Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing, of RIPiT-Seq, is een methode om te bepalen welke regio's van RNA gebonden zijn door een bepaald paar RNA-bindende eiwitten. Het meest unieke voordeel van RIPiT is de mogelijkheid om twee verschillende eiwitten te targeten in twee zuiveringen. Dit biedt een krachtige manier om te verrijken voor een compositorisch onderscheiden RNA-eiwitcomplex uit andere complexen.

Ook RIPiT-Seq is UV-crosslinking onafhankelijk, en kan worden toegepast op vele eiwitten die werken op RNA zonder direct binding. Hoewel deze methode zich niet rechtstreeks uitstrekt tot therapie of diagnose, zijn RNA-bindende eiwitten en RNA-verwerking geassocieerd met verschillende ziekten zoals neuropathieën en kanker. RIPiT-Seq biedt een hulpmiddel voor het bestuderen van functies van aan ziekten verbonden RNA-bindende eiwitten.

RIPiT-Seq vereist een systeem waarbij een epitoop-tagged eiwit kan worden uitgedrukt. Het is alleen getest in HEK293 cellen, en is het meest vatbaar voor celcultuur. Echter, nu met ons vermogen om eiwitten te taggen met behulp van CRISPR, RIPiT-Seq kan worden toepasbaar op diverse moderne systemen.

Het succes van RIPiT hangt af van twee efficiënte immunoprecipitaties, dus het zal van cruciaal belang zijn om immunoprecipitatievoorwaarden te optimaliseren voor het antilichaam dat wordt gebruikt. Ook het werken met RNA vereist de juiste voorzorgsmaatregelen, dus RNase-vrije reagentia moeten worden gebruikt tijdens en na RNA-extractie. Het aantonen van de procedure zal Lauren Woodward zijn, een afgestudeerde student in mijn lab.

Begin met het wassen van monolagencellen voorzichtig met 15 milliliter gekoelde PBS per 15 centimeter plaat. Schraap cellen vervolgens af in 30 milliliter PBS en verzamel ze in een conische buis van 50 milliliter. Pellet de cellen door centrifugeren op 400 g gedurende 10 minuten op 4 graden Celsius, en gooi de supernatant.

Voeg vier milliliter ijskoude hypotonische lyse buffer toe en gebruik een P1000 pipet om de cellen opnieuw op te schorten. Breng het lysaat over op een buis van vijf milliliter en incubeer 10 minuten op ijs. Plaats het lysaat in een ijsbad en sonicate volgens manuscript richtingen.

Voeg vervolgens 108 microliter van vijf molaire natriumchloride toe om de zoutconcentratie aan te passen aan 150 millimolar. Dan, centrifuge het lysaat op 12,000 g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius, en verzamel 20 microliter van de supernatant voor westerse vlek analyse. Pre-wash FLAG agarose kralen volgens manuscript aanwijzingen en van toepassing resterende supernatant tot 750 microliter van kralen in een vijf milliliter buis.

Incubeer de VLAG agarose kralen met de cel extract voor een tot drie uur op vier graden Celsius met zachte mengen. Na incubatie, pellet de kralen door centrifugatie op 400 g gedurende een minuut op vier graden Celsius, en verzamelen 20 microliters van de supernatant voor westerse vlek analyse. Gooi de resterende supernatant en was de kralen door ze opnieuw in vier milliliter iso wasbuffer.

Pellet de kralen weer en verwijder de supernatant. Verdun RNase I in 750 microliters van iso wassen buffer volgens manuscript richtingen, en voeg het toe aan de VLAG agarose kralen. Incubeer het mengsel op vier graden Celsius met zachte mengen, en vervolgens pellet de kralen door centrifugatie.

Verzamel 20 microliters supernatant voor westerse vlekanalyse en gooi de rest weg. Was vervolgens de kralen met iso wasbuffer zoals eerder beschreven. Voer vervolgens affiniteit elutie uit door 375 microliters van elutiebuffer toe te voegen aan de kralen, en schud het mengsel zachtjes op vier graden Celsius gedurende een tot twee uur.

Na incubatie, pellet de kralen en het verzamelen van een 15 microliter aliquot van de elutie voor westerse vlek analyse. Terwijl affiniteit elutie aan de gang is, uitvoeren magnetische kraal antilichaam vervoeging. Begin met het wassen van 50 microliter magnetische kralen in een milliliter iso wassen buffer.

Resuspend de kralen in 100 microliter van vervoeging buffer en voeg de juiste hoeveelheid antilichaam. Vervolgens, incubeer de kralen voor ten minste 10 minuten op kamertemperatuur. Was de magnetische kralen twee maal met vervoegingsbuffer en verdring de kralen in 375 microliter van RIPiT verdunningsbuffer.

Bewaar de kralen op ijs tot immunoprecipitatie. Breng de VLAG affiniteit elutie aan op de antilichaam gekoppelde magnetische kralen en incubeer met zachte mengen gedurende een tot twee uur bij vier graden Celsius. Leg de magnetische kralen vast met een magneet en verzamel 15 microliter supernatant voor western blot-analyse.

Was vervolgens de kralen zeven keer met iso wasbuffer. Ga verder met het denatureren van elutie door magnetische kralen in 100 microliter duidelijke monsterbuffer te hergebruiken en de suspensie op ijs gedurende 10 minuten uit te broeden. Tijdens incubatie, periodiek flick de kralen om ze opnieuw op te stellen.

Leg de magnetische kralen vast op een magneet en verzamel 15 microliter elutie voor westerse vlekkenanalyse. Breng de resterende elutie over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Om het RNA te extraheren, voeg je 320 microliter RNase-vrij water en 400 microliter fenol-chloroforme isoamylalcohol toe aan de RIPiT-elutie.

Vortex het mengsel en dan centrifugeren op 12,000 g gedurende vijf minuten. Verzamel 350 microliter van de waterige fase in een aparte buis. Voeg natriumacetaat, magnesiumchloride, glycogeen en ethanol toe aan het verzamelde monster en broed het mengsel 's nachts uit bij negatieve 20 graden Celsius.

Op de volgende dag, pellet het RNA door centrifugatie op 12,000 g gedurende 30 minuten op vier graden Celsius en was het in 70%ethanol. Behandel na de ethanolwas het RNA met T4 polynucleotide kinase, of PNK, zonder ATP, en voer fenol-chloroform zuivering uit volgens de handschriftrichtingen. Resuspend het schone RNA in 4,5 microliter RNase-vrij water.

Om de RNA-opbrengst te kwantificeren, radiolabelt het RNA met PNK en 32P gelabelde ATP's volgens de handschriftaanwijzing. Gebruik een lage afstand DNA ladder en een 20 tot 40 nucleotide synthetische oligo voor grootte en kwantiteit normen. Los het gelabelde RNA op op een 26%ureum-polyacrylamide gel.

Droog de gel volgens de handschriftrichtingen en stel de gel bloot aan een fosfoscreen totdat er voldoende signaal wordt gedetecteerd. Deze techniek is gebruikt om de interacties van het exon junction complex of EJC te onderzoeken. Westerse vlekanalyse van eiwitten gezuiverd van elke belangrijke stap in de RIPiT-procedure blijkt dat gezuiverd EJC zowel EIF4A3 als MAGOH bevat.

De negatieve controle, HNRNPA1, wordt niet gedetecteerd in de elutie. De sterkte van het RNA footprint signaal correleert met de hoeveelheid RNA eiwit interactie. Een sterkere voetafdruk wordt waargenomen wanneer RIPiT werd uitgevoerd op cellen die met puromycine worden behandeld, wat de EJC-bezetting op RNA verhoogt.

Om ervoor te zorgen dat de RIPiT effectief is geweest, is het belangrijk om de efficiëntie van het IP te testen door westerse vlek. Het is ook belangrijk om de hoeveelheid en de kwaliteit van het RNA te beoordelen voordat u verder gaat met diepe sequencing. In 2018 heeft het Singh-lab deze techniek met succes gebruikt om twee compositorisch verschillende variaties van het exonverbindingscomplex te zuiveren en RNA-bindingspatronen te identificeren.

Als onderzoekers ervoor kiezen om RNA-voetafdrukken met autoradiografie te detecteren, moeten alle juiste procedures en protocollen voor stralingsveiligheid worden gevolgd.