In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor-geassocieerde macrofagen spelen een belangrijke rol in de tumor micro-omgeving. Begrijpen hoe verschillende genetische mutaties in de tumorcellen macrofaag rekrutering beïnvloeden is van cruciaal belang voor het ontwerpen van gepersonaliseerde behandeling voor kankerpatiënten. Deze test biedt een eenvoudige en robuuste manier om de interactie tussen tumorcellen en macrofagen in vitro te beoordelen.

Deze test kan worden aangepast om de interacties tussen de tumorcellen en andere immuuncellen in vitro te beoordelen. Om met deze procedure te beginnen, warm je het serumvrije stamcelmedium op door het gedurende 20 minuten in een waterbad te plaatsen bij 37 graden Celsius. Spray de weefselkweekkapoppervlak met 70% ethanol en veeg het bespoten oppervlak af met papieren handdoeken.

Vervolgens spuiten de medium en cel detachement oplossing flessen met 70%ethanol en veeg ze naar beneden met papieren handdoeken. Breng de gereinigde flessen in de weefselkweekkap. Haal de tumorcel terug en breng deze over naar de weefselkweekkap.

Aspirate het medium en was de cellen met 10 milliliter PBS. Voeg vervolgens twee milliliter celloslatingsoplossing toe aan de kolf. Zet de fles in de motorkap, controleer elke minuut om te zien of de tumorcellen naar boven zijn afgerond.

Zodra de tumorcellen afronden, tik voorzichtig op de zijkant van de kolf om de cellen los te maken. Hierna, pipette acht milliliter serum-vrij celmedium in de kolf en pipet op en neer drie keer te mengen. Breng deze celsuspensie over op een 15 milliliter centrifugebuis en centrifuge bij 200 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Aspirate de supernatant. Was vervolgens de cellen in 10 milliliter PBS, zorg ervoor dat pipette op en neer drie tot vijf keer te mengen. Centrifugeren de cellen op 200 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Aspirate de supernatant, en resuspend de cellen in 10 milliliter serum-vrij medium. Pipette drie tot vijf keer op en neer om te mengen. Meng 10 microliter van deze celsuspensie met 10 microliter trypan blue-oplossing.

Volgende pipet 10 microliters van de Trypan Blue en cel mengsel in een tellen dia, en gebruik een automatische cel teller om de levende cel nummer te kwantificeren. Gebruik serumvrij celmedium om de celdichtheid aan te passen op 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Dan zaad twee milliliter van de cellen in elke put van een zes-put cultuur plaat.

Bereid tegelijkertijd zes putten met slechts twee milliliter serumvrij stamcelmedium. Daarna, incubeer de zes-put platen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide voor 24 uur. Spuit eerst het oppervlak van de weefselkweekkap met 70% ethanol en veeg het bespoten oppervlak af met papieren handdoeken.

Vervolgens spuiten de medium en cel detachement oplossing flessen met 70%ethanol en veeg ze naar beneden met papieren handdoeken. Breng de gereinigde flessen in de weefselkweekkap. Haal hierna de zes-put platen uit de couveuse.

Voorzichtig pipette de geconditioneerde media in 15 milliliter steriele centrifuge buizen, en plaats de buizen op ijs. Voeg 0,5 milliliter celloslatingsoplossing toe aan elke put van de zes-goed platen en controleer elke minuut of de tumorcellen naar boven zijn afgerond. Zodra de tumorcellen afronden, tik voorzichtig op de zijkant van de plaat om te helpen de cellen los te maken.

Volgende pipet 2,5 milliliter van tumorcel onderhoud medium in de put en pipet op en neer drie keer te mengen. Breng de cellen in een 15 milliliter steriele centrifuge buis. Meng 10 microliter cellen met 10 microliter trypan blue-oplossing en breng 10 microliter van dit mengsel over in de telplaat.

Gebruik een automatische celteller om het aantal levende cellen te kwantificeren en gebruik het serumvrije stamcelmedium dat 's nachts bij 37 graden Celsius is geïncubeerd om het volume van de geconditioneerde media aan te passen aan het celnummer. Filter de geconditioneerde media door 0,45 micrometerfilters en plaats de geconditioneerde media op ijs. Om te beginnen verwarmt u het IMDM-medium in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Reinig de weefselkweekkap met 70% ethanol en maak de fles medium schoon en transporteert deze in de kap zoals eerder beschreven. Breng vervolgens de kolf van MV-4-11 cellen in de kap. Pipette 10 milliliter cellen in een 15 milliliter centrifugebuis.

Gebruik Trypan Blue en een automatische celteller om het aantal levende cellen te kwantificeren zoals eerder beschreven. Dan centrifugeren de cellen op 200 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant en was de cellen met 10 milliliter PBS.

Centrifuge opnieuw op 200 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant, en resuspend de cellen in IMDM medium op een uiteindelijke celdichtheid van een miljoen cellen per milliliter. Breng eerst de benodigde materialen op kamertemperatuur.

Voeg 250 microliters van de voorbereide MV-4-11 cellen toe aan elke insert. Voeg vervolgens 400 microliter van het geconditioneerde medium of medium alleen toe aan de onderste kamers van de 24-putplaat, om de monsters in drievoud toe te voegen. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende vier uur.

Tik vervolgens voorzichtig op de wisselplaat op de binnenwand van dezelfde put en gooi de wisselplaat weg. Voorzichtig pipette de cellen in de putten op en neer drie keer te mengen. Breng 225 microliter van deze celsuspensie over in de putten van een zwartwandige 96-putplaat die geschikt is voor fluorescerende meting.

Verdun hierna de CyQUANT kleurstof met 4x lyse buffer bij een verhouding van 1 tot 75. Vortex kort en spin vaststelling van de oplossing. Breng 75 microliter van deze oplossing over op elke put van de 96-putplaat en broed gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Met behulp van een fluorescentieplaatlezer leest u de fluorescentie en analyseert u de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt een in vitro test gebruikt om tumormacrophage interactie te bestuderen. Monsters met hoge fluorescentiewaarden geven aan dat de geconditioneerde media een hoge capaciteit hebben om macrofagen aan te werven.

Afhankelijk van de experimentele behoefte kunnen extra controles worden opgenomen. Men kan bijvoorbeeld neutraliserende antilichamen gebruiken om de geconditioneerde media te behandelen om de macrofaag chemotaxi's af te schaffen en op dezelfde manier uit te voeren. Men kan ook extra chemokines toevoegen aan de geconditioneerde media, die dienen als een positieve controle.

Het is belangrijk om celnummerverschillen voor deze test te controleren, omdat verschillende celtypen met verschillende snelheden kunnen groeien. In vivo bevestiging van de in vitro resultaten zijn van cruciaal belang. Men kan tumorcellen injecteren in muizen en analyseren van de tumoren met flow cytometrie, immunostaining, en CyTOF om de resultaten te bevestigen.