Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyte netwerken op multi well micro-elektrode arrays voor terugkerende actie potentiële opnames

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling van door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocytenetwerken op multiwell MEA-platen om de celmembranen omkeerbaar te elektrocriren voor mogelijke metingen. Actie potentiële parameters kunnen vervolgens worden gebruikt om deze responscurven te genereren om verbindingen te testen voor elektrofysiologie. Multiwell MEA codering en celbeplating zijn de meest uitdagende stappen die speciale aandacht nodig hebben.

Men moet deze stappen ijverig en snel uitvoeren om te voorkomen dat druppels zich verspreiden en uitdrogen. Met de praktijk, kan dit gemakkelijk worden overwonnen. We ontwikkelden een aangepaste grafische gebruikersinterface voor enkele segmentatie, kwaliteitsborging en parameterextractie.

Onze robuuste MATLAB workflow werd geïmplementeerd om snel grote hoeveelheden ruwe experimentele gegevens te reduceren tot een onbevooroordeelde groepering van actiepotentieele golfvormen. Begin met het ontdooien van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten volgens manuscriptrichtingen. Schors de cellen voorzichtig met behulp van een transferpipet om celklontjes te scheiden.

Dan zorgvuldig afzien van twee milliliter van cel suspensie in elke put van een substraat gecoate zes-put plaat en plaats de plaat in een cel cultuur incubator op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Cellen moeten zich 24 uur lang aan de gelkanaals hechten en spontaan slaan na 48 uur na het beplating. Twee dagen voorafgaand aan beplating toe te voegen 0,5 milliliter van de menselijke iPSC cardiomyocyte cultuur medium aan elke put van een 24-well multi-electrode array, of MEA plaat, en het uitvoeren van een baseline opname om signaal-ruis verhouding te verifiëren als een kwaliteitscontrole van de MEA's.

Dan, aspirate de media, spoel de putten met steriel water, en steriliseren onder een UV-licht in een laminaire stroom kap 's nachts. Voeg de volgende dag 0,1 milliliter FBS toe aan elke put voor hydrofiele behandeling van MEA-oppervlakken en broed de plaat 30 minuten op kamertemperatuur. Spoel vervolgens de FBS aan en spoel elke put twee keer met 0,5 milliliter steriel water.

Laat de plaat 's nachts drogen in de laminaire stroomkap. Op de volgende dag, pipet vijf microliters van werkende fibronectine verdunning en zorgvuldig afzien van de druppel in het midden van elke put om alle 12 elektroden te dekken. Plaats de plaat onmiddellijk op een verhoogd oppervlak in een bevochtigingskamer met voldoende steriel water om het gehele schaaloppervlak te bedekken.

Plaats de kamer met de plaat in de celcultuur incubator voor drie uur en ga dan verder met celbeplating. Wanneer u klaar bent om de cardiomyocyten te bord, past u de celdichtheid aan op 6.000 cellen per microliter door ze te verdunnen in het menselijke iPSC cardiomyocyten ontdooiend medium. Gebruik voorzichtig flicking om de cellen te houden van sedimentering.

Breng de MEA-plaat in de laminaire stroomkap en verwijder de fibronectinedruppel voorzichtig met een P10 pipet zonder de elektroden aan te raken. Onmiddellijk afzien van een vijf-microliter celdruppeltje naar het midden van de put ervoor te zorgen dat alle 12 elektroden te dekken. Doe dit een goed op een moment om fibronectin te voorkomen dat drogen.

Wanneer u klaar bent met beplating, plaats de MEA-plaat terug in de losbedekte bevochtigingskamer en breng deze drie uur terug naar de couveuse van de celkweek. Gebruik na de incubatie een P200 pipet om zorgvuldig 200 microliters van menselijke iPSC cardiomyocyten ontdooiend medium toe te voegen aan elke put zonder de cellen te storen. Plaats de MEA plaat terug in de celcultuur incubator en vervang cultuur medium 24 uur na beplating.

Wanneer klaar om signaal van de cardiomyocyten te verwerven, initiëren van de overname software en voeg de MEA plaat volgens manuscript aanwijzingen. Klik op de knop Verkennen om het signaal in alle putten te visualiseren en de signaalkwaliteit in steady state omstandigheden te verifiëren. Maak aantekeningen over elektroden met veldpotentieel, of FP, signalen in het millivolt bereik.

Klik vervolgens op dezelfde knop om de verkenning te stoppen. Tot op dit punt zijn er geen gegevens geregistreerd. Klik op de knop Ga om te beginnen met opnemen.

De elektroden in elke put tonen FP-signalen in het ruwe gegevensvenster. Na 30 seconden opnemen klikt u op de knop Stimuleren en laat u elektroporatie gedurende 30 seconden op de geselecteerde locaties plaatsvinden. Klik vervolgens op dezelfde knop om de simulatie te stoppen en 60 seconden door te gaan met opnemen.

Gebruik de matlab-gebaseerde aangepaste software om verschillende veldpotentieel en actiepotentieelparameters te segmenteren en te extraheren. Voer eerst de golfanalysecode uit en klik op Bestand en selecteer Process.h5. Zoek en selecteer de eerder gemaakte mwd.

h5-bestand. Klik op de knop Map opslaan om de opslaglocatie van de uitvoerbestanden te wijzigen. Maak vervolgens een wachtrij voor signaalverwerking door de elektrode en goed combinaties van interesse te selecteren en vervolgens op de knop Wachtrij te klikken.

Herhaal deze stap om meer elektrode en goed combinaties toe te voegen aan de wachtrij. Als cellen zijn behandeld met drugs, kan de wachtrij worden bewerkt door direct op Med Name, Med Concentration te klikken. Zodra de wachtrij is afgerond, klikt u op de knop Waveforms initialiseren, waarmee de voorlopige verwerking wordt gestart waarbij de signalen worden geïdentificeerd en geëxtraheerd voor segmentatie.

Wanneer de verwerking is voltooid, klikt u op de knop Inzoomen en selecteert u het actiepotentieel of het AP-interessegebied. Klik op de knop Houden en bekijk de deelvensters. De pieken en dalen worden gedetecteerd voor elke golfvorm, en de genormaliseerde AP's worden bovenop.

Als u klaar bent, klikt u op de knop Houden om door te gaan naar het volgende spoor in de wachtrij en herhaal het proces voor de rest van de elektrode en goed combinatiesignalen. De levensvatbaarheid en beplatingsdichtheid van de post-ontdooide cardiomyocyten is van cruciaal belang voor de multiwell MEA-cultuur. Een goede beplating resulteert in een gezonde monolaagcultuur met spontane afstraffing na 48 uur, terwijl slechte celrendheid resulteert in culturen met een hoog percentage niet-myocytenpopulaties.

Celdruppeldispersie beïnvloedt de cultuurdichtheid en kan zelfs leiden tot celdood, dus nauwkeurige celplaatsing is belangrijk. De cellen gekweekt op MEA's worden onderworpen aan een kwaliteitscontrole voor elektrische activiteit 48 uur na beplating. Als 50% van de elektroden binnen een netwerk en 70% van de totale netwerken geen FP-signalen produceren, dan is de cultuur suboptimaal.

Elektroporatie gemedieerde AP-opnames kunnen meerdere keren 48 uur na MEA-beplating worden verkregen. Meerdere elektroporities van dezelfde cellocatie op nul, 24, 48, 72 en 96 uur hebben na verloop van tijd geen significant effect op de AP-vorm. Bovendien is er geen correlatie waargenomen tussen FP en post elektroporatie AP amplitudes van dezelfde celsite.

Een belangrijk voordeel van deze methode is dat de multiwell MEA plaat meerdere keren hergebruikt kan worden. Om de betrouwbaarheid van deze array aan te tonen, worden 3, 815 AP-golfvormen uit drie herstelbatches getrokken en worden AP-duurgegevens geëxtraheerd om de herhaalbaarheid van de resultaten te onderzoeken. Wanneer van belang, is het mogelijk om extra testen uit te voeren, zoals genexpressie, calcium voorbijgaande metingen en patch klem om het gedrag van specifieke ionische stromen te onderzoeken.

Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om elektrofysiologische rijping te verbeteren en om chronische dosiseffecten op cardiomyocyten te screenen.