Name: Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer een snelle luciferase-assay voor insulinesecretie in MIN6-bètacellen met Gaussia luciferase. Deze methode versnelt medicijnontdekking voor diabetes en biedt directe resultaten tegen lagere kosten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken alle huidige en voormalige leden van het Cobb Laboratory voor waardevolle werk en discussies, en Dionne ware voor administratieve bijstand. Michael Kalwat wordt ondersteund door een juveniele diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dit werk werd mogelijk gemaakt door NIH R37 DK34128 en Welch Foundation Grant I1243 aan Melanie Cobb. De vroege delen van dit werk werden ook gesteund door een NIH F32 DK100113 aan Michael Kalwat.

1. bereiding van reagentia, media en buffers (tabel 1)
<ol><li>Bereid MIN6 complete media in 500 mL van hoge-glucose (4,5 g/L) Dulbecco gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met de volgende additieven: 15% foetale boviene serum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 292 μg/mL L-glutamine, en 50 μM β-mercaptoethanol. Nota: de stabiele cel lijn in dit geval wordt gehandhaafd in 250 µ g/mL van G418 antibioticum.</li>
	<li>Bereid Krebs-ring bicarbonaat buffer (KRBH) voor door een oplossing te maken met 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CaCl2, en 1 mg/ml radioimmuunbepaling-grade boviene serum albumine (BSA). Glucose wordt toegevoegd wanneer gespecificeerd van een 2 M voorraad. Opmerking: KRBH wordt gebruikt om de cellen te bebroeden met en zonder stimulatie om insuline en/of Gaussia Luciferase secretie te beoordelen.</li>
	<li>Bereid coelenterazine (CTZ) voorraad oplossing als volgt. Bereid aangezuurde methanol door toevoeging van 106 µ L van geconcentreerde HCl tot 10 mL methanol. Vervolgens los gelyofiliseerde CTZ in aangezuurde methanol op 1 mg/mL en op te slaan bij-80 ° c in schroef-Cap buizen. Nota: deze voorraden behouden voldoende activiteit in routine Luciferase analyses, zelfs na 1 jaar van juiste opslag.</li>
	<li>Bereid Gaussia Luciferase (GLuc) assay buffer op basis van de literatuur9 en octrooi-informatie10 tot steun in Half-Life van de Gaussia Luciferase assay in 96 goed plaat formaat. Gebruik de formule: 25 mM tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mg/mL na2po4, 300 mm natrium ascorbaat, 200 mm na2so3 in water. Bevriezen voorraden bij-20 °C. Bewaar de buffer na het ontdooien bij 4 °C.</li>
	<li>Ter voorbereiding van Gaussia Luciferase werkoplossing, Voeg 4,2 µ L/mL van de 1 mg/mL (2,36 mM) CTZ voorraad oplossing voor GLuc assay buffer. Dit resulteert in een 2x werkende oplossing van 10 µ M CTZ die een 5 µ M uiteindelijke concentratie in de analyse zal hebben.</li>
</ol>2. cultuur van InsGLuc MIN6 cellen en zaaien voor secretie assays
<ol><li>Aan cultuur MIN6 cellen, trypsinize en zaad de cellen eens per week gebruikend de standaard technieken van de cultuur van de cel. Verander de media op de cellen om de twee tot drie dagen. Neem de juiste selectie van antibiotica, zoals 250 µ g/mL G418 in de media.<ol>
<li>Om een voldoende aantal cellen wekelijks voor experimenten te verstrekken, handhaaf de cellen in T75 kolven. Zaaien 6 x 106 cellen per T75 in 10 ml van de media zal typisch rendement 30 x 106 tot 40 x 106 cellen in totaal per T75 na 7 dagen van de cultuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om cellen voor te bereiden voor plating in 96-goed platen, was een Confluent T75 van InsGLuc MIN6 cellen tweemaal met PBS en voeg 2 mL trypsine. Incubeer bij 37 °C voor ~ 5 min of tot de cellen van de kolf scheiden. Bepaal de cel concentratie per milliliter.<ol>
<li>Verdun de cellen in complete media tot 1 x 106 cellen/ml om te resulteren in 1 x 105 cellen in 100 µ l per put in een 96-well plaat. De cellen moeten voldoende worden beheerst voor de assay na 3 – 4 dagen. Nota: om de cultuurperiode uit te breiden, kan de helft van de cel concentratie worden geplateerd. De veranderingen van de media zijn niet vereist voorafgaand aan de dag van de analyse tenzij de cellen aan experimentele behandelingen moeten worden onderworpen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. glucose-gestimuleerd Gaussia Luciferase secretie assay
<ol><li>Op de dag van de analyse bereid genoeg KRBH voor het experiment voor (stap 1,2). Een minimum van 50 mL KRBH per 96-goed plaat is nodig, dus bereiden ten minste 75 mL om voldoende buffer voor het experiment te waarborgen. Bereid extra buffer als verschillende combinaties van medicamenteuze behandeling voorwaarden zal vereisen KRBH voor verdunning.</li>
	<li>Bereid een reservoir met glucose vrije KRBH. Decanteer het medium van 96-well plate (s) door snel het omkeren van de plaat over een laboratorium gootsteen en vervolgens Blot stevig op een stapel papieren handdoeken om overtollig medium te verwijderen.</li>
	<li>Pipetteer 100 µ L/well KRBH van het reservoir over de 96-well-plaat (en) met behulp van een elektronische of handmatige 8-kanaals pipet. Herhaal dit voor een totaal van twee wasbeurten.</li>
	<li>(Facultatieve stap van scherpe samenstellings behandelingen) Als niet het uitvoeren van medicamenteuze behandelingen, te gaan met stappen 3,5 en 3,6 zonder wijziging. Voor het testen van de effecten van kleine moleculen op insuline secretie, kunnen verbindingen worden toegevoegd aan de cellen tijdens de preincubatie periode, stimulatie periode, of beide.<ol>
<li>Een techniek is om verbindingen toe te voegen in batch aan de KRBH in 1,5 mL buizen en gebruik een verstelbare 8-kanaals digitale pipet om de drug-KRBH overdracht van de buizen naar cellen in 96-goed platen. Opmerking: als een verstelbare pipet niet beschikbaar is, kan een replica 96-well plaat van KRBH worden gemaakt en kan een standaard 8-kanaals pipet worden gebruikt voor de overdracht van buffer. Verdere wijzigingen aan de behandeling paradigma kan worden gemaakt om cellen te behandelen voor 24 uur in de media voorafgaand aan de Assay, zoals eerder beschreven1,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 100 µ L van KRBH met de gewenste concentratie van glucose of verbindingen en plaats de schotel in de 37 ° c incubator voor 1 uur. Nota: afhankelijk van de experimentele lay-out, is het uiterst nuttig om een elektronische multichannel pipet te hebben die de overgang van de kanaal afstanden van een kolom van acht 1,5-mL buizen aan de 8 rijen van een 96-goed plaat toestaat.</li>
	<li>Na de 1 h van preincubatie, decant de buffer in de gootsteen en DEP stevig op papieren handdoek. Voeg 100 µ L van glucose-vrije KRBH per goed toe om geaccumuleerde achtergrond van Gaussia Luciferase weg te spoelen. Decanteer de plaat weer en voeg controle en stimulerend voorwaarden om de plaat op 100 µ L per put. Plaats de schotel in de incubator van 37 °C voor 1 uur.</li>
	<li>Verzamel zorgvuldig 50 µ L van bovendrijvende met behulp van een multichannel Pipet, het veranderen van tips tussen de behandeling voorwaarden als nodig is, en de overdracht van de bovendrijvende naar een schone ondoorzichtige witte 96-goed assay plaat. Opmerking: wit-ommuurde helder-Bodemplaten kunnen worden gebruikt indien nodig, hoewel een aanzienlijke hoeveelheid Luciferase signaal zal worden verloren.</li>
	<li>Na inzameling van 50 µ L van KRBH bovendrijvende, kan het monster onmiddellijk worden getest. Indien nodig, afdichting en op te slaan monsters bij 4 ° c voor een paar dagen (GLuc activiteit Half-Life ~ 6 dagen) of-20 ° c voor maximaal een maand11,12.</li>
</ol>4. afgescheiden Gaussia Luciferase assay
<ol><li>Ter voorbereiding van de GLuc assay werkoplossing, Pipetteer de vereiste hoeveelheid CTZ stockoplossing (4,2 µ L/mL) in GLuc assay buffer. Om het verwarmen van de CTZ te voorkomen, pipet u de CTZ snel bij de-80 °C vriezer of houdt u de buis op droog ijs.</li>
	<li>Met behulp van een elektronische multichannel Pipet, snel toe te voegen 50 µ L van de GLuc assay werkoplossing per goed over de 96-well schotel met de verzamelde KRBH supernatants. Als er druppels aan de zijkanten van een putjes, kort spin de plaat in een tabel-Top Swing-Bucket centrifuge.</li>
	<li>Lees de luminescentie in een geschikte plaat lezer binnen een paar minuten en Lees elk goed met een 0,1 s integratietijd.</li>
</ol>

<ol><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li>
<li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li>
<li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li>
<li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li>
<li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li>
<li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therarpy%22%5BJournal%5D)">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li>
<li>Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).</li>
<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).</li>
<li>Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li>
<li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li>
<li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li>
<li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868(2012).</li>
<li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li>
<li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li>
<li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2%2B+Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li>
<li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+%26%2334%3Bno-wash%26%2334%3B+high-throughput+alternative+to+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">AlphaLISA immunoassay platform- the &#34;no-wash&#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li>
<li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Sociecy+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).</li>
<li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li>
<li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hierin presenteren we een methode om snel te beoordelen glucose-gestimuleerd insuline secretie reacties van MIN6 β cellen. Voor de beste reacties in de assay is het belangrijk om de MIN6 cellen zaad op de juiste dichtheid en hen in staat stellen te worden 85-95% Confluent. Dit verbetert β cel reacties op glucose wegens betere cel-cel contacten en synchronisatie, die zowel in primaire eilandjes17, 18,19,<sup class="xre...

De hier gepresenteerde methode maakt insuline secretie van een genetisch gemodificeerde Beta Cell line te worden getest snel en betaalbaar in 96-well-plate formaat. De sleutel tot dit protocol is een gewijzigde versie van insuline met de natuurlijk-afgescheiden Gaussia Luciferase (GLuc, ~ 18 kDa) ingevoegd ( Zie figuur 1) in het C-peptide te genereren insuline-Gaussia (InsGLuc)1,2. Andere grotere proteïnen, zoals GFP (~ 25 kDa), zijn met succes opgenomen in C-peptide van insuline en tentoongesteld de verwachte post-translationele verwerking van proinsuline-GFP aan insuline en GFP-C-peptide3,4. Voor de bepaling in dit protocol, GLuc is codon-geoptimaliseerd voor zoogdier expressie en twee mutaties zijn ingevoerd om te verbeteren Glow-like kinetica5,6. Meerdere combinaties en replicatie van de behandeling voorwaarden kunnen gemakkelijk worden getest in 96-goed-plaat formaat en de secretie resultaten kunnen onmiddellijk na het experiment worden verkregen.
Een groot voordeel, zoals eerder opgemerkt2, is de lage kosten van deze Luciferase-based secretie meting (< $0.01/well), die onderscheidt het van de relatief hogere kosten en technische aspecten van enzym-gebonden immunosorbent assays (Elisa) ( > $2/well) en homogene tijd-opgeloste fluorescentie (HTRF) of andere Förster resonantie energieoverdracht (FRET)-gebaseerd antilichaam (> $1/well) assays. In vergelijking met deze antilichaam-gebaseerde analyses, die de concentratie van insuline meten door naar een standaardkromme te verwijzen, meet de InsGLuc analyse secretoire activiteit als relatieve vergelijking aan controleputten op de plaat. Om die reden, elk experiment vereist de opneming van de juiste controles. Dit onderscheid is een trade-off om snelle en goedkope metingen mogelijk te maken. Echter, InsGLuc secretie is aangetoond dat sterk gecorreleerd met insuline secretie zoals gemeten door Elisa1,2. Deze technologie is opgeschaald voor high-throughput screening1,2,7 en heeft geleid tot de identificatie van nieuwe modulatoren van insuline secretie met inbegrip van een voltage-gated kaliumkanaal remmer7 evenals een natuurlijke product Inhibitor van β cel functie, Chromomycin a28. Het gebruik van InsGLuc is het meest geschikt voor onderzoekers die van plan zijn om voortdurend te testen veel verschillende behandelingsvoorwaarden voor hun impact op insuline secretie. In vervolgexperimenten is het noodzakelijk om zeer belangrijke bevindingen in een ouderlijke β cel lijn, en optimaal in muizen of menselijke eilandjes te herhalen, en insulineafscheiding te meten gebruikend een op antilichaam-gebaseerde analyse.

<table><tbody><tr><td>Celcultuurmaterialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rIns-GLuc stabiele MIN6 cellen</td><td></td><td></td><td>Parentale MIN6 cel lijn die stabiel pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc tot expressie brengt en in 250 ug/ml G418 wordt gehandhaafd</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>4,5 g/L glucose media</td></tr><tr><td>fetale boviene serum, hitte-geïnactiveerd</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP 176-100</td><td></td></tr><tr><td>glutamine</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-500</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G418-10</td><td>Voorraad oplossing 250 mg/mL in water. Bevries aliquoten bij -20C.</td></tr><tr><td>T75 weefselcultuurkolven</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-000</td><td></td></tr><tr><td>96 well weefselcultuur platen</td><td>Celltreat</td><td>229196</td><td></td></tr><tr><td>Reagens reservoirs (50 mL)</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Secretie assay reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (RIA graad)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-146-952</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hepes, pH 7,4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-213-365</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>15568414</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Optionele geneesmiddelen voor stimulatie experimenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diazoxide</td><td>Sigma</td><td>D9035</td><td>Voorraad oplossing: 50 mM in 0,1N NaOH. Voeg gelijke hoeveelheid 0,1N HCl toe aan elke buffer waarin diazoxide wordt toegevoegd.</td></tr><tr><td>epinefrine (bitartaat zout)</td><td>Sigma</td><td>E4375</td><td>Voorraad oplossing: 5 mM in water</td></tr><tr><td>PMA (phorbol 12-myristaat)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td>Voorraad oplossing: 100 &micro;M in DMSO</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Guassia assay materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumfosfaat (Na2HPO4)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>G334</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Bromide</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44680-1000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44608-5000</td><td>Voorraad oplossing: 0,5 M pH 8</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-1000.0</td><td>Voorraad oplossing: 1 M pH 8</td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1775922</td><td>US Patent US7718389 suggereerde dat ascorbaat de stabiliteit van coelenterazine kan verhogen.</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Sigma</td><td>S0505-250G</td><td>US Patent US8367357 suggereerde dat sulfiet de achtergrond als gevolg van BSA kan verlagen</td></tr><tr><td>Coelenterazine (natuurlijk)</td><td>Nanolight / Prolume</td><td>3035MG</td><td>Voorraad oplossing: 1 mg/ml in aangezuurd MeOH (2,36 mM)</td></tr><tr><td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005290</td><td>Elke ondoorzichtige witte 96-well plaat zou voldoende moeten zijn. Heldere bodem platen zullen ook werken, echter zal er wat signaal verloren gaan.</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Hybrid plate reader of equivalent</td><td>BioTek</td><td>8041000</td><td>Een plate reader met luminescentie detectie en 96-well plaat mogelijkheden is vereist.</td></tr><tr><td>8-kanaals VOYAGER Pipette (50-1250 &micro;L)</td><td>Integra</td><td>4724</td><td>Een geautomatiseerde multikanaals pipette is uiterst nuttig voor snelle toevoeging van luciferase reagentia en het inzaaien van cellen in 96 well formaat</td></tr><tr><td>8-kanaals 200 &micro;L pipette</td><td>Transferpette S 20-200 &micro;L</td><td>2703710</td><td></td></tr></tbody></table>

meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden luciferase surrogaat

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Het uitvoeren van antilichaam-gebaseerde analyses voor afgescheiden insuline post-sample collectie vereist meestal een paar uur tot een dag van de assay tijd en kan duur zijn, afhankelijk van de specifieke assay. De afgescheiden Luciferase analyses versnellen resultaten en verminderen wezenlijk de analyse kosten per steekproef. Hier presenteren we een relatief onderbenut benadering van insuline secretoire activiteit van de pancreas β cellen meten met behulp van Gaussia Luciferase genetisch ingevoegd binnen de C-peptide. Tijdens Proteolytische verwerking van proinsuline, het C-peptide is het vrijgeven van de Luciferase binnen de insuline secretoire blaasje waar het wordt co-afgescheiden met insuline. De resultaten kunnen binnen minuten na steekproef inzameling wegens de snelheid van Luciferase analyses worden verkregen. Een beperking van de assay is dat het een relatieve meting van de insuline secretie en niet een absolute kwantificatie. Echter, dit protocol is zuinig, schaalbaar, en kan worden uitgevoerd met behulp van de meeste standaard luminescentie plaat lezers. Analoge en digitale MultiChannel pipetten vergemakkelijken meerdere stappen van de assay. Veel verschillende experimentele variaties kunnen gelijktijdig worden getest. Zodra een geconcentreerde reeks voorwaarden wordt beslist op, zouden de insuline concentraties direct moeten worden gemeten gebruikend op antilichaam-gebaseerde analyses met standaard krommen om de Luciferase testresultaten te bevestigen.

Om de prestaties van de test onder controle omstandigheden te meten, kan een eenvoudige glucose dosis-reactiekromme of een stimulatie gebruikend het diazoxide paradigma worden voltooid. In het geval van de voormalige, pre-incubatie van de cellen voor 1 h in glucose-vrije omstandigheden, gevolgd door de behandeling voor 1 h met toenemende glucose concentraties moet leiden tot zeer weinig secretoire activiteit op en onder de 5 mM, terwijl de toegenomen secretie wordt waargenomen boven de 8 ...

In dit protocol wordt beschreven hoe u snelle Low-cost Luciferase-analyses uitvoeren bij medium-throughput met behulp van een insuline-linked Gaussia Luciferase als proxy voor insuline secretie van beta-cellen. De assay kan uitgevoerd worden met de meeste luminescentie plaat lezers en multichannel pipetten.

Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Dit protocol beschrijft een alternatieve snelle aanpak voor het testen van insulineafscheiding uit bètacellijnen om de ontdekking en karakterisering van geneesmiddelen te versnellen. Deze aanpak is handig omdat meerdere behandelingen tegelijkertijd kunnen worden getest, de resultaten zijn direct na het experiment beschikbaar en deze test is betaalbaarder dan andere. De toepassing van deze methode op screening voor nieuwe kleine molecuul modulatoren van insuline secretie kan identificeren loodverbindingen voor toekomstige diabetes therapieën.Verhoogde kennis van bètacelfunctie kan bijdragen aan een beter begrip van eiwit of neurotransmitter secretie in het algemeen. Deze insuline afscheiding verslaggever is opgericht om te werken in een lentiviral systeem in andere bètacellen lijnen en in menselijke eilandjes. Deze test moet zeer eenvoudig zijn voor individuen die bekend zijn met de celcultuur en het bedienen van multichannel pipetten.Controleer voordat u experimenten plant of uw ouderlijke of stabiele bètacellijnen correct reageren op glucose met behulp van een insuline-ELISA. Begin met het voorbereiden van Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer of KRBH en gaussia luciferase werkoplossing volgens de handschrift richtingen. Kweek MIN6 cellen in T75 kolven met behulp van standaard celkweektechnieken.Bereid de InsGLuc MIN6 cellen voor beplating door het wassen van een confluent fles cellen tweemaal met PBS en het toevoegen van twee milliliter trypsine. Incubeer de cellen op 37 graden celsius gedurende ongeveer vijf minuten, of totdat de cellen scheiden van de kolf. Bepaal de celconcentratie en verdun de cellen in volledige media tot een miljoen cellen per milliliter, wat neerkomt op 100.000 cellen per 100 microliter in elke put van een 96 putplaat.De cellen moeten voldoende samenvloeien voor de test na drie tot vier dagen. Bereid op de dag van de test voldoende glucosevrije KRBH voor het experiment en stel een reservoir op. Decanteer het medium van de 96 put plaat door het snel om te keren over een laboratorium gootsteen en vervolgens blotting stevig op een stapel papieren handdoeken om overtollig medium te verwijderen.Was de plaat twee keer met 100 microliters glucosevrije KRBH per put, en voeg bij het uitvoeren van medicamenteuze behandelingen medicijnen toe aan de KRBH volgens de handschriftaanwijzing. Voeg vervolgens 100 microliter glucosevrije KRBH toe aan elke put en broed gedurende een uur in op 37 graden Celsius. Na de incubatie decanteren de buffer en dep de plaat op een papieren handdoek.Voeg 100 microliter glucosevrije KRBH per put toe om een geaccumuleerde achtergrond weg te wassen en de plaat vervolgens te decanteren. Voeg controle en stimulerende omstandigheden met of zonder medicamenteuze behandelingen toe bij 100 microliter per put en broed de plaat een uur lang uit met 37 graden Celsius. Het is belangrijk om basale en gestimuleerde controles op elke plaat op te nemen om de responsiviteit van de cellen in een bepaald experiment te bepalen.Als de cellen hun reactie na verloop van tijd hebben verloren, herbouwen ze uit een verse vloeibare stikstofvoorraad. Verzamel voorzichtig 50 microliter supernatant met behulp van een multichannel pipet, breng het naar een ondoorzichtige witte 96 goed testplaat en houd het monster op kamertemperatuur op de bank tot ze klaar zijn voor de luciferase-test. Bereid de gaussia luciferase werkoplossing voor door de vereiste hoeveelheid CTZ-oplossing in de GLuc-testbuffer te spuiten, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de CTZ niet opwarmt.Gebruik een multichannel pipet om snel de GLuc test werkoplossing toe te voegen aan de plaat met de KRBH supernatants. Als er druppels aan de zijkanten van de putten, kort draai de plaat in een tafelblad, swing emmer centrifuge. Zet vervolgens de plaat in de plaatlezer en lees de luminescentie met een integratietijd van 0,1 seconde.Deze test is getest onder controleomstandigheden door het meten van insuline secretie als een reactie op de toenemende glucoseconcentraties. Zeer weinig secretoire activiteit wordt waargenomen onder vijf millimolar glucose, en verhoogde afscheiding wordt waargenomen boven acht millimolar. De cellen vertonen de verwachte secretoire reactie wanneer uitgedaagd met de diazoxide paradigma.Diazoxide behandeling blokkeert insuline afscheiding als er geen extracellulaire kaliumchloride. Wanneer kaliumchloride aanwezig is, kan de afscheiding worden versterkt met verdere toevoeging van glucose. Het is ook aangetoond dat de InsGLuc MIN6 cellen reageren zoals verwacht aan de afscheiding modulerende verbindingen zoals kaliumchloride, diazoxide, PMA, en epinephrin.Na deze procedure moeten kritische resultaten worden bevestigd door krbh-supernatants te analyseren in elisa- of HTRF-tests op basis van antilichamen die het mogelijk maken insulineconcentraties te bepalen. Veel pionierswerk is gedaan door een groep van het Broad Institute, die de weg vrijgemaakt voor mij om steeds meer gebruik van deze test in mijn onderzoek. Meerdere onderzoeksgroepen, waaronder wij en de groep van de Broad, gebruiken deze aanpak bij het ontdekken van geneesmiddelen op het gebied van diabetes.

measuring-relative-insulin-secretion-using-co-secreted-luciferase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Mammatumor cellen die luciferase worden subcutaan geïmplanteerd in muizen en gevisualiseerd met behulp van optische beeldvorming om tumoren groei en ontwikkeling niet-invasief in een longitudinale studie monitor.

In vivo Bioluminescent Imaging van borsttumoren gebruik van IVIS Spectrum

Hierin beschrijven we de methoden om te bouwen, visualiseren en kwantificeren van de bioluminescente reacties van zowel vuurvlieg en Renilla luciferase enzymen uitgedrukt in gemetastaseerde borstkanker cellen tijdens hun groei en...

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

Transcellulaire eiwit interacties zijn belangrijke determinanten van beta-cel functie. Hier beschreven is een methode-aangepast van een co-cultuur model van synaptogenesis-voor het onderzoeken hoe specifieke transmembraaneiwitten beïnvloeden insuline secretie. Getransfecteerde HEK293 cellen brengen eiwitten van belang; beta-cellen hoeven niet te worden getransfecteerd of anderszins direct verstoord.

Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.

Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen

Hier presenteren we homogene tijd opgelost FRET (HTRF) als een efficiënte methode voor snelle detectie van insuline afgescheiden uit cellen.

Homogene Time-resolved Förster Resonance energie overdracht gebaseerde Assay voor detectie van insuline secretie

Dit protocol biedt een methode om te evalueren van de proteolytic activiteit van een intrinsiek laag-activiteit, één omzet protease in een cellulaire context. In het bijzonder is deze methode toegepast om te evalueren van de proteolytic activiteit van PCSK9, een belangrijke bestuurder van lipide metabolisme waarvan proteolytic activiteit vereist voor de ultieme hypercholesterolemic functie is.

Een High-Throughput Luciferase Assay te evalueren proteolyse van de Single-omzet Protease-PCSK9

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en minimaal invasieve methode voor het transplanteren en afbeelden van NIT-1-cellen in niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte muizen die worden uitgedaagd met splenocyten gezuiverd van spontaan diabetische NOD-muizen.

Bioluminescente monitoring van transplantaatoverleving in een adoptief transfermodel van auto-immuundiabetes bij muizen

Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.

Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen

Leer een snelle luciferase-assay voor insulinesecretie in MIN6-bètacellen met Gaussia luciferase. Deze methode versnelt medicijnontdekking voor diabetes en biedt directe resultaten tegen lagere kosten.

Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat

Meer video's verkennen