Name: Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Leer hoe u de bevruchtingsstatus evalueert in Arabidopsis door sperma nucleaire morfologie te analyseren. Deze methode maakt snelle dataverzameling mogelijk voor statistische analyse van onbekende bevruchtingsfactoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Japan Society voor de promotie van Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) en door financiering van het strategisch prioriteits onderzoek promotieprogramma voor fytochemische planten moleculaire wetenschappen, Universiteit van Chiba (Japan).

1. kunstmatige bestuiving
Opmerking: Voor aanvang van het proces is een paar No. 5 Tang nodig.
<ol><li>Kweek a. thaliana (Col-0) bij 22 °c onder een 16-h licht/8-h donkere cyclus in een groei kamer. Opmerking: Snijd en verwijder de eerste ontwikkelde bloemsteel met een schaar ter bevordering van de ontwikkeling van de oksel toppen. Sterk groeiende planten (2-3 weken na het snijden van de eerste Steel; plant hoogte ongeveer 25 cm) zijn geschikt voor analyse.</li>
	<li>Om te emasculeren, verwijderen kelk (Figuur 1b), Petal(figuur 1c), en meeldraden (figuur 1d) van bloemknoppen in fase 118 (Figuur 1a) met behulp van No. 5 Tang. Bud met stukjes bloemblaadjes die bovenaan te zien is, is het beste. Opmerking: Gebruik een geschikte vrouwelijke gameten marker lijn. In dit protocol gebruikten we een wild type plant als de vrouwelijke ouder.</li>
	<li>Vijftien tot achttien uur na de emasculation, neem de meeldraad van een DMP9KD/HTR10-mrfp bloem in fase 138 door het filament met een tang te knijpen.</li>
	<li>Om te bestuiven, DEP het stigma van een schuimen meerdere malen zachtjes met een en Anther.</li>
</ol>2. bereiding van de ovule voor observatie
Opmerking: De volgende items zijn vereist: een glaasje met dubbelzijdige tape, No. 5 Tang, een injectienaald van 27 G en een ontleed Microscoop.
<ol><li>7 tot 8 h na bestuiving (hap), verzamel de stamper en plaats deze op de dubbelzijdige tape, druk vervolgens zachtjes met een tang om de stamper op de tape te bevestigen (Figuur 2a, A '). Opmerking: De meeste zaadknoppen in een stamper krijgen ten minste één stuifmeel buis 10 hap9. Als beide of een van de spermacellen uit de eerste stuifmeel buis niet te bevruchten, een tweede pollen buis zou worden aangetrokken door de eicel als gevolg van de bevruchting herstel systeem10. Om de morfologie van de sperma kernen uit de eerste pollen buis te analyseren, wordt het aanbevolen om de eicel voorbereiding met 10 hap ten laatste te voltooien.</li>
	<li>Snijd de bovenste en onderste uiteinden van de eierstok met behulp van een injectienaald onder een ontleed Microscoop (Figuur 2b, B ').</li>
	<li>Spleet de eierstok aan beide zijden van de replum (figuur 2c, C ') door de punt van de injectienaald te bewegen. Opmerking: Steek de injectienaald ondiep om te voorkomen dat de eicel scheiden van het septum.</li>
	<li>Evert de eierstok met behulp van de injectienaald (figuur 2D, D ').</li>
	<li>Knijp in de basis van het septum waarop de eicellen zijn aangesloten en til deze voorzichtig op met een tang (figuur 2e).</li>
	<li>Breng de zaadknoppen over in een druppel water op een glaasje, en bedek zachtjes met een afdekglas voor observatie onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 2e, E ').</li>
</ol>3. microscopie
Opmerking: In dit protocol gebruikten we een epifluorescentie Microscoop met een fluorescentie filter kubus (Zie tabel met materialen), een digitale camera en de bijbehorende software.
<ol><li>Verkrijg afbeeldingen van zaadknoppen met sperma kernen gelabeld met mrfp met behulp van een 20x of 40x objectief lens en de uitgeruste digitale camera.</li>
	<li>Bevestig het aantal met mRFP gelabelde sperma kernen in een embryo-zak. Opmerking: Ovules met twee mRFP-gelabelde sperma kernen kunnen worden opgenomen in de populatiegrootte voor statistische analyse.</li>
	<li>Bevestig de vorm en de positie van elke met mRFP gelabelde sperma kern in een embryo SAC. Opmerking: Onmiddellijk na het vrijkomen van een pollen buis, zijn een paar gecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kernen gelokaliseerd tussen het ei en de centrale cel. Een degecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kern gedetecteerd aan de zijkant van chalazaal einde geeft bijvoorbeeld de bemesting van de centrale cel aan. Door gebruik te maken van een geschikte vrouwelijke gameten membraan marker lijn, zoals weergegeven in aanvullende Figuur 1, of de zaadcel ondergaat plasmogamie (na membraan fusie maar vóór karyogamie) kan duidelijk worden gecontroleerd.</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

HTR10-mrfp labels vaderlijke chromatine (dat wil zeggen, visualiseert sperma celkernen), en de dynamiek in dubbele bevruchting is gemeld7. Onmiddellijk na het vrijkomen van een stuifmeel buis, HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen zijn nog steeds gecondenseerd. Echter, elk van de zaad kernen is gedegecondenseerd bij het samenvoegen met een bevruchte vrouwelijke gameten Nucleus op karyogamie drie tot vier uur na gameten membraan fusie7. Onbevruchte spermacellen blijven geconden...

Bloeiende planten produceren zaden door dubbele bevruchting, een proces dat rechtstreeks wordt beheerst door interacties tussen eiwitten gelokaliseerd op gameten plasma membraan1,2. Bloeiende plant mannelijke gameten, een paar spermacellen, Ontwikkelen in pollen. Een pollen buis die groeit na bestuiving levert een paar spermacellen aan vrouwelijke gameten, een eicel en een centrale cel, die in een embryo-zak ontwikkelen. Nadat de mannelijke en vrouwelijke gameten elkaar ontmoeten, bevorderen eiwitten op het gameten-oppervlak herkenning, gehechtheid en fusie om dubbele bevruchting te voltooien. In eerdere studies werden de mannelijke gameten membraan eiwitten generatieve celspecifieke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 en gameten uitgedrukt 2 (GEX2)5 geïdentificeerd als bevruchting regulatoren die betrokken zijn bij gameten fusie en bijlage, respectievelijk. Onlangs identificeerden we een mannelijk gameten-specifiek membraan proteïne, DUF679 DOMAIN membraan PROTEIN 9 (DMP9), als een bemesting regulator die betrokken is bij gameten interactie. We constateerden dat een afname van DMP9 expressie resulteert in significante remming van de bemesting van eicellen tijdens dubbele bevruchting in a. thaliana6.
Aangezien dubbele bevruchting optreedt in een embryo-zak, die is ingebed in een eicel die verder is verpakt met ovariumweefsel, is het moeilijk om de toestanden van dubbele bevruchting processen te observeren en te analyseren. Om deze reden zijn er nog steeds veel onduidelijke punten die een volledig begrip van het hele mechanisme van dubbele bevruchting controle belemmeren. De vaststelling van observatie technieken om het gedrag van gameten te traceren tijdens dubbele bevruchting onder in vivo omstandigheden is onmisbaar voor de functionele analyse van potentiële kandidaten voor bemesting regulatoren. Recente studies hebben markeringslijnen opgeleverd waar gameten subcellulaire structuren gelabeld zijn met fluorescerende eiwitten. In dit artikel tonen we een eenvoudig en snel protocol voor het observeren van dubbele bevruchting die heeft plaatsgevonden in een embryo-zak die is afgeleid van kunstmatig bestuikte stampers. Met behulp van sperma Cell Nucleus marker lijn HTR10-mRFP7, de bevruchting staat van elke vrouwelijke gameten kan worden gediscrimineerd op basis van sperma nucleaire signaal morfologie. Ons protocol gericht op een dergelijke morfologische verandering van de sperma kernen bij bevruchting kan efficiënt een voldoende hoeveelheid gegevens verkrijgen voor statistisch bewijs. Een DMP9-knockdown lijn met HTR10-mrfp achtergrond (DMP9KD/HTR10-mrfp) werd gebruikt als mannelijke planten om een enkele bevruchting patroon tonen. Het protocol is ook geschikt voor de functionele analyse van andere bemesting regulatoren.

<table><tbody><tr><td>BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td>Epifluorescente microscoop</td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Matsunami glas</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP achtergrond Takahashi et al. (2018)6</td></tr><tr><td>Dubbelzijdig plakband</td><td>Nichiban</td><td>NW-15S</td><td>15 mm breed</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>Digitale camera</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Vigor</td><td></td><td>Elke No. 5 pincet is beschikbaar</td></tr><tr><td>Kweekkamer</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><tr><td>HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) achtergrond Ingouff et al. (2007)7</td></tr><tr><td>Injectienaald</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>Glijglas</td><td>Matsunami glas</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Olympus</td><td></td><td>Dissectiemicroscoop</td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>Olympus</td><td></td><td>Fluorescentie filter kubus (Excitatie: BP535-555, Emissi: BA570-625, Dichromatisch spiegel: DM565)</td></tr><tr><td>UPlanFL N 40x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectieflens (NA 1.3), olie-immersie</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objectieflens (NA 0.75), droog</td></tr></tbody></table>

evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in arabidopsis dubbele bevruchting

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Bloeiende planten hebben een uniek seksueel reproductie systeem dat ' dubbele bevruchting ' wordt genoemd, waarbij elk van de spermacellen nauwkeurig met een eicel of een centrale cel smelt. Zo vinden er bijna gelijktijdig twee onafhankelijke bevruchting gebeurtenissen plaats. De bevruchte eicel en de centrale cel ontwikkelen respectievelijk zygote en endosperm. Daarom is nauwkeurige controle van dubbele bevruchting essentieel voor de daaruit voortvloeiende ontwikkeling van zaaizaad. Dubbele bemesting treedt op in de vrouwelijke gametofyt (embryo SAC), die diep verborgen is en bedekt is met dikke ovalen en Eier weefsels. Deze stamper weefsel constructie maakt observatie en analyse van dubbele bevruchting heel moeilijk en heeft de huidige situatie gecreëerd waarin veel vragen over het mechanisme van dubbele bevruchting onbeantwoord blijven. Voor de functionele evaluatie van een potentiële kandidaat voor bevruchting regulator is fenotypische analyse van bemesting belangrijk. Om te oordelen over de voltooiing van de bevruchting in Arabidopsis thaliana, de vormen van fluorescentie signalen labelen van sperma kernen worden gebruikt als indicatoren. Een zaadcel die niet bevruchten wordt, wordt aangegeven door een gecondenseerd fluorescentie signaal buiten de vrouwelijke gameten, terwijl een zaadcel die met succes bemesten wordt aangegeven door een gedegecondenseerd signaal als gevolg van karyogamie met de Nucleus van de vrouwelijke gameten. De hier beschreven methode biedt een hulpmiddel om de succesvolle of mislukte bevruchting onder in vivo condities te bepalen.

Ovules van een stamper bestuikte met DMP9KD/HTR10-mrfp werden verzameld op 7-8 hap en waargenomen.
De meeste zaadknoppen bevatten twee degecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen in de eicel (micropylar Side) en de centrale cel (charazal end Side) Nucleus posities (Figuur 3a), wat duidt op een geslaagde dubbele bevruchting. Bovendien werden zaadknoppen met een degecondenseerde...

We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Dit protocol biedt een manier om de betrokkenheid van een bepaalde factor in dubbele bevruchting van Arabidopsis te beoordelen. De bevruchtingsstatus kan in één oogopslag worden beoordeeld aan de morfologie van de spermakernen, zodat het snel verkrijgen van de gegevens voor statistische analyse mogelijk is. Deze methode is specifiek voor de beoordeling van bevruchting fenotype in Arabidopsis.Er zijn nog onbekende bevruchtingsregelaars, zelfs als in Arabidopsis. Deze methode zou nuttig zijn voor functionele analyse van toekomstige onbekende bemestingsfactoren. Om de vaardigheid van een snelle en intacte behandeling van de ovules onder de knie te krijgen zijn belangrijk voor het succes van deze analyse.Om te beginnen, groeien Arabidopsis thaliana op 22 graden Celsius onder een 16-uurs licht en acht uur donkere cyclus in een groeikamer. Knip en verwijder de eerste ontwikkelde bloemstengel met een schaar om de ontwikkeling van bijkomende knoppen te bevorderen. Twee tot drie weken na het afsnijden van de eerste stengel, meet de plant hoogte.Planten met een hoogte van meer dan 25 centimeter worden beschouwd als krachtig groeiende planten en zijn geschikt voor analyse. Om te ontlasten, kijk voor knoppen in fase 11 met stukjes bloemblaadjes gezien aan de bovenkant. Gebruik een nummer vijf tangen om sepal, bloemblaadje, en meeldraden van bloemknoppen te verwijderen.15 tot 18 uur na emasculatie, neem de meeldraden van een DMP9-knockdown lijn met achtergrond van HTR10-mRFP bloem in fase 13 door knijpen de gloeidraad met tangen. Om te bestuiven, voorzichtig dep het stigma van een ontlaste stamper meerdere malen met een dehiscent anther. Zeven tot acht uur na bestuiving, verzamel de stamper en plaats het op de dubbelzijdige tape.Druk vervolgens voorzichtig met tangen om de stamper op de tape vast te stellen. Snijd onder een ontledenmicroscoop de boven- en onderzijde van de eierstok af met behulp van een injectienaald. Verplaats de punt van de injectienaald om de eierstokwand langs beide zijden van het represaille door te snijden.Snijd voorzichtig om de funiculus en het zendkanaal niet te scheiden. Evert de eierstokwand. Knijp de basis van het septum waarmee ovules zijn aangesloten, en til het voorzichtig op met tangen.Breng de ovules in een druppel water op een diaglas, en bedek voorzichtig met een coverglass voor observatie onder een fluorescentiemicroscoop. Op een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een fluorescentiefilterkubus, pas de objectieve lens aan op 20x of 40x. Verwerf afbeeldingen van de eicellen met spermakernen met een mRFP.Bevestig het aantal mRFP-gelabelde spermakernen in een embryozak. Bevestig de vorm en positie van elke mRFP-gelabelde spermakern in een embryozak. In deze studie werden bevruchtingsfenotypes beoordeeld door sperma nuclear signaal morfologie in de ovule.De meeste eicellen bevatten twee gedecondenseerde mRFP-gelabelde spermakernen aan de eicel micropylar kant en centrale cel charazal einde kant. Dit duidt op een succesvolle dubbele bemesting. Bovendien werden oules met een gedecondenseerde spermakern met het mRFP-label in de centrale celkern plus een gecondenseerde spermakern met het mRFP-label buiten de eicel waargenomen, wat wijst op enkele bevruchting.In het geval van mislukte dubbele bevruchting werden twee gecondenseerde spermakernen met mRFP-label waargenomen op de grens van de eicel en de centrale cel. In de analyse met behulp van DMP9-knockdown lijn met achtergrond van HTR10-mRFP pollen, eicellen met een enkele gecondenseerde mRFP-gelabelde spermakern of drie of meer mRFP-gelabelde spermakernen werden zelden waargenomen. In combinatie met het gebruik van vrouwelijke markerlijnen kan een nauwkeurigere bevruchtingsstatus worden geanalyseerd.Bijvoorbeeld, de bevruchting status bij na gamete fusie en vóór de karyogamie kan worden beoordeeld. Ja, het bevruchtingsproces is verdeeld in verschillende stappen. De vragen die elke bemestingsregelaar met deze verbeterde methode kan beantwoorden.Het zou dieper inzicht geven in de seksuele voortplanting van de plant.

evaluation-fertilization-state-tracing-sperm-nuclear-morphology

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen...

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Hier beschrijven we een verbetering van de semi-in vitro (SIV) methode voor het observeren van pollenbuisgeleiding en -ontvangst in Arabidopsis thaliana, die de ontvankelijkheid van eitjes verhoogt. De high-throughput SIV cum septum-methode kan worden gekoppeld aan gametofytmarkerlijnen en genetisch gecodeerde biosensoren om het dynamische proces van bevruchting te volgen.

Live beeldvorming van Arabidopsis pollenbuisontvangst en dubbele bevruchting met behulp van de semi-in vitro cum septum methode

Een verbeterde methode om pollenhydratatieprofielen in Arabidopsis thaliana te meten wordt hier beschreven. De nieuwe methode biedt een hogere resolutie, is niet-invasief en is zeer reproduceerbaar. Het protocol vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor een fijnere ontleding van de processen die de vroege stadia van bestuiving reguleren.

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Chromosoombeweging tijdens de meiotische profase is een slecht begrepen fenomeen dat fundamenteel is voor sporenvorming. Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen, analyseren en kwantificeren van centromeerbewegingen tijdens de meiotische profase in mannelijke meiocyten van Arabidopsis thaliana .

Live beeldvorming karakterisering van centromeerbewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana

Leer hoe u de bevruchtingsstatus evalueert in Arabidopsis door sperma nucleaire morfologie te analyseren. Deze methode maakt snelle dataverzameling mogelijk voor statistische analyse van onbekende bevruchtingsfactoren.

Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting

Meer video's verkennen