Meten van interacties tussen fluorescentie sondes en lignine in plantendelen door sFLIM op basis van inheemse Autofluorescentie

In lignocellulosebiomassa wordt de activiteit van enzymen die polystochariden analyseren beperkt door het bestaan van niet-specifieke interacties met lignine. FRET-analyse is een relevante benadering voor evolutie op nanoschaal. Het verkrijgen van alle secties na kan een uitdaging zijn, afhankelijk van de biomassa.

Neem de tijd om de sectie met de microtome te doen en het uitvoeren van zachte wassen. Het samenslepen van fluorescerende levensduur- en spectrummetingen maakt een kwantitatieve gevoelige en ondubbelzinnige FRET-bepaling tussen lignine- en TAG-moleculen in situ mogelijk. Deze methode maakt gebruik van het gebruik van lastige technieken, zoals monster sectie op multidimensionale microscopie verwerving en analyse die gemakkelijk kan worden geleerd met een visuele demonstratie.

Voor het voorbereiden van plantenmonsters van hout, tarwe, vezels of fragmenten gebruik scheermesjes om een centimeter lange monsters te snijden zonder de structuur van het materiaal te beschadigen en de monsters onder vacuüm te plaatsen om lucht te verwijderen. Dompel de monsters gedurende 24 uur onder in opeenvolgende 30% en 50% concentraties PEG verdund in water bij kamertemperatuur met zacht roeren. Gevolgd door 24 uur ondergedompeld in een 100% concentratie van PEG bij 70 graden Celsius.

Na de 100%PEG-onderdompeling, plaats de monsters in capsules op een 70 graden Celsius kookplaat en geleidelijk verlagen van de plaattemperatuur in vijf graden Celsius stappen totdat de plaat kamertemperatuur bereikt. Wanneer de monsters zijn afgekoeld, gebruik dan een microtome en wegwerpbladen om zorgvuldig te verkrijgen platte 30 tot 60 micrometer dikke secties van elk PEG-blok. Haal de PEG uit de secties met drie vijf minuten zachte waterwasbeurten.

Na de laatste wasbeurt, uitbroeden tot drie secties per buis met 500 microliters van vers bereide fluorescerende sonde voor 72 uur beschermd tegen licht. Gebruik aan het einde van de kleuringsincubatie een borstel om de secties naar een dia over te brengen voordat u de secties tussen een glazen schuif en een nummer 1.5H-afdekslip monteert. Om de spectrale vensterbreedte van de sFLIM-detector te bepalen, plaatst u ureumkristallen in een kweekdoos met een glazen bodem van 0,17 micrometer en plaatst u de doos op een microscoopmonsterhouder.

Selecteer de 20X doelstelling en een titanium geslepen saffier laser met een 900 nanometer golflengte en 2% vermogen en zet het scannen. Als u sFLIM-metingen wilt uitvoeren, schakelt u het systeem in op de SFLIM-modus. Om het tweede harmonische signaal op de sFLIM-detector te verzamelen, past u geleidelijk de laserexcitatiegolflengte aan van 900 tot 980 nanometer tot het tweede harmonische signaal wordt verzameld in het tweede spectrale kanaal.

Bepaal vervolgens de spectrale vensterlengte. Schakel over naar de niet-gescande modus om fluorescerende fotonen naar de sFLIM-detector te sturen. Stel de sFLIM-acquisitie in op de enable-modus om foton op de enkele fotonteller te laten tellen.

Wanneer het instrument klaar is, plaats een controle inheemse tarwe stro alleen plant sectie tussen de dia en de cover slip op de microscoop stadium en stel het systeem op Continuous Mode om de laser scan mogelijk te maken. Stel een 30 seconden tijd collectie en controleer of de constante fractie discriminator is tussen een keer 10 tot de vierde en een keer 10 tot de zesde. Selecteer vervolgens het meetgebied op het voorbeeld en klik op Start.

Sla aan het einde van de meting het sdt-bestand op en herhaal de meting voor ten minste negen monsters. Er moet een evenwicht worden gevonden tussen het bereiken van voldoende verzamelde fotonen voor het foton, terwijl het vermijden van puls opkopen en foto geïnduceerde effecten die de florescentie levensduur kan veranderen. Top analyseren van de verworven sFLIM gegevens, importeren van de inheemse tarwe stro alleen gegevensbestanden in de enkele foton teller software en open Optie en mode om onvolledige Multi Exponentiële 12,5 nanoseconden te selecteren.

Selecteer onder Opties en voorkeuren de optie Automatisch instrumentale respons berekenen en selecteer het model Exponentieel passen. Pas voor elk kanaal het montagemodel toe en sla de pasvormparameters op in een spreadsheet. Voor een vergelijking tussen de kanalen en experimenten bereken de belangrijkste fluorescentie levensduur in een spreadsheet.

Om de gemiddelde levensduur van ten minste 10 monsters in alle kanalen te berekenen, analyseert u de hoofdlfluoretische levensduur op de donorkanalen om de toegewezen kanaalwaarde te bepalen die het hoogste fotonnummer heeft gekozen en overeenkomt met de lignine maximale emissie. Om de sFLIM- en EFRET-waarden te vergelijken tussen het monster van het inkomende tarwestrocontrole en een experimenteel monster, moet u een positieve EFRET overwegen die verband houdt met een homogene levensduurdaling tussen de controle en de experimentele monsters die als FRET-gebeurtenis moeten worden geanalyseerd. In dit representatieve experiment tonen sFLIM-curven enkele wijzigingen die kunnen worden bereikt tussen het referentiemonster en de twee interactiecases.

De fluorescentietoename in spectrale gebieden die overeenkomen met het Rhodamine-emissiebereik is namelijk gemakkelijk te visualiseerden. Zorgvuldige observatie van de drie eerste kanaal foton verval bochten, onthult ook een sterkere verbuiging voor inheemse tarwe stro met Dextrin gelabeld met Rhodamine, dan voor inheemse tarwe stro geïncubeerd met PEG gelabeld met Rhodamine. Na het monteren van de foton verval bochten en het berekenen van elk kanaal belangrijkste fluorescentie levensduur, de FRET handtekening wordt meer voor de hand.

Bijvoorbeeld, terwijl de fluorescentie levensduur tijd toeneemt en afneemt langs de fluorescentie spectrum voor de inheemse tarwe stro monster, een duidelijke FRET handtekening wordt waargenomen voor zowel inheemse tarwe stro secties geïncubeerd met PEG gelabeld met Rhodamine en inheemse tarwe stro met Dextrin gelabeld met Rhodamine monsters. In de context van lignocellulose biomassa hydrolyse, kan deze methode gemakkelijk worden overgedragen op enzym interactie studies in verschillende biomassa monsters die een rigoureuze karakterisering van elke nieuwe biomassa. Aangezien sFLIM geen fixatie van het monster vereist, maakt het de weg vrij voor dynamische enzym lignine interactiestudies en zal het waarschijnlijk enzymtechnische strategieën en biomassa voorbehandelingen begeleiden.

Zoals de meeste tijd, levensduur metingen vereisen het gebruik van puls infrarood laserbronnen. De passende veiligheidsmaatregelen moeten dienovereenkomstig worden genomen.