Een Muriene cellijn gebaseerd model van chronische CDK9 remming om wijdverbreide niet-genetische transcriptionele rek defecten te bestuderen (TE^zeker) in kankers

Gezien het feit dat TEdeff kankers zijn een belangrijke wegversperring tegen immunotherapie, ons farmacologische model is een voordelig instrument, omdat het voldoende nabootst de wijdverbreide transcriptie en epigenetische afwijkingen waargenomen bij dergelijke kankers, en het maakt het mogelijk om deze niet-genetische afwijkingen te bestuderen om nieuwe inzichten te krijgen, nieuwe toepassingen te vinden voor bestaande geneesmiddelen, of nieuwe strategieën te vinden tegen dergelijke kankers. Dit is een eenvoudig vast te stellen en een generaliseerbaar model om transcriptieverlengingsafwijkingen bij kanker te bestuderen, waardoor men zowel in vitro als in vivo tumor-immuuninteracties kan bestuderen. Deze methode kan ook worden toegepast op menselijke carcinoom lijnen.

We hebben dit getest op T47D en CAL51 voor een korte termijn, wat aanleiding geeft tot vergelijkbare TEdeff-achtige kenmerken. Het protocol dat we hier beschrijven geeft een basiskader om de bekende variabelen die cruciaal zijn voor de generatie TEdeff-achtige functies door chronische CDK9-remming te minimaliseren. Er moet echter voor worden gezorgd dat de exacte subletale dosis flavopiridol voor andere murinelijnen wordt geoptimaliseerd.

De impact van variatie in celbeplatingsdichtheid, kweekomstandigheden, cytokine stimulatie voorwaarden kunnen variëren voor verschillende cel murine lijnen. Begin met het extraheren van polyA-positief RNA uit de helft van de eerder ribosomale RNA-uitgeputte monsters met oligo dT magnetische kralen. Resuspend de kralen in de flacon door vortexing voor 30 seconden, en breng 200 microliter van de kralen naar een buis.

Voeg een gelijk volume bindingsbuffer toe en meng de inhoud. Plaats de buis in een magneet voor een minuut, en gooi de supernatant. Verwijder vervolgens de buis van de magneet en zet de gewassen kralen opnieuw op in 100 microliter bindingsbuffers.

Pas het volume van het ribosomale RNA-uitgeputte monster aan op 100 microliter met 10-millimolar Tris-HCl bij pH 7.5. Voeg 100 microliter bindende buffer toe aan het monster. Verwarm het mengsel twee minuten lang tot 65 graden Celsius om secundaire RNA-structuren te verstoren en plaats het onmiddellijk op ijs.

Voeg de 200 microliter van het totale RNA toe aan de 100 microliter gewassen kralen en meng gedurende vijf minuten grondig op een rotor. Plaats de buis op de magneet gedurende een tot twee minuten, verwijder voorzichtig alle supernatant, verwijder dan de buis van de magneet, en voeg 200 microliters wasbuffer. Meng het monster voorzichtig door een paar keer op en neer te pipetten, breng de buis een minuut terug naar de magneet en verwijder de supernatant.

Gebruik vervolgens een spectrofotometer om de zuiverheid en concentratie van het geïsoleerde kralengebonden mRNA te meten. Gebruik de resterende helft van het ribosomale RNA-uitgeputte monster als input voor eiwit A-kolommen om vijf-prime afgetopte RNAs met monoklonale 7-methylguanonosine antilichaam te immunoprecipitaten. Was het eiwit Een magnetische kralen uit de RIP-kit volgens het protocol van de fabrikant om het antilichaam voor te binden aan de kralen, van het 7-methylguanonosine-antilichaam tegen het kraal dat in 100 microliter wasbuffers uit de kit is opgehangen.

Broed het mengsel 30 minuten op kamertemperatuur terwijl het draaien op lage snelheid. Dan centrifugeren de buizen kort, en leg ze op de magnetische afscheider. Verwijder en gooi de supernatant, neem dan de buizen van de magnetische afscheider, en resuspend de kralen met 500 microliters van wasbuffer.

Vortex de buizen, centrifuge ze kort, en plaats ze terug op de magnetische afscheider, en weer gooi de supernatant. Voeg vervolgens 120 nanogram ribosomale RNA-uitgeput RNA toe aan de aan antilichamen gebonden kralen, samen met een microliter RNase-remmer, en ontcubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 60 tot 90 minuten met milde agitatie. Na de incubatie, draai het monster op 300 keer g gedurende 10 seconden, en breng de supernatant met de niet-afgetopte mRNA naar een nieuwe microcentrifuge buis.

Herhaal de was nog twee keer met 100 microliters wasbuffer en pool de verzamelde supernatant. Elute de afgetopte mRNA van de kralen door het toevoegen van 300 microliters van ureum lyse buffer bereid volgens het manuscript richtingen en het verwarmen van het mengsel tot 65 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten. Combineer 300 microliter van het geëuterde monster met 300 microliter fenol:chloroform:isoamylalcohol, omkeren om te mengen en laat gedurende 10 minuten.

Meng het monster voorzichtig opnieuw en vercentrifugeer gedurende twee minuten. Voorzichtig pipette de bovenste laag naar een verse buis, en gooi de onderste laag. Voeg 300 microliter van 2 propanol en 30 microliter natriumacetaat van drie kies aan het monster toe, keer het een paar keer om en stop het gedurende 20 uur in min 20 graden Celsius.

Na de incubatie, centrifugeren het monster gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant voorzichtig weg en droog de pellet vijf minuten op kamertemperatuur. Resuspend de pellet in nuclease-vrij water, en meet de zuiverheid en concentratie van het RNA met een spectrofotometer.

Isoleer CD8-positieve cellen volgens de handschriftrichtingen en zet de cellen vervolgens opnieuw op in de commercieel beschikbare magnetische scheidingssysteembuffer. Voeg 100 microliter antilichaamcocktail toe voor elke milliliter cellen en broed de cellen 15 minuten op ijs uit. Voeg vervolgens 100 microliter magnetische kralen per elke 100 microliter antilichaamcocktail toe en laat de cellen nog 15 minuten op ijs staan.

Voeg na de incubatie zeven milliliter magnetische scheidingsbuffer toe aan de cellen, drie tot vier milliliter aan een verse buis en plaats de buis gedurende vijf minuten op een magnetische. Decanteer de vloeistof met de CD8-positieve cellen naar een verse buis op ijs. Voeg vervolgens de resterende drie tot vier milliliter cellen toe aan de magnetische kralen en plaats de buis gedurende vijf minuten op de magneet.

Decanteer de tweede batch CD8-positieve cellen aan de buis met de eerste batch. Zaad ontworpen aanhangende fibroblast SAMBOK cellen samen met de co-stimulerende molecuul op 75,000 cellen per put in 24-well platen, en cultuur ze in een 37-graden Celsius, 5%kooldioxide bevochtigde incubator. Na 24 uur, was de APC monolayer een keer met iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium, en voeg 0,5 keer 10 aan de zes naïeve cellen in twee milliliter medium aangevuld volgens het manuscript richtingen.

Kweek de cellen voor 20 uur, dan voorzichtig oogsten van de niet-loodstaande OT-I cellen door het verzamelen van de media en pelleting de cellen op 191 keer g gedurende twee minuten. Tel de cellen en zaad ze op een één-op-één verhouding in een co-cultuur met B16/F10, onbehandelde B16/F10-OVA en B16/F10-OVA-cellen die voorbehandeld zijn met flavopiridol. Kweek de cellen gedurende 20 uur in een 37-graden Celsius, 5%koolstofdioxide bevochtigde incubator, verwijder vervolgens de OT-I CD8-positieve cellen en was de aanhangende B16/F10-OVA cellen in PBS.

Trypsinize de drie groepen van bijgevoegde cellen in 05%EDTA met trypsine gedurende vijf minuten, en dan pellet ze op 191 keer g gedurende vijf minuten. Incubeer de geoogste B16/F10-OVA cellen in koude PBS met levensvatbare kleurstof en relevante gelabelde antilichamen, dan analyseren van de levensvatbaarheid met flow cytometrie. Dit protocol is gebruikt om een transcriptie verlenging defecte cel model dat een diepgaand verlies van fosforylatie toont op de serine 2 positie op de C-terminal repeat domein van RNA polymerase II en een aanzienlijke daling van H3K36me3, die betrokken is bij het definiëren van exon grenzen en het remmen van weggelopen cryptische transcripties.

De cellen vertonen kritische mRNA-verwerkingsdefecten met toenemende verhoudingen van onjuist afgetopte en niet-polyadenylated mRNAs. Bovendien worden in dit celmodel specifieke onderdrukking van belangrijke ontstekingsreactielegenen en fasl-gemedieerde celdood waargenomen. Een verkennende test om te testen of het celmodel weerstand verleent tegen cytotoxische T-cel aanval toont aan dat chronische flavopiridol-geïnduceerde transcriptie verlenging defecten kan een middel om te ontsnappen aan een anti-tumor immuunaanval te verlenen.

Flavopiridol-behandelde B16/F10-cellen die het OVA-gen stabiel overpreiden, waren niet gevoelig voor CD8-positieve cytotoxische T-cellen, die een selectieve toxiciteit hebben ten opzichte van OVA-uitdrukkende cellen. Cellen die niet met flavopiridol zijn behandeld, ondergingen een grote celdood, terwijl ouderlijke B16/F10 die het OVA-antigeen niet uitdrukken, overleefde. Het is belangrijk om te onthouden dat vermindering van fosfosfosaat 2 en H3K36 trimethylation niveau op 25-nanomolar flavopiridol behandeling geen vermindering van zowel phopsho-STAT1 en fosfo-NF-kappaB niveau garandeert.

Elke muiscarcinoom lijn is uniek, en JAK1 en CCNT1 kan het effect van flavopiridol redden. Bovendien kan dit model in vivo worden gebruikt om de weerstand van TEdeff-kankers tegen aangeboren en adaptieve anti-tumor immuunreacties te monitoren. Anti-asialo-behandelingen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om de activiteit van NK-cellen te reguleren en immuuncontroletherapie kan worden toegediend aan TEdeff-tumordragende muizen.

De tumor-infiltreren lymfocyten, of TIL, belasting is een indicator van succes in immunotherapie. Ons model heeft de weg vrijgemaakt voor ons om de omvang van activering en uitputting van TILs in de TEdeff kanker micro-omgeving te verkennen, zowel voor als na immunotherapie.