Name: Dubbele DNA-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer de dubbele DNA-liniaal-methode om ribosoomtranslocatie te bestuderen met enkel-nucleotide-resolutie. Deze techniek onderzoekt zowel de ingangs- als uitgangszijde van mRNA in ribosoomcomplexen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. erkent de steun van de Welch Foundation (E-1721).

1. bereiding van de ribosoom complexen
<ol><li>Maak 1.000 mL TAM10-buffer, die bestaat uit 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4cl, 70 mm KCl, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) en 0,05% Tween20.</li>
	<li>Bereid de vijf in tabel 1genoemde mengsels voor. Opmerking: het ribosoom was van de MRE600 stam11. EF-TU: rek factor Thermo onstabiel. EF-TS: rek factor Thermo stabiel. GTP: calciumguanosine trifosfaat. PEP: fosho (ENOL) pyruvate.</li>
	<li>Inbroed de vijf mengsels afzonderlijk bij 37 °c gedurende 25 minuten alvorens de ribosoom complexen te maken. Bereid de vijf ribosoom complexen voor volgens tabel 2. Opmerking: post-translocatie; Pre: pre-translocatie.</li>
	<li>Voeg elk van de vijf ribosoom complexen afzonderlijk toe op een 1,1 M sucrose-kussen, met volume ratio 1:1. Reinig elk met 450.000 × g voor 2 uur in een ultra-centrifuge. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en de ribosoom complexen te herstellen bij-80 °c na resuspensie van de pellet met TAM10 buffer.</li>
</ol>2. bereiding van glazen glaasjes met biotine coating
<ol><li>Voorlopige reiniging van de glaasjes<ol>
<li>Plaats 12 glazen glijbanen met afmetingen van 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (L × b × T) in een korte en brede glazen schaal.</li>
		<li>Vul de glazen schaal met aceton en sonicaat gedurende 5 min. Was dan de glijbanen met ultrapuur water 5 keer en vul 3/4 van het gerecht met water.</li>
		<li>Voeg 10 M KOH toe om het gerecht te vullen en de glasplaten gedurende 20 minuten te soniceren. was de glijbanen 5 keer met water.</li>
		<li>Voeg gedurende 5 minuten ethanol en sonicaat toe, giet de ethanol uit en droog ze vervolgens apart bij 300 °C gedurende 3 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aminosilaan coating<ol>
<li>Plaats de 12 gereinigde dia's terug in de glazen schaal met methanol. Reinig een PEGylation kolf met methanol door sonicatie gedurende 5 minuten, vul het vervolgens met 25 mL methanol, 1,25 mL water, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropyltriethoxysilaan (AMEO).</li>
		<li>Vervang de methanol onmiddellijk in de glazen schaal door de bereide AMEO-oplossing. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Spoel de glijbanen meerdere malen met water en droog ze vervolgens door stikstof zuivering. Plaats de gedroogde glijbanen in schone glas gerechten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PEGlation<ol>
<li>Bereid de NaHCO3 -oplossing (8,4 mg/ml) en de pegylation-buffer (37,5 mg Peg, 6 mg biotinyleerd Peg, 150 μL NaHCO3 oplossing). Meng ze goed door te spinnen bij 6.000 rpm gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Plaats 25 μL PEG-oplossing op elke dia. Dek het af met de andere Slide bovenop. Zorg ervoor dat er geen bellen tussen de twee dia's zitten.  Plaats de dia's in een leeg vak met pipetpunt. Zorg ervoor dat de doos is genivelleerd en plaats het in een donkere lade voor ongeveer 3 uur.</li>
		<li>Spoel de dia's met water en weer droog. Bewaar de gedroogde glaasjes tot 2 weken bij kamertemperatuur onder vacuüm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. monstervoorbereiding voorafgaand aan magnetische en krachtmetingen
<ol><li>Machine een kunststof monster goed met afmetingen 4 × 3 × 2 mm3 (L × W × D). Lijm een stuk biotinegecoat glas (ongeveer 5 mm lang, gesneden uit de 60 mm lange glaasjes bereid in rubriek 2) op het bodemoppervlak met behulp van epoxy.</li>
	<li>Voeg 20 μL 0,25 mg/mL streptavidine waterige oplossing in het monster goed toe en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 40 min. Spoel het monster vervolgens tweemaal met de TAM10 -buffer.</li>
	<li>Immobiliseer de ribosoom complexen.<ol>
<li>Zonder antibiotica: gebruik een pipet om de buffer uit het monster goed te verwijderen en voeg vervolgens 20 μL 0,1 μM ribosoom complex (MF-pre of MF-post) toe aan het monster goed. Het ribosoom complex zal binden met de streptavidine op het oppervlak via de 5 '-end Biotine op de mRNA. Inincuberen bij 37 °C gedurende 1 uur en vervolgens één keer spoelen met TAM10 -buffer.</li>
		<li>Voor het experiment met zowel neomycine als Fusidinezuur: incuberen het MF-pre complex met Neomycine bij 37 °C gedurende 10 minuten; inincuberen EF-G met Fusidinezuur bij 37 °C gedurende 20 min. De concentraties zijn als volgt: 0,1 μM ribosoom complex, 2 μM EF-G, 4 mm GTP, 4 mm Pep, 0,02 mg/ml pyruvaat kinase, 0,2 mm neomycine en 0,25 mm Fusidinezuur.</li>
		<li>Voer de andere antibiotica experimenten op dezelfde manier uit. De concentraties zijn als volgt: 0,2 mM viomycine, 0,4 mM hygromycine B, en 0,25 mM Fusidinezuur.</li>
		<li>Voor frameverschuivende studie herhaalt U de bovenstaande stappen voor de complexen MFNF-pre en MFNF-post met het gladde motief U6A. Gebruik antibiotica Fusidinezuur plus neomycine, en Fusidinezuur alleen, respectievelijk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder de buffer uit het monster goed, voeg vervolgens 20 μL van 1 μM biotinyated indringende DNA-streng toe en incuberen bij kamertemperatuur 's nachts. Spoel het gevormde DNA-mRNA duplex eenmaal af met TAM10 buffer.</li>
	<li>Verwijder de buffer uit het monster goed. Voeg vervolgens 20 μL van 0,5 mg/mL streptavidine gecoate magnetische parels in het monster goed en incuberen bij kamertemperatuur 2 uur.</li>
	<li>Steek het monster voorzichtig goed in een houder en plaats het in een centrifuge. Verwijder de vrije magnetische deeltjes van het oppervlak door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 84 x g .</li>
</ol>4. magnetische en krachtmetingen
<ol><li>De laser inschakelen<ol>
<li>Schakel de laser in met de toets. Druk vervolgens op de aan/uit-knop.</li>
		<li>Pas de gevoeligheid van de lock-in versterker 1 (LIA1) aan op 500 mV en wacht ongeveer 2 uur om op te warmen en de atomaire magnetometer te stabiliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>De atomische magnetometer instellen<ol>
<li>Voer de instrument Control software uit en stel de Meetparameters in. Sommige parameters kunnen in elke meting enigszins afwijken. Opmerking: de atomische magnetometer bestaat uit een laser (hierboven beschreven), een SR830 lock-in versterker (aangeduid als LIA1), een SR530 lock-in versterker (aangeduid als LIA2), DS345 (aangeduid als FG1) en ATF20B (aangeduid als FG2) functie generatoren, een hoge-resolutie motor en een computer. Al deze moeten worden ingeschakeld bij deze stap van het protocol.</li>
		<li>Stel de bewegende modus van de motor in op ruis en de standaardpositie op 0. Druk op slot op voorpaneel, stel de gevoeligheid van LIA1 terug naar 200 mV.</li>
		<li>Pas de stroom en spanning van de laser aan en vind de juiste resonantie piek en signaal-ruisniveau. Druk op sweep op het voorpaneel. Opmerking de verhouding amplitude/breedte moet hoger zijn dan 0,5 en de fase waarde moet lager zijn dan 5 graden. Zo niet, voer dan de sweep-stap opnieuw uit.</li>
		<li>Plug-in de uitgang van LIA2 naar de feedback van de laser om de frequentie te vergrendelen. Deze versterker meet de optische rotatie van een hulp cesium cel om de laser frequentie op resonantie12te behouden. De toestand blijft tot het einde van de meting.</li>
		<li>Plug-in functiegenerator FG2 voor het invoeren van een vierkante Golf (500 mVpp, 100 mHz) als het referentiesignaal. De vierkante golf komt overeen met 100 pT en wordt gebruikt om de huidige uitgang van de versterker te converteren naar een magnetisch signaal. Koppel de functiegenerator los.</li>
		<li>Stel de motor bewegende modus in op twee richtings- en standaardpositie tot 260 mm. Controleer de status van de temperatuurregelaar om de juiste temperatuur (~ 37 °c) van de atoom sensor te garanderen.</li>
		<li>Controleer de stabiliteit van het hele systeem door twee keer de signalen van de lege monsterhouder te meten. Evalueer de stabiliteit en het geluidsniveau na aftrek van de twee sporen. Typische geluidsniveau en fluctuatie moet ± 2 pT zijn bij 30 MS integratie tijd.</li>
	</ol></li>
	<li>Het monster magnetiseren<ol>
<li>Plaats het monster voorzichtig op het magnetisatie station en laat het 2 minuten blijven. Opmerking: het magnetisatie station bestaat uit een permanente magneet (~ 0,5 T) en een plastic afstandhouder.</li>
		<li>Plaats het monster terug in de monsterhouder. Gebruik 335,4 × g centrifugale kracht om de niet specifiek gebonden magnetische deeltjes te verwijderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetische metingen na het aanbrengen van krachten<ol>
<li>Gebruik pincet om het monster op de motor te laden. Klik op vergrendelen op het voorpaneel om het programma uit te voeren. Gebruik ondertussen een pincet om het andere monster in de houder te laden en in de centrifuge te plaatsen. Houd er rekening mee dat de gecoate glazen zijde het midden van de centrifuge moet worden geconfronteerd. Opmerking: de techniek van Force-geïnduceerde restant magnetisatie spectroscopie (FIRMA'S) wordt gebruikt, die een atomische magnetometer gebruikt om het magnetische signaal van het monster te meten na het aanbrengen van mechanische kracht op de moleculaire interacties in het monster. Hier zijn de moleculaire interacties tussen de DNA-liniaal moleculen en de mRNA in het ribosoom complex. De kracht wordt stapsgewijs verhoogd door de centrifugale snelheid te verhogen. Na het aanbrengen van elke kracht vertaalt de motor het monster naar de atoom sensor en gaat vervolgens terug. Vandaar dat er twee magnetische veld profielen worden verkregen, één tijdens de voorwaartse scan en de andere tijdens achterwaartse scan13. We gebruiken deze laatste alleen om de piekhoogte te extraheren vanwege de betere signaal-ruis verhouding. De piekhoogte in stroom (nA) wordt omgezet in magnetische signaalamplitude (pT) op basis van de kalibratie vierkante Golf.</li>
		<li>Elke meting duurt ongeveer 5 min. Wanneer de motor weer op 0 komt, klikt u op Opslaan op het voorpaneel. Gebruik zorgvuldig pincet om monsters te nemen van motor en centrifuge. Gebruik de initiële snelheid overeenkomend met 335,4 × g (2000 rpm, omwenteling per minuut voor de centrifuge vermeld in de tabel van de materialen).</li>
		<li>Wissel de twee monsters uit en breng een sterkere kracht aan door de centrifugale snelheid te verhogen met 100 rpm of een vergelijkbare stapgrootte. Proces afwisselend om de kracht geleidelijk te verhogen; een volledig kracht spectrum wordt verkregen na 10-12 gegevenspunten.</li>
	</ol></li>
	<li>Het experiment afronden<ol>
<li>Wanneer alle geplande experimenten zijn voltooid, schakelt u de apparatuur uit en gaat u verder in de tegenovergestelde volgorde zoals deze is ingeschakeld.</li>
		<li>Verwijder de monsters van de houder en dompel ze onder in ethanol voor reiniging en toekomstig gebruik. Reinig de monsterhouder met aceton in geval van verontreiniging van de magnetische kralen.</li>
	</ol></li>
	<li>Data-analyse<ol>
<li>Open het python Analysis script en voer alle experimentele gegevens in. Klik op vierkant laden om de vierkante Golf als referentie in te voeren. Dan klikken Load baseline om het resterende magnetische signaal als achtergrond in te voeren.</li>
		<li>Definieer het totale magnetische signaal afname als B0. Normaliseer elk magnetisch signaal Verlaag b naar b0 en druk het af als een percentage. Plot het percentage (B/B0) versus centrifugale kracht om het spectrum van de bedrijven te verkrijgen. Opmerking: de centrifugale kracht F wordt berekend uit de drijvende massa van de magnetische kralen m (4,6 × 10− 15 kg), centrifugale snelheid w en straal van de centrifuge r (7,5 cm hier) via vergelijking F = mw 2 r. de typische kracht resolutie is 2-4 PN en Force range is 15-95 PN in dit werk.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structural+dynamics+in+translocation%3A+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).</li>
<li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li>
<li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li>
<li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li>
<li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li>
<li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15(2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li>
<li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li>
<li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+DNA+rulers+reveal+an+%22mRNA+looping%22+intermediate+state+during+ribosome+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li>
<li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+%22-1%22+and+%22-2%22+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li>
<li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li>
<li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li>
<li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range%2C+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li>
<li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry%2C+translocation+and+exit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005(2008).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li>
<li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li>
<li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li>
<li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li>
</ol>

Er werd geen potentiële belangenverstrengeling gerapporteerd door auteurs.

In onze dubbele liniaal testspelen de magnetische kralen twee essentiële rollen. Ten eerste dienen ze als de kracht transducers omdat de centrifugale kracht evenredig is aan hun drijvende massa. Ten tweede, de parels zijn signaal dragers gedetecteerd door een atomaire magnetometer, die momenteel de meest nauwkeurige magnetische sensor. Door mechanische manipulatie en magnetische detectie te combineren, kan de techniek van de FIRMA'S een groot aantal moleculaire interacties oplossen op basis van hun kritische dissociatie ...

Biomoleculaire verplaatsing is een fundamentele parameter bij het bestuderen van het mechanisme van de verwante biologische functies. Een specifiek voorbeeld is de ribosoom translocatie1,2, waarbij het ribosoom beweegt door exact drie nucleotiden (NT) op het boodschapper-RNA (mRNA) normaal, en door één, twee of andere nummers van NT behalve drie in het geval van frameshifting. Daarom is een moleculaire liniaal systeem single-NT-resolutie vereist om onderscheid te maken tussen de verschillende stapgroottes. Een grotere uitdaging is om de ribosoom beweging op zowel de ingangs-als de uitgangszijde te sonde. Met andere woorden, alleen met een dubbele liniaal systeem zullen we in staat zijn om te onthullen of de mRNA soepel door het ribosome is verbonden, of er zijn tussenliggende stappen waarbij de twee zijden verschillende stap maten hebben die leiden tot een knikte of lus mRNA-conformatie in de ribosoom.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de eerste uitdaging aan te pakken bij het oplossen van verschillende stappen aan de uitgang van het ribosoom (het 3 ' uiteinde van de mRNA). De dubbele plaats-assay lost de verschillende Lees frames op door de verhoudingen van de resulterende verschillende eiwitten3,4te meten. Het is alleen van toepassing voor het 3 ' einde van de mRNA en dus onvoldoende om een volledig beeld van translocatie te bieden. Massaspectrometrie kan de verschillende peptide fragmenten analyseren als gevolg van de overeenkomstige code herschikkingen5. Maar het kan niet aangeven hoeveel NT het ribosoom beweegt op de mRNA. De toe-Printing test is een andere veelgebruikte methode die een reverse transcriptase gebruikt die op het 3 '-distale uiteinde wordt geprimeerd om de mRNA in de richting van het ribosoom6te transcriberen. Het is echter niet van toepassing op het 5 ' einde van mRNA dat het ribosome binnenkomt. Andere technieken, waaronder enkelvoudige molecuul benaderingen en fluorescentie methoden7, zijn moeilijk te bereiken met een enkele NT-resolutie.
We hebben de dubbele DNA-liniaal test ontwikkeld die op unieke wijze zowel de ingangs-als uitgangsposities van de ongedekte mRNA in ribosome-mRNA-complexen kan bepalen.  De liniaal-Dna's zijn DNA-oligomeren die duplexen vormen van bepaalde aantallen baseparen (BP) met de mRNA die door het ribosome worden blootgelegd, ongeacht welk uiteinde van de mRNA. De BP-nummers onthullen dan precies de ribosoom positie op de mRNA tijdens translocatie. De BP-nummers van de Duplexen worden bepaald door hun kritische dissociatie krachten verkregen uit door kracht geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma's)8. Met 2-3 pN-kracht onzekerheid zijn de kritische krachten voldoende om single-NT-resolutie aan te bieden. Door het implementeren van een linker molecuul op de DNA-linialen, kan de sterisch-belemmerde zijde van de mRNA door het ribosoom worden geprobed. Verschillende ribosomale verplaatsingen kunnen dus nauwkeurig worden opgelost. We hebben met succes onthuld een unieke lus conformatie van mRNA gevangen door antibiotica tijdens translocatie9, en opgelost verschillende Lees kaders die naast elkaar bestonden op een gladde mRNA sequentie10. Dit artikel beschrijft de details van de dubbele liniaal Assay, waaronder de voorbereiding van de ribosoom complexen, oppervlakte functionalisatie van de glasplaten, immobilisatie van de ribosoom complexen en hun hybridisatie met magnetisch gelabelde DNA-liniaal moleculen, magnetische detectie en kracht spectrum analyse door bedrijven.

<table><tbody><tr><td>Styrene Strip</td><td>City of Industry</td><td>MS-861</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Evaporated Coatings</td><td></td><td>60.0 &times; 4.0 &times; 0.3 mm3</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilaan</td><td>UCT specialties</td><td>21400088</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>154-82</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>152-84</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Epoxylijm</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>ThermoFisher</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>Fusidisch zuur</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0756-1G</td><td></td></tr><tr><td>Neomycinesulfaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>1458009</td><td></td></tr><tr><td>Viomycinesulfaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>1715000</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO</td><td>774750</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8877-100MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pyruवाatkinase</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1506-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7903-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>mRNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>133899727</td><td>5&prime;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&prime;&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>157468630</td><td>3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>164845370</td><td>3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>157468628</td><td>3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>163472705</td><td>3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>138678130</td><td>3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&rsquo;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>138678131</td><td>3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>138678132</td><td>3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>138678133</td><td>3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&rsquo;&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ultracentrifuge</td><td>Hitachi</td><td>CS150FNX</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>VWR</td><td>VM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in versterker</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in versterker</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR830</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6918-D</td><td></td></tr><tr><td>Functiegenerator</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DS345</td><td></td></tr><tr><td>Fotodetectoren</td><td>Thorlabs</td><td>DET36A</td><td></td></tr></tbody></table>

dubbele dna-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

De ribosoom translocatie verwijst naar de ribosomale beweging op de mRNA door exact drie nucleotiden (NT), wat de centrale stap is in de eiwitsynthese. Om het mechanisme te onderzoeken zijn er twee essentiële technische vereisten. Ten eerste is een single-NT-resolutie die normale translocatie van frameshifting kan oplossen, waarbij het ribosoom met andere dan 3 NT beweegt. De tweede is de mogelijkheid om te sonde zowel de ingang en de uitgang van de zijden van mRNA om het hele beeld van translocatie te verhelderdateren. We rapporteren de dubbele DNA-liniaal test die is gebaseerd op de kritische dissociatie krachten van DNA-mRNA-duplexen, verkregen door kracht-geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma's).  Met 2-4 pN Force Resolution is de dubbele liniaal test voldoende om verschillende translocatie stappen te onderscheiden. Door een lange linker op de indringende dna's te implementeren, kunnen ze de mRNA aan de andere kant van het ribosome bereiken, zodat de mRNA-positie voor beide zijden kan worden bepaald. Daarom is de dubbele liniaal test uniek geschikt om de ribosoom translocatie en nucleïnezuur beweging in het algemeen te onderzoeken. We tonen representatieve resultaten die een lus mRNA-conformatie en een opgeloste normale translocatie van frameshifting hebben aangegeven.

Figuur 1 toont het detectie schema en de foto's van de belangrijkste componenten. Magnetische detectie wordt bereikt door een atomische magnetometer met behulp van het scanschema (Figuur 1A)13. Het monster wordt geplaatst op een staaf gemonteerd op een lineaire motor. De motor vervoert het monster naar de atoom sensor in een magnetisch schild en vervolgens terug naar de oorspronkelijke locatie voor het lossen. De atomisch...

Dubbele DNA-liniaal assay is ontwikkeld om de mRNA-positie tijdens ribosoom translocatie te bepalen, die afhankelijk is van de dissociatie krachten van de gevormde DNA-mRNA-duplexen. Met single-nucleotide resolutie en mogelijkheid van het bereiken van beide uiteinden van mRNA, het kan mechanistische inzichten bieden voor ribosoom translocatie en sonde andere nucleïnezuur verplaatsingen.

Dubbele DNA-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

De dubbele DNA-liniaaltest kan mechanistische inzichten bieden voor ribosoomtranslocatie en andere nucleïnezuurverplaatsingen sonde. Onze dubbele DNA-liniaaltest is momenteel de enige methode die objectief zowel de in- als uitgangszijden van mRNA in de ribosoomcomplexen met single-nucleotideresolutie kan onderzoeken. Soortgelijke methoden worden ook toegepast om DNA-bindingssterkte en selectiviteit van chemotherapeutische geneesmiddelen te meten.Visuele demonstratie van de methode is een goede kans voor ons om intuïtief de voordelen van onze techniek te laten zien en andere onderzoekers te helpen om deze verder te ontwikkelen tot meer toepassingen. Om te beginnen, maak een plastic monster goed met een styreen strip door het boren van een kubus in het midden met afmetingen van vier millimeter door drie millimeter door twee millimeter. Dan, met behulp van epoxy, lijm een stuk biotine gecoate glas, van ongeveer vijf millimeter lang, aan de onderkant.Voeg 20 microliter van 0,25 milligram per milliliter streptavidin waterige oplossing in het monster goed, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Spoel het monster vervolgens twee keer goed af met TAM10 buffer. Om de ribosoo

dual-dna-rulers-to-study-mechanism-ribosome-translocation-with-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

Optische pincetten zijn gebruikt om RNA-vouwing te bestuderen door individuele moleculen uit te rekken vanaf hun 5’ en 3’ uiteinden. Hier worden gebruikelijke procedures beschreven voor het synthetiseren van RNA-moleculen voor tweezing, kalibratie van het instrument en methoden om enkele moleculen te manipuleren.

Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

3D single-molecuul lokalisatie microscopie wordt gebruikt om de ruimtelijke posities en bewegings trajecten van fluorescently gelabelde eiwitten in levende bacteriële cellen te sonde. Het experimentele en data-analyse protocol dat hierin wordt beschreven, bepaalt het heersende diffusieve gedrag van cytosolische eiwitten op basis van gegroepeerde enkelvoudige molecuul trajecten.

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Hier wordt een nanosfeerlithografiemethode beschreven voor parallelle fabricage van zero-mode golfgeleiders, die arrays van nanoapertures zijn in een met metaal beklede glazen microscopie coverslip voor beeldvorming met één molecuul bij nano- tot micromolarconcentraties van fluoroforen. De methode maakt gebruik van colloïdale kristal zelfassemblage om een waveguide sjabloon te maken.

Fabricage van Zero Mode Waveguides voor hoge concentratie single molecule microscopie

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Single molecule fluorescentie energieoverdracht is een methode die de tRNA-dynamiek volgt tijdens ribosomale eiwitsynthese. Door individuele ribosomen te volgen, worden inhomogene populaties geïdentificeerd, die licht werpen op mechanismen. Deze methode kan worden gebruikt om biologische conformatieveranderingen in het algemeen te volgen om dynamisch-functierelaties in vele andere complexe biosystemen te onthullen. Single molecule-methoden kunnen niet-snelheidsbeperkende stappen en laagbevolkte...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Het vertalen van ribosomen decodeert drie nucleotiden per codon in peptiden. Hun beweging langs mRNA, vastgelegd door ribosoomprofilering, produceert de voetafdrukken die karakteristieke triplet periodiciteit vertonen. Dit protocol beschrijft hoe RiboCode te gebruiken om deze prominente functie te ontcijferen uit ribosoomprofileringsgegevens om actief vertaalde open leesframes op het niveau van het hele transcriptoom te identificeren.

De novo Identificatie van actief vertaalde open leesframes met ribosoomprofileringsgegevens

Het protocol beschrijft de single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) -methode om ribosomale RNA-transcripten te onderscheiden die zijn afgeleid van de X- of Y-chromosoom ribosomale DNA-locus in Drosophila melanogaster.

Single Nucleotide Polymorfisme-gevoelige FISH-detectie van Locus-specifieke ribosomale RNA-transcriptie in Drosophila melanogaster

Leer de dubbele DNA-liniaal-methode om ribosoomtranslocatie te bestuderen met enkel-nucleotide-resolutie. Deze techniek onderzoekt zowel de ingangs- als uitgangszijde van mRNA in ribosoomcomplexen.

Dubbele DNA-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie

Meer video's verkennen