Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting
29 augustus 2019
We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.
Dit protocol biedt een manier om de betrokkenheid van een bepaalde factor in dubbele bevruchting van Arabidopsis te beoordelen. De bevruchtingsstatus kan in één oogopslag worden beoordeeld aan de morfologie van de spermakernen, zodat het snel verkrijgen van de gegevens voor statistische analyse mogelijk is. Deze methode is specifiek voor de beoordeling van bevruchting fenotype in Arabidopsis.
Er zijn nog onbekende bevruchtingsregelaars, zelfs als in Arabidopsis. Deze methode zou nuttig zijn voor functionele analyse van toekomstige onbekende bemestingsfactoren. Om de vaardigheid van een snelle en intacte behandeling van de ovules onder de knie te krijgen zijn belangrijk voor het succes van deze analyse.
Om te beginnen, groeien Arabidopsis thaliana op 22 graden Celsius onder een 16-uurs licht en acht uur donkere cyclus in een groeikamer. Knip en verwijder de eerste ontwikkelde bloemstengel met een schaar om de ontwikkeling van bijkomende knoppen te bevorderen. Twee tot drie weken na het afsnijden van de eerste stengel, meet de plant hoogte.
Planten met een hoogte van meer dan 25 centimeter worden beschouwd als krachtig groeiende planten en zijn geschikt voor analyse. Om te ontlasten, kijk voor knoppen in fase 11 met stukjes bloemblaadjes gezien aan de bovenkant. Gebruik een nummer vijf tangen om sepal, bloemblaadje, en meeldraden van bloemknoppen te verwijderen.
15 tot 18 uur na emasculatie, neem de meeldraden van een DMP9-knockdown lijn met achtergrond van HTR10-mRFP bloem in fase 13 door knijpen de gloeidraad met tangen. Om te bestuiven, voorzichtig dep het stigma van een ontlaste stamper meerdere malen met een dehiscent anther. Zeven tot acht uur na bestuiving, verzamel de stamper en plaats het op de dubbelzijdige tape.
Druk vervolgens voorzichtig met tangen om de stamper op de tape vast te stellen. Snijd onder een ontledenmicroscoop de boven- en onderzijde van de eierstok af met behulp van een injectienaald. Verplaats de punt van de injectienaald om de eierstokwand langs beide zijden van het represaille door te snijden.
Snijd voorzichtig om de funiculus en het zendkanaal niet te scheiden. Evert de eierstokwand. Knijp de basis van het septum waarmee ovules zijn aangesloten, en til het voorzichtig op met tangen.
Breng de ovules in een druppel water op een diaglas, en bedek voorzichtig met een coverglass voor observatie onder een fluorescentiemicroscoop. Op een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een fluorescentiefilterkubus, pas de objectieve lens aan op 20x of 40x. Verwerf afbeeldingen van de eicellen met spermakernen met een mRFP.
Bevestig het aantal mRFP-gelabelde spermakernen in een embryozak. Bevestig de vorm en positie van elke mRFP-gelabelde spermakern in een embryozak. In deze studie werden bevruchtingsfenotypes beoordeeld door sperma nuclear signaal morfologie in de ovule.
De meeste eicellen bevatten twee gedecondenseerde mRFP-gelabelde spermakernen aan de eicel micropylar kant en centrale cel charazal einde kant. Dit duidt op een succesvolle dubbele bemesting. Bovendien werden oules met een gedecondenseerde spermakern met het mRFP-label in de centrale celkern plus een gecondenseerde spermakern met het mRFP-label buiten de eicel waargenomen, wat wijst op enkele bevruchting.
In het geval van mislukte dubbele bevruchting werden twee gecondenseerde spermakernen met mRFP-label waargenomen op de grens van de eicel en de centrale cel. In de analyse met behulp van DMP9-knockdown lijn met achtergrond van HTR10-mRFP pollen, eicellen met een enkele gecondenseerde mRFP-gelabelde spermakern of drie of meer mRFP-gelabelde spermakernen werden zelden waargenomen. In combinatie met het gebruik van vrouwelijke markerlijnen kan een nauwkeurigere bevruchtingsstatus worden geanalyseerd.
Bijvoorbeeld, de bevruchting status bij na gamete fusie en vóór de karyogamie kan worden beoordeeld. Ja, het bevruchtingsproces is verdeeld in verschillende stappen. De vragen die elke bemestingsregelaar met deze verbeterde methode kan beantwoorden.
Het zou dieper inzicht geven in de seksuele voortplanting van de plant.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol biedt een methode om de fertilisatiestatus in Arabidopsis te beoordelen door de morfologie van de spermakernen te evalueren. Het maakt een snelle gegevensverzameling voor statistische analyse mogelijk, wat bijdraagt aan de functionele analyse van onbekende fertilisatiefactoren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Reproductieve biologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Dubbele bevruchting is een cruciaal proces bij bloemrijke planten.
- Het begrijpen van bevruchtingmechanismen kan onbekende regulatoren onthullen.
- Arabidopsis dient als modelorganisme voor het bestuderen van plantenreproductie.
- Het beoordelen van de morfologie van spermkernnuclei kan een indicatie geven van het succes van de bevruchting.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het bepalen van het bevruchtingssucces bij Arabidopsis.
- Om de identificatie van onbekende bevruchtingsregulatoren te vergemakkelijken.
- Om snelle gegevensverzameling voor verdere analyse mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Epifluorescencemicroscopie voor het visualiseren van spermakernen.
- Beoordeling van de nucleaire morfologie om de fertilisatiestatus te bepalen.
- Statistische analyse van de verzamelde gegevens.
- Training in technieken voor het hanteren van zaadknopjes voor nauwkeurige resultaten.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle identificatie van de fertilisatiestatus op basis van spermamorfologie.
- Aantoonbare efficiëntie bij de gegevensverzameling voor analyse.
- Het bieden van een kader voor het bestuderen van onbekende fertilisatiefactoren.
- Hervatten van het belang van de behandeling van zaadknopjes in de methodologie.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het beoordelen van de bevruchting bij Arabidopsis.
- Het opent mogelijkheden voor het onderzoeken van onbekende regulatoren van de bevruchting.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol voor functionele analyses.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Een nauwkeurige evaluatie van de fertilisatiestatus in Arabidopsis via de morfologie van de spermanuclei biedt een snelle, kwantitatieve uitlezing voor functionele analyse van fertilisatieregulatoren. Deze benadering maakt high-throughput fenotypische screening en statistische beoordeling mogelijk van kandidaatgenen of factoren die betrokken zijn bij dubbele bevruchting. De methode ondersteunt vroege ontdekking en mechanische risicoreductie op het snijvlak van plantenreproductieve biologie en trait engineering pipelines.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe fenotypische analyse van kandidaat-regulatoren van de bevruchting in vivo mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicobeperking door onderscheid te maken tussen succesvolle, gedeeltelijke en mislukte bevruchtingsgebeurtenissen.
- Faciliteert snelle triage van genetische of chemische perturbaties die de dubbele bevruchting beïnvloeden.
Screening en assay-ontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, op fluorescentie gebaseerde assay voor het kwantificeren van fertilisatieresultaten.
- Levert reproduceerbare, op beelden gebaseerde eindpunten die geschikt zijn voor statistische analyse en vergelijking tussen studies.
- Maakt schaalbare screening van mutante of transgene lijnen mogelijk voor fertilisatiefenotypes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele doelstellingen door moleculaire interventies te koppelen aan reproductieve uitkomsten in een modelsysteem.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van bevruchtingsgerelateerde targets.
- Biedt voorspellende waarde voor strategieën tot verbetering van eigenschappen in de gewasbiotechnologie wanneer dit op passende wijze wordt aangepast.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot validatie voor de engineering van reproductieve eigenschappen van planten en functionele genomica.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing van bevruchtingsregulatoren en padcomponenten mogelijk.
- Screening: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare uitleeswaarden voor assayontwikkeling en mutantscreening.
- Analytiek: Ondersteunt statistische vergelijking van bevruchtingsfenotypes over experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische bevindingen en preklinische kenmerkvalidatie in modelsystemen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor voortdurende functionele analyse van nieuwe bevruchtingsfactoren.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de validatie van targets en vermindert ambiguïteit in fertilisatiemechanismen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de fenotypische beoordeling en maakt snelle, schaalbare gegevensverzameling mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen voor kandidaatregulatoren en optimaliseert de toewijzing van middelen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van genetische of chemische interventies in pijplijnen voor reproductieve biologie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van Arabidopsis en fluorescentiemicroscopie.
- Vraagt om toegang tot epifluorescentie-beeldvorming en infrastructuur voor beeldanalyse.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor ovulendissectie en monsterpreparatie.
- Kan aanpassing behoeven voor gebruik in andere plantensoorten of modelsystemen.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van fluorescente markerlijnen voor de labeling van spermakernen.
