Name: Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Leer live-cel fluorescentiemicroscopie om subcellulaire eiwitlokalisatie en celmorfologie te onderzoeken in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus. Deze methode maakt continue monitoring van eiwitdynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken onze lableden voor hun opmerkingen over dit artikel. Dit werk werd gefinancierd door een start-up subsidie van de Universiteit van Zuid-Florida (PE).

1. algemene groei voorwaarden
<ol><li>Inoculeren 2 mL geschikt groeimedium, aangevuld met antibiotica (indien nodig) met een enkele kolonie van de stam (en) die moet worden afgebeeld. Incuberen deze zaad culturen 's nachts bij 22 °C in een schud incubator. Opmerking: de specifieke bacteriële groeiomstandigheden die in dit artikel worden gebruikt, worden verstrekt in het gedeelte representatieve resultaten.</li>
	<li>Verdun 's nachts culturen 1:20 in verse media in een kolf van 125 mL, aan te vullen met antibiotica (indien nodig).</li>
	<li>Kweek cultuur (en) bij 37 °C in een schud incubator tot halverwege de logaritmische fase (OD600 = 0,5). Opmerking: inductor of remmer kan direct worden toegevoegd aan de teelt cultuur (en) in de juiste groeifase.</li>
	<li>Oogst cellen op gewenste kweek condities voor microscopie monstervoorbereiding zoals beschreven in de volgende sectie.</li>
</ol>2. monstervoorbereiding
<ol><li>Bereid 1% agarose door het combineren van 0,25 g moleculaire biologie graad, lage EEO, agarose met ofwel 25 mL groeimedium aangevuld met geschikte antibiotica (indien nodig) voor timelapse microscopie of steriel water. Verwarm het mengsel met behulp van een magnetron voor ongeveer 30 s en giet het in een steriele 100 mm x 15 mm Petri schaal en laat het stollen.</li>
	<li>Neem een aliquot van de celkweek van 5 – 50 μL afhankelijk van de behoefte en vlek de cellen. Vlek cellen met geschikte kleurstoffen in dit stadium (bijv. Voeg fluorescerende kleurstof FM4-64 (membraan vlek) toe voor een experiment (Figuur 1)).<ol>
<li>Pipetteer een aliquot van 5 μL van het kweek monster of het gebeitst monster op de bodem van een 35 mm glasbodem kweek schotel (met 14 mm titer diameter en ongecoat No. 1,5 coverslip; Zie de tabel met materialen). Let op: gebruik geen poly-L-lysine gecoate covers Lips vooral voor timelapse microscopie als ze kunnen verschillende groeipatroon veroorzaken (we hebben dit gezien met poly-D-Lysine ook; gegevens niet weergegeven) en/of invloed op eiwit Dynamics6.</li>
		<li>Om het gebruik van kleurstoffen te minimaliseren, vlek 3 – 4 μL celsuspensie (geoogst op OD600 = 0,5; ongeveer 2,7 x 107 en 3,4 x 107 voor B. subtilis en S. aureus respectievelijk per 1 ml cultuur) direct op het glazen bodem gerecht.</li>
		<li>Plaats een voorgesneden agarose plaat (11 mm in diameter of van elke gewenste grootte om het oppervlak van de dekslip te overlappen; snijd met behulp van het open uiteinde van een steriele buis of een scheermesje) bovenop het monster en tik zachtjes om ervoor te zorgen dat de agarose plaat plat tegen de dekslip ligt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als het aantal cellen in het gezichtsveld niet wenselijk is na beeldvorming (zie volgende sectie), past u de celdichtheid van het monster via verdunning of concentratie aan door centrifugeren en wijzigt u de verhouding van cellen in het monster met behulp van groeimedium/buffer indien nodig. Opmerking: om de autofluorescentie die uit het kweekmedium komt te minimaliseren, kunnen cellen worden gewassen in buffer (bijvoorbeeld in standaard 1x fosfaatbuffer-zoutoplossing) en opnieuw worden opgehangen in de juiste hoeveelheid buffer voorafgaand aan beeldvorming. Het is mogelijk dat in deze stap kleinere cellen of blaasjes na centrifugeren niet behouden blijven en dus verloren zullen gaan.</li>
	<li>Voeg water toe met een pipet (~ 5 μL druppels) op de ruimte in de kweek schaal (rond de Afdeklijst) om te voorkomen dat het agarose pad droogt en om de vochtigheid tijdens de beeld verwerving te helpen behouden, vooral voor timelapse-experimenten.</li>
	<li>Laat de kweek gerechten naar de temperatuur in de incubatie kamer, een ingebouwd, opaak compartiment van de fabrikant, van de Microscoop voor 15 – 20 min. Opmerking: Schakel het verwarmingselement in en stel de incubatie kamer enkele uren voorafgaand aan de beeldvorming in op een gewenste temperatuur. Dit zal ervoor zorgen dat de hardware stabiliseert naar de nieuwe temperatuur. Voor langdurige timelapse-beeldvorming, plaats een bekerglas of kolf met water in de Microscoop kamer, weg van het werkgebied, om de vochtigheid te behouden.</li>
</ol>3. Imaging
<ol><li>Zet op de dag van het experiment het Microscoop systeem aan. Start de imaging software (Zie tabel met materialen) door op het juiste pictogram op het bureaublad te klikken. Initialiseer de Microscoop door te klikken op de optie Microscoop initialiseren (knop afgebeeld met een Microscoop erop) in het opstart dialoogvenster van de software. Zorg ervoor dat de doelstelling volledig is verlaagd met behulp van de fijnafstelling van de Microscoop voorafgaand aan de initialisatie. Opmerking: na de initialisatie worden naast het menu Start ook drie extra dialoogvensters weergegeven: resolve3D, gegevensverzameling en filter monitor.</li>
	<li>Plaats een druppel van 1,517 (brekingsindex) olie op de 100x olie onderdompeling doelstelling geleverd door de fabrikant (numerieke diafragma = 1,4, werkafstand = 0,12 mm; Zie tabel van de materialen). Opmerking: het is belangrijk om de juiste Dompel olie te kiezen voor de temperatuur waarop beeldvorming wordt uitgevoerd.</li>
	<li>Laad de glazen bodem schotel met monster in de metalen behuizing (kist) en schuif zachtjes in de stage klem.</li>
	<li>Gebruik de grove instelknop om de doelstelling te verhogen totdat de olie contact maakt met de glazen bodem van het gerecht. Gebruik het oogstuk en de fijnafstelling knop om het monster scherp te stellen. Zodra de cellen scherp zijn, draait u de knop van het oogstuk naar de cameramodus door de keuzeschakelaar op de voorkant van de Microscoop naar links te bewegen.</li>
	<li>Begin met experimenteren met de imaging software. Selecteer in het venster resolve3D het pictogram experiment ontwerpen/uitvoeren dat door een kolf wordt afgebeeld. Een nieuw dialoogvenster moet worden weergegeven met de titel ontwerp/uitvoeren experiment.<ol>
<li>Stel het aantal Z-stapels en monster dikte in met behulp van het tabblad ontwerp en vervolgens snijden in het dialoogvenster ontwerp/uitvoering experiment . Opmerking: voor de experimenten in representatieve resultaten sectie, 17 Z-stacks bij 200 nm interval voor stilstaande beelden en vier Z-stacks bij 200 nm interval voor timelapse microscopie werden gebruikt.</li>
		<li>Als u de dikte van de cellen in het voorbeeld wilt meten, moet u het Z-vlak stapsgewijs handmatig aanpassen met behulp van de pijlen omhoog en omlaag in het dialoogvenster resolve3D . Markeer waar de cellen zich buiten de focus bevinden als de bovenste en onderste limiet voor het verzamelen van afbeeldingen. Importeer deze informatie voordat u het experiment uitvoert.</li>
		<li>Om fototoxiciteit en fotobleaching tijdens timelapse-beeldvorming te minimaliseren, verlaagt u het aantal Z-stacks en kiest u het middenvlak van de cellen voorbeeld verwerving.</li>
	</ol></li>
	<li>Selecteer de juiste Filterset voor het experiment met behulp van het tabblad ontwerp en vervolgens kanalen in het dialoogvenster ontwerpen/uitvoeren experiment (tritc: ex 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).<ol>
<li>Selecteer ook een verwijzing voor de verzameling van POL/DIC-informatie. Pas de procentuele transmissie (lichtintensiteit) en de blootstellingsduur aan voor afzonderlijke kanalen die vóór de beeldvorming zijn geselecteerd door de gewenste opties te selecteren in het dialoogvenster resolve3D . Opmerking: in een testveld van weergave dat niet in aanmerking komt voor het experiment test deze instellingen om te bepalen of de geselecteerde parameters zinvolle fluorescentie gegevens verkrijgen zonder een zwak signaal te missen of te oververzaveren. Importeer vervolgens deze parameters voor de experimentele set-up.</li>
	</ol></li>
	<li>Open de lijst met punten door de knop puntenlijst in het dialoogvenster resolve3D te selecteren. Er moet een nieuw dialoogvenster worden weergegeven met de titel puntenlijst. Markeer verschillende weergavevelden die in het experiment moeten worden gebruikt door de juiste weergave gebieden te zoeken met behulp van de besturingselementen voor de Microscoop en de optie markeerpunt in het dialoogvenster puntenlijst te selecteren. Opmerking: er moet een Vervang punt worden geselecteerd telkens wanneer de Microscoop wordt geherconcentreerde op een punt in de puntenlijst. Dit kan worden gedaan door de Microscoop op het juiste punt in de lijst te richten en vervolgens de knop punt vervangen te selecteren. Het is belangrijk om de analoge Grove/fijnafstelling knop niet aan te raken bij het opnieuw scherpstellen; Gebruik alleen de software om de scherpstelling aan te passen.</li>
	<li>Stel timelapse-parameters in door eerst het ontwerp te selecteren en vervolgens timelapse -tabblad in het dialoogvenster ontwerpen/uitvoeren experiment. Schakel het selectievakje timelapse in. Voer de juiste timelapse-parameters in termen van timelapse-afbeeldingen/totale tijd.</li>
	<li>Stel punten in die moeten worden afgebeeld in de puntenlijst door eerst het ontwerp te selecteren en vervolgens het tabblad punten in het dialoogvenster ontwerpen/uitvoeren experiment. Selecteer de optie puntenlijst bezoeken en voer punten in die in het tekstvak moeten worden afgebeeld, gescheiden door komma's of afbreekstreepjes als dit een volledige reeks is.</li>
	<li>Voordat u begint met een experiment, bewerk bestandsnamen en bestandslocaties met behulp van het tabblad uitvoeren in het dialoogvenster ontwerp/uitvoeren. Bestandslocatie kan worden gewijzigd door de knop instellingen te selecteren, de gegevensmap te selecteren en vervolgens de juiste map te selecteren of een nieuwe te maken. Wijzig de bestandsnamen door de nieuwe bestandsnaam in het tekstvak afbeeldings bestandsnaam in te voeren.</li>
	<li>Begin het experiment door de knop afspelen te selecteren in het dialoogvenster experiment starten . Opmerking: Controleer voor timelapse voortdurend de focus op elk gezichtsveld tijdens het experiment met behulp van DIC-instelling (om onnodige fotobleking te voorkomen) en herfocus en werk de informatie in de puntenlijst bij als cellen de neiging hebben om uit de focus te gaan na verloop van tijd.</li>
</ol>4. beeldverwerking
<ol><li>Open de gewenste RAW (R3D)-afbeeldingsbestanden voor het genereren van figuren. Opmerking: onlangs opgeslagen bestanden kunnen worden weergegeven met behulp van de knop gegevensmap in het opstart dialoogvenster van de imaging-software.</li>
	<li>Voer het deconvolutie-programma uit om out-of-focus fluorescentielicht7,8te verwijderen om een deconvolved D3D-beeldbestand te produceren. Selecteer het tabblad proces in het dialoogvenster Opstarten en selecteer vervolgens deconvolve. Er verschijnt een nieuw dialoogvenster met de titel deconvolve.<ol>
<li>Stel de parameters deconvolutie in door het juiste afbeeldingsnummer (in de linkerbovenhoek van elk afbeeldingsbestand) naar de invoer in het dialoogvenster deconvolutie te slepen. Selecteer in het dialoogvenster deconvolutie de knop meer opties en schakel het selectievakje uitsnijd rand off na verwerking uit (anders kunnen de afbeeldingen niet boven het corresponderende dic-bestand worden gelegd).</li>
		<li>Klik op de knop doe het in het dialoogvenster deconvolutie om het RAW-afbeeldingsbestand te deconvolve. Opmerking: de deconvolutie-parameters kunnen worden aangepast zoals aangegeven door de handleiding van de softwarefabrikant voor de gewenste resultaten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indien nodig, voer handmatige achtergrondruis aftrekken en helderheid/contrast aanpassing in een of alle golflengte (kleur) kanalen. Hiertoe selecteert u de knop contrast aanpassing op het deconvolved-afbeeldingsbestand.</li>
	<li>Sla de afbeelding op als een TIFF-bestand door eerst de optie bestand boven aan het dialoogvenster D3D te selecteren. Selecteer vervolgens opslaan als TIFF, Identificeer en selecteer de juiste Z-stapels (die zich binnen de focus bevinden), selecteer of deselecteer de gewenste filter sets.</li>
	<li>Voer gegevens kwantificering uit met behulp van door de fabrikant geleverde software of vrij beschikbare Programma's zoals ImageJ5.<ol>
<li>Voor kwantificering van celgrootte klikt u op het tabblad tool op het juiste D3D-afbeeldingsbestand en selecteert u vervolgens de optie afstanden meten . Meet afstanden door begin-en eindpunten te selecteren op het gewenste beeldbestand met de muis door links klikken. Opmerking: u het beste inzoomen op de afbeelding tijdens de kwantificering van de celgrootte.</li>
		<li>Voor fluorescentie signaal kwantificering gebruik de optie gegevenscontrole onder het tabblad tool op het juiste D3D image-bestand. Opmerking: u het beste inzoomen op de afbeelding en alleen relevante filters selecteren bij het voltooien van de fluorescentie signaal kwantificering.</li>
		<li>Als u het fluorescentie signaal wilt kwantificeren, tekent u een vak met kolom/rij-optie ingesteld op specifieke dimensie. Selecteer een gebied met het te kwantificeren signaal en noteer de waarde. Meet het achtergrond signaal met behulp van hetzelfde formaat vak om een gebied direct buiten de cellen te selecteren. Trek de achtergrondwaarde af van de waarde die is opgenomen uit het fluorescentie signaal dat in de cel is verkregen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
<li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li>
<li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li>
<li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+poly%28L-lysine%29+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li>
<li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workingperson%27s+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li>
<li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
<li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis%3A+The+Z+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li>
<li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li>
<li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623(2019).</li>
<li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723%3A+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li>
<li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+TEM%3A+new+insights+from+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li>
<li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li>
<li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li>
<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology%3A+from+localization+to+dynamics%2C+from+ensembles+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).</li>
<li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Biology%22%5BJournal%5D)">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microscopie bleef een steun Piler in studies met betrekking tot microbiële organismen. Gezien hun micron schaal celgrootte, eencellige studies hebben traditioneel vertrouwd op elektronenmicroscopie (EM). Hoewel EM in de afgelopen jaren behoorlijk een krachtige techniek is geworden, heeft het naast beperkte gebruikers toegang16ook zijn eigen intrinsieke beperkingen. Verbeteringen in fluorescentiemicroscopie technieken en de ontwikkeling van verschillende fluorescentie sondes, zoals FDAA<sup class="...

Het gebied van bacteriële celbiologie is aanzienlijk verbeterd door recente ontwikkelingen in microscopie technieken1,2. Naast andere instrumenten blijven microscopen die in staat zijn om timelapse-fluorescentiemicroscopie-experimenten uit te voeren een waardevol hulpmiddel. Onderzoekers kunnen verschillende fysiologische gebeurtenissen in real-time monitoren met behulp van fluorescerende eiwitten zoals, groene fluorescerende proteïne (GFP) gebaseerde transcriptionele en translationele reporter Fusions, fluorescerende D-aminozuren (FDAA)3, of andere vlekken gebruiken voor het labelen van de celwand, het membraan en het DNA. Het is daarom geen verrassing dat fluorescentiemicroscopie populair blijft onder microbiële celbiologen. Naast het simpelweg tonen van de end fenotypes, het verstrekken van informatie over hoe de waargenomen fenotypes ontstaan met behulp van timelapse microscopie kan aanzienlijke waarde toevoegen aan de bevindingen en potentieel bieden aanwijzingen over wat cellulaire processen worden gericht door potentiële drug kandidaten4.
De protocollen voor het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie met behulp van een volledig gemotoriseerde, omgekeerde, breed-veld fluorescentiemicroscoop (Zie de tabel met materialen) zijn in dit artikel beschikbaar. Deze protocollen kunnen worden aangepast aan de behoeften van andere fluorescentie microscopen die in staat zijn om timelapse-microscopie uit te voeren. Hoewel de hier besproken software overeenkomt met de specifieke door de fabrikant geleverde software zoals aangegeven in de tabel met materialen, software die gewoonlijk wordt geleverd door andere Microscoop fabrikanten of de vrij beschikbare imagej5, hebben gelijkwaardige tools voor het analyseren van microscopie gegevens. Voor de omstandigheden waarin timelapse niet bevorderlijk is, kunnen tijd-cursus experimenten worden uitgevoerd zoals beschreven in dit artikel. De hier beschreven protocollen bieden een gedetailleerde handleiding voor het bestuderen van de fenotypische veranderingen in twee verschillende bacteriesoorten: B. subtilis en S. aureus. Zie tabel 1 voor gebruikte stammen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>Molecular Biology Grade - Low EEO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1755-10</td><td>Dioxaan-vrij</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Aangepaste Olympus IX-71 geïnverteerde microscoopstandaard; Aangepaste verlichtingstoren en getransmisseerde lichtverlichtingsmodule. Objectieven: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski voor 100X objectief; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-kleurig; Milieucontrolekamer - ondoorzichtig.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>FtsZ-remmer</td></tr><tr><td>SoftWorx</td><td>GE</td><td></td><td>Door de fabrikant geleverde beeldvormingssoftware</td></tr></tbody></table>

live-cel fluorescentiemicroscopie om subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Onderzoeken van factoren die van invloed zijn op celdeling en celvorm in bacteriën worden vaak uitgevoerd in combinatie met hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie, aangezien waarnemingen op een populatieniveau niet echt kunnen weerspiegelen wat er op één celniveau gebeurt. Live-cel timelapse microscopie stelt onderzoekers in staat om de veranderingen in celdeling of celmorfologie te monitoren die waardevolle inzichten bieden met betrekking tot subcellulaire lokalisatie van eiwitten en timing van genexpressie, zoals het gebeurt, om potentieel te helpen bij het beantwoorden van belangrijke biologische vragen. Hier beschrijven we ons protocol voor het monitoren van fenotypische veranderingen in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus met behulp van een high-resolution deconvolutie Microscoop. Het doel van dit verslag is om een eenvoudig en duidelijk protocol te bieden dat kan worden aangenomen door andere onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie-experimenten om verschillende biologische processen in bacteriën en andere organismen te bestuderen.

GpsB-fenotypes Eerder hebben we aangetoond dat sa-GpsB een essentieel eiwit is als uitputting van GpsB met een antisense RNA-resultaat in cel lysis9. Hier beschrijven we hoe de opkomst van verschillende celdeling fenotypes en veranderingen in eiwit lokalisatie kan worden vastgelegd met behulp van de timelapse microscopie protocol beschreven in dit artikel. Voor dit doel, S. aureus stammen RB143 [SH1000 cellen pEPSA5 (lege Vector)] en GGS8 [SH1000 cellen pGG59 (P</e...

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Dit protocol vergemakkelijkt de directe observatie van verschillende fenotypische veranderingen op een eencellig niveau en maakt het mogelijk om eiwitlokalisatie en genexpressietiming continu te monitoren. Het belangrijkste voordeel van fluorescentiemicroscopie is dat het een eenvoudige methode is voor het monitoren van verschillende biologische processen, zoals celdeling en veranderingen in celmorfologie in levende cellen. Zorg ervoor dat u bijzondere aandacht besteden aan het monster voorbereiding protocol en om de microscoop software te verkennen om te kunnen de instellingen en opties die in dit protocol te lokaliseren.Een visuele weergave van dit protocol is van cruciaal belang omdat het gebruikers in staat stelt om de belangrijke stappen van de techniek te bekijken en te leren terwijl ze hun eigen experimenten opzetten. Begin met het labelen van een vijf tot 50-microliter aliquot van de celcultuur van belang met een geschikte membraan kleurstof kleurstof en het toevoegen van vijf microliter van de gekleurde bacteriële cellen op een cover slip op de bodem van een 35-milliliter glazen bodem cultuur schotel. Plaats een 11-millimeter diameter agarose plaat over het monster en tik voorzichtig om ervoor te zorgen dat de plaat plat is tegen de cover slip.Voeg vervolgens ongeveer vijf microliter water rond de afdekstrook toe om te voorkomen dat het agarosepad uitdroogt en laat de kweekschotel gedurende 15 tot 20 minuten in evenwicht brengen met de temperatuur in de incubatiekamer van een ontvolkende microscoop met hoge resolutie. Als u het monster wiltafbeeldingen, gebruikt u de grove aanpassingsfocusknop om ervoor te zorgen dat het doel volledig is verlaagd voordat u de microscoop in de microscoopsoftware initialiseert. Plaats een druppel van 1.517 brekingsindexolie in de 100x olie onderdompeling doelstelling, en breng de glazen bodem schotel met het monster in de metalen behuizing kist.Schuif de schotel voorzichtig in de podiumklem en gebruik de grove verstelknop om het doel te verhogen totdat de olie in contact komt met de glazen bodem van de schotel. Gebruik het oculair en de fijne verstelknop om het monster scherp te stellen en schakel over naar de cameramodus. Selecteer in de beeldsoftware in het venster 3D oplossen het pictogram Ontwerp/Run Experiment.Er verschijnt een nieuw dialoogvenster met de titel Ontwerp/Run Experiment. Open de tabbladen Ontwerpen en secties in het dialoogvenster om het aantal Z-stapels en de sampledikte in te stellen. Als u de dikte van de cellen in het monster wilt meten, past u het Z-vlak stapsgewijs aan met de pijl-omhoog en pijl-omlaag in het dialoogvenster 3D oplossen, waardoor de cellen out-of-focus gaan als de bovenste en onderste limieten voor de afbeeldingsverwerving.Nadat u de procentuele transmissie van de lichtintensiteit en de duur van de belichting voor de afzonderlijke geselecteerde kanalen in het dialoogvenster 3D oplossen hebt aangepast, klikt u op Lijst met punten om de puntenlijst te openen. Schakel in de tabbladen Ontwerp en time lapse het selectievakje Time Lapse in en voer de timelapseparameters in. Selecteer de optie Bezoekpunt en voer de punten in die in het tekstvak moeten worden weergegeven en scheid de punten door komma's of koppeltekens voor volledige reeksen.Bewerk vervolgens bestandsnamen en bestandslocaties op het tabblad Uitvoeren en selecteer Afspelen in het dialoogvenster Experiment starten om het experiment te starten. Open aan het einde van de analyse de RAW-afbeeldingsbestanden die van belang zijn voor een geschikt deconvolutieprogramma en selecteer het tabblad Proces en Deconvolve. Voer eventuele handmatige achtergrondruisaftrekkende en helderheidscontrastaanpassing in een of alle golflengtekanalen uit, indien nodig voordat u de afbeelding opslaat als een TIFF-bestand.Open voor de kwantificering van de cellengte de gedeconvoluteerde afbeeldingsbestanden in de door de fabrikant geleverde software of in vrije beeldvormingssoftware, zoals ImageJ, en open het tabblad Gereedschap. Selecteer Vervolgens Afstanden meten en klik links op de begin- en eindpunten in het gewenste afbeeldingsbestand om de cellengte te meten. Selecteer Gegevenscontrole voor fluorescerende signaalkwantificering.Teken een vak met de optie Kolom/Rij ingesteld op de specifieke dimensie van de interesse en selecteer het gebied met het te kwantificeren signaal. De toevoeging van xylose om een GGS 8-stam te induceren resulteert in een zescellig fenotype. Terwijl lege vectorbesturingselementen lijken op controlecellen gekweekt in de afwezigheid van inducer.Overproductie van staph aureus gpsB verstoort de celdeling in B.subtilis, gemeten naar timelapse microscopie en cellengte kwantificering. Bovendien kunnen de lokalisatiepatronen van FtsZ of een van de eiwitten in verband met dit eiwit worden gebruikt als verslaggever om nieuwe antimicrobiële verbindingen te bestuderen en/of te identificeren door de time lapse imaging en de kwantificering van de cellengte. Zorg ervoor dat u een olie met de juiste brekingsindex gebruikt, aangezien de brekingsindex kan veranderen afhankelijk van de temperatuur die wordt gebruikt voor de beeldvorming.Deconvolution kan worden uitgevoerd als de gebruiker wil out-of-focus ruis te verwijderen, en data-analyse waarbij fluorescerende signaal kwantificering en cellengte en breedte metingen kunnen ook worden uitgevoerd.

live-cell-fluorescence-microscopy-to-investigate-subcellular-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Dit protocol biedt een stap-voor-stap procedure te controleren enkele cel gedrag van verschillende bacteriën in de tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Verder hebben we geven richtlijnen hoe de microscopie beelden te analyseren.

Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere...

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Source: Brzozowski, R. S. et al. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates live-cell fluorescence microscopy to visualize real-time morphological changes in bacteria. It outlines the steps involved in imaging, time-lapse acquisition, and deconvolution to obtain high-resolution images in real time.

Imaging Morphological Changes in Bacteria Using Live-Cell Fluorescence Microscopy

The video describes the FLIM-FRET imaging technique to determine the protein-protein interaction in live bacteria expressing cytoplasmic proteins labeled with fluorescent proteins, a donor eGFP, and acceptor mCherry. The combined technique also allows the quantification of the interacting proteins.

FLIM-FRET Imaging for Characterization of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria

Een methode op basis van fluorescente eiwitten in levende cellen voor het verlichten van cellulaire vacuolen (insluitsels) die Chlamydia bevatten, wordt beschreven. Deze strategie maakt een snelle, geautomatiseerde bepaling van Chlamydia-infectiviteit in monsters mogelijk en kan worden gebruikt om de groeidynamiek van insluitsels kwantitatief te onderzoeken.

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Bacteriële cellen zijn ruimtelijk zeer georganiseerd. Volg deze organisatie na verloop van tijd in traag groeiende Myxococcus xanthus cellen en werd een set-up voor fluorescentie live-cel beeldbewerking met hoge Spatio resolutie gedurende enkele generaties ontwikkeld. Met deze methode kon Spatio dynamiek van belangrijke eiwitten voor chromosoom segregatie en celdeling worden vastgesteld.

Fluorescentie Live-cel beeldvorming van de Complete vegetatieve celcyclus van de langzaam groeiende sociale bacterie Myxococcus xanthus

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Leer live-cel fluorescentiemicroscopie om subcellulaire eiwitlokalisatie en celmorfologie te onderzoeken in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus. Deze methode maakt continue monitoring van eiwitdynamica mogelijk.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Meer video's verkennen