Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

We hebben een gedefinieerd, reproduceerbaar en langdurig protocol ontwikkeld voor kleine RNA-sequencing en voor het analyseren van genormaliseerde reads met behulp van opensource bioinformatica tools. De belangrijkste voordelen van onze strategie zijn dat het nauwkeurig microRNAs verzamelt door middel van gelzuivering en dat de bio-informatica analyse kan worden toegepast, ongeacht hoe de microRNAs worden verzameld. Hoge doorvoer sequencing van microRNAs kan onthullen inzicht in ziektemechanismen, de verwerking van microRNAs, en de nauwkeurige kwantificering van gentherapie benaderingen die kleine RNAs leveren.

Zorg ervoor dat u werkt in een RNase vrije omgeving en om alle RNA-producten op ijs te houden tijdens de procedure. Het visualiseren van de gel snijden stappen zal kijkers helpen om de juiste grootte van de producten die nodig zijn voor downstream-toepassingen te identificeren. Voor drie prime adapter ligatie, combineren 11 microliter RNA met 1,5 microliter atp vrije 10X T4RNA ligase reactie buffer, een microliter van polyethyleenglycol, en 0,5 microliter van drie prime linker.

Verwarm de monsters op 95 graden Celsius op een thermocycler gedurende 30 tot 40 seconden, gevolgd door een minuut afkoelen op ijs. Voeg een microliter T4RNA ligase twee toe en broed de reactie twee uur lang bij kamertemperatuur uit. Terwijl de monsters zijn uitbroeden, giet een 15%polyacyrilamide gel tussen 0,8 millimeter gescheiden glasplaten in een plastic giet en steek een kam.

Wanneer de gel gestold is, voeg dan 0,5 5X TBE toe aan de tank en pipet krachtig om de putten van restureum te wassen. Na het voorlopen van de polyacrylamide gel gedurende 25 minuten op 375 volt, laad de monsters waardoor ten minste een rijstrook tussen elk monster. Laad 20 microliter van ten minste twee sets markers in een asymmetrisch patroon om de geloriëntatie bij te houden en de gel op een constante 375 volt uit te voeren.

Na 15 minuten, verhogen tot een constante 425 volt voor de rest van de run en voer de gel voor ongeveer twee uur. Gebruik aan het einde van de run een plaatafscheider om de gel van de glasplaten te verwijderen en leg de gel op een plastic paginabeschermer. Verdun vijf microliter ethidium bromide in 500 microliter gedestilleerd water en voeg de kleurstof toe aan de markerbanen net boven de bovenste lichtblauwe marker.

Gebruik vervolgens een schoon scheermesje om de gels van de bovenste naar de onderste markering in elke rijstrook onder ultraviolet licht te snijden en de stukken over te brengen naar een vierkant van vier bij vier centimeter van de laboratoriumafdichtingsfilm. Snijd de gel met ongeveer drie bezuinigingen horizontaal en twee bezuinigingen verticaal tot 12 kleine vierkantjes te produceren. Voeg 400 microliter natriumchloride van 0,3 moler aan de afdichtingsfilm toe en leid de gelstukken in 1,5 milliliter siliconen buizen.

Roer de monsters op een nutator op vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, breng 400 microliters van elke supernatant in nieuwe buizen. Voeg een milliliter van 100% ethanol en een microliter van 15 milligram per milliliter glycogeen co-precipitant per buis.

Bewaar vervolgens de buizen op min 80 graden Celsius gedurende een uur. Voor vijf prime linker ligatie, eerst spin vaststelling van de ontdooide monsters en resuspend de pellets in water. Voeg vervolgens 0,5 microliter van 100 micromolar vijf prime linker, een microliter T4RNA ligase buffer, een microliter van 10 millimolar ATP, en een microliter van polyethyleenglycol aan elk monster.

Verwarm de reacties op 90 graden Celsius gedurende 30 seconden voordat ze op ijs worden gezet. Voeg vervolgens een microliter T4RNA-ligase toe aan elke buis en broed de reacties twee uur lang bij kamertemperatuur uit. Voor omgekeerde transcriptie, verzamel de monsters door centrifugatie en resuspend de lucht gedroogde pellet in 8,25 microliters van nuclease gratis water.

Voeg 0,5 microliter van 100 micromolar reverse transcriptase primer en vijf microliters van 2X reverse transcriptase reactie mix van een aanvullende DNA synthese kit. Voeg na drie minuten bij 42 graden Celsius 1,5 microliter 10x reverse transcriptase enzym toe aan elk monster gedurende een incubatie van 30 minuten bij 42 graden Celsius in een thermocycler. Bereid na neutralisatie een PCR-reactie voor met 29,5 microliter water, vijf microliter van 10X taq buffer, een microliter van nucleoside triphosfat, twee microliters van 25 micromolar forward primer, twee microliters van 25 micromolar reverse primer, 0,5 microliter taq polymerase, en 10 microliter van de omgekeerde getranscribeerd complementaire DNA.

Voer dan twee PCR-reacties uit. Voor agarose gel zuivering, bereiden een 4%agarose gel met een laag smeltende agarose en belasting 40 microliters of meer van de PCR product op de gel met lading kleurstof en 100 base pair en 25 base pair size markers. Na het uitvoeren van de gel, snijd de band boven de 125 base pair band en gebruik een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.

Schud om de gelband in buffer op kamertemperatuur op te lossen voordat u de juiste apparatuur gebruikt om de uiteindelijke sequentiebibliotheek te kwantificeren. Gebruik vervolgens de juiste opensource bioinformatica tools om de sequentiegegevens te analyseren. In deze representatieve PCR-reactie op laag smeltende agarose gel kan de verwerving van het juiste gekloonde product ten opzichte van het verkregen linker linkerproduct en onverzadigde versus verzadigde monsters worden waargenomen.

Na uitlijning op menselijke microRNA haarspelden, een sterke concordantie tussen de microRNA lezen telt in elke replicate kan worden waargenomen. Een totaal van 306 microRNA soorten werden gedetecteerd met het grootste aantal reads mapping naar microRNA 122. Het is belangrijk om te onthouden om de gels te snijden op de juiste grootte om een nauwkeurig herstel van de microRNAs mogelijk te maken.

Na het sequencing van de microRNAs kunnen gebruikers een bioinformaticaanalyse toepassen om de distributie van microRNAs in hun weefsels van belang te karakteriseren. Deze techniek is gebruikt om te bepalen hoe microRNAs worden verwerkt en welke sets van microRNAs worden gewijzigd in bepaalde vormen van kanker. Zorg ervoor dat u voorzichtig te oefenen bij de behandeling van de ethidium bromide en bij het kijken naar de gels onder ultraviolet licht.