in de Tick Gut

De collectie van besmette teek hemolymfe, speekselklieren, en speeksel is van belang om te onderzoeken hoe door teken overgedragen pathogenen ziekte te veroorzaken. In dit protocol laten we zien hoe hemolymfe en speekselklieren te verzamelen uit de...

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

De ziekte van Lyme is de meest gerapporteerde vector overgedragen ziekte in Noord-Amerika. De verwekker, Borrelia burgdorferi is een spirocheet bacterie overgedragen door Ixodes teken. Transmissie en detectie van infectie bij diermodellen wordt geoptimaliseerd door het gebruik van teek voeding, die hier beschreven.

Voederen van Ticks on Animals voor Transmissie en Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijk en stoffelijk beoordelen de aanwezigheid van levensvatbare microbiota in de ingewanden van de teek met behulp van een gemodificeerde geheel-mount kruising in situ-aanpak.

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Het huidige protocol beschrijft de isolatie van microRNA's uit teken speekselklieren en gezuiverde extracellulaire blaasjes. Dit is een universele procedure die veelgebruikte reagentia en benodigdheden combineert. De methode maakt ook het gebruik van een klein aantal teken mogelijk, wat resulteert in hoogwaardige microRNA's die gemakkelijk kunnen worden gesequenced.

Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes

Elektroporatie is een snelle, breed toegepaste methode voor het introduceren van exogene DNA in het geslacht Rickettsia. Dit protocol biedt een bruikbare elektroporatiemethode voor de transformatie van obligate intracellulaire bacteriën in het geslacht Rickettsia.

Een elektroporatiemethode om Rickettsia spp. te transformeren met een fluorescerende eiwitexpressie shuttlevector in tekencellijnen

We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.

Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

Dit artikel presenteert de methodologie voor het blootstellen van mensen aan larvale Ixodes scapularis voor klinisch onderzoek. De techniek is relatief eenvoudig, acceptabel voor de onderzoeksvrijwilligers en kan worden aangepast aan de experimentele behoeften. Dergelijk onderzoek met menselijke proefpersonen moet worden uitgevoerd volgens protocollen voor klinisch onderzoek die zijn goedgekeurd door de bevoegde regelgevende instanties.

Een model voor experimentele blootstelling van mensen aan larvale Ixodes scapularis-teken

Hier presenteren we een protocol om speeksel, hemolymfe, speekselklieren en middendarm te verzamelen, na de dissectie van een individueel gevoede teek, om weefselspecifieke lokalisatie van door teken overgedragen pathogenen te bestuderen om het begrip van vectorcompetentie en pathogeen-microbioominteracties te vergroten.

Extractie van speeksel, hemolymfe, speekselklieren en middendarm van individuele teken (Acari: Ixodidae)

Deze methode schetst de ontwikkeling van een in vitro teken bloedvoedingssysteem met een 3D-geprinte kamer en een in het laboratorium vervaardigd siliconenmembraan. Het systeem maakt kunstmatige voeding van teken mogelijk, waardoor bemonstering in verschillende voedingsfasen eenvoudig is en er weinig bloed wordt gebruikt, wat een onschatbaar hulpmiddel biedt voor het bestuderen van ixodidteken.

Tekenbloed dat via een kunstmatig membraan op een 3D-geprinte kamer in Ixodid Tick Research wordt gevoed

Leer hemolymfecollectie en inoculatie van Metarhizium blastosporen in Rhipicephalus microplus teken voor immunologisch onderzoek. Deze methode onthult cruciale inzichten in teken-pathogeen interacties.

Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies (Video) | JoVE Journal

Het onthullen van Hemolymph inzameling en inenting van anisopliae Blastospores in Rhipicephalus Microplus teken naar ongewervelde pathologie studies

Meer video's verkennen