NMR-based activiteit assays voor het bepalen van samengestelde remming, IC₅₀ waarden, artefactuele activiteit, en de hele cel activiteit van nucleoside Ribohydrolases

Op NMR gebaseerde activiteitstesten bieden een effectieve methode voor het identificeren, evalueren en valideren van remmers voor een bepaald enzym. Ze zijn bijzonder geschikt voor fragmentscreening. NMR-tests zijn vatbaar voor de hogere samengestelde concentraties die nodig zijn voor zwakkere remmers.

Bovendien maakt het gebrek aan reporterenzymen ze minder gevoelig voor false positives. We gebruiken de NMR-testen in ons lab om de remmers van twee enzymen uit Trichomonas vaginalis te identificeren en te karakteriseren. Beide enzymen vertegenwoordigen nieuwe doelen voor nieuwe anti-trichomonale geneesmiddelen.

De NMR-tests zijn over het algemeen van toepassing op elk gebied van onderzoek dat enzymen omvat, en ze kunnen zelfs worden gebruikt om de enzymen in cellen te bestuderen. De belangrijkste aspecten van de techniek zijn ervoor te zorgen dat de juiste reagensvolumes worden gepipeteerd en de reactiecomponenten grondig worden gemengd. Om het substraat en de testverbindingen voor te bereiden, voeg 12 microliter substraat toe aan elk van vier 1,5-milliliter microfugebuizen en voeg zes microliters van deuitroeiende DMSO toe aan de nul-minutencontrole en 30-minutencontrolebuizen.

Voeg zes microliter van de testverbinding toe aan de eerste experimentele buis en drie microliter van de testverbinding en drie microliter van deuterated DMSO aan de tweede experimentele buis. Voeg vervolgens 300 microliter deuteriumoxide toe aan een buis van 15 milliliter met 2,59 milliliter reactiebuffer, gevolgd door 25 microliter enzymoplossing. Draai de buis voorzichtig twee keer om om de oplossing van de reactievoorraad te mengen en voeg 10 microliter van 1,5 molar zoutzuur toe aan een buis van 1,5 milliliter met 582 microliter reactievoorraadoplossing.

Breng vervolgens het volledige volume van de oplossing van de reactievoorraad en het zuur over naar de nul-minutencontrolebuis om tegelijkertijd de nul-minutencontrolereactie te starten en te blussen. Het monster twee keer op een langzame maar opzettelijke manier aspireren en afgeven. Initiëren en uitvoeren van de resterende drie reacties in gespreide wijze, onmiddellijk overbrengen van 582 microliters van de reactie voorraad oplossing aan de eerste experimentele buis en het mengen van het monster twee keer zoals net aangetoond.

Een zorgvuldige aspiratie en dispensing zorgt voor een volledige mix tijdens de initiatiestappen. Wees consistent met elk monster om ervoor te zorgen differentiële mengen is niet een variabele. Breng na 30 seconden 582 microliters reactievoorraadoplossing over naar de tweede experimentele buis en meng, gevolgd door de toevoeging van nog eens 582 microliters van reactievoorraadoplossing naar de 30 minuten durende controlebuis 30 seconden na het initiëren van de reactie in de tweede experimentele buis.

Voeg na 30 minuten 10 microliter zoutzuur van 1,5 molar toe aan de eerste experimentele buis, waarbij het blussen met intervallen van 30 seconden voor de tweede experimentele en 30 minuten durende controlebuizen wordt herhaald. Wanneer alle reacties zijn geblust, breng 600 microliter oplossing van elke reactie naar NMR-buizen. Om de procentuele conversie van substraat voor de controlespectra te berekenen, laadt u de monsters op de spectrometer, verzamelt u de NMR-spectra en overlay de spectra voor de sturingselementen van nul en 30 minuten.

Schaal het substraatsignaal in de nul-minutenregeling om de 30 minuten durende controle te evenaren en let op dit percentage. Bereken vervolgens de procentconversie als 100 minus het percentage van de matching van de substraatsignalen. Om de procentuele conversie van het substraat voor de reacties die de testverbinding bevatten te berekenen, overlay de spectra voor de nul-minutencontrole en de eerste reactie die de 500-micromolar testsamenstelling bevat en schaal het substraatsignaal in de nul-minutencontrole om het spectrum met de testverbinding aan te passen.

Let op dit percentage en gebruik het om de procentconversie te berekenen zoals zojuist is aangetoond. Dan, overlay de spectra voor de nul-minuten controle en de eerste reactie met de 250-micromolar testverbinding, en schaal het substraat signaal in de nul-minuten controle om het spectrum te evenaren met de testverbinding. Nadat u het percentage hebt opgemerkt, gebruikt u het om de procentconversie te berekenen.

Om de procentreactie en procentremming voor elke concentratie van de testsamenstelling te berekenen, berekent u eerst de procentreactie als de procentconversie van de testverbinding, gedeeld door de procentconversie van de controletijden 100. Bereken vervolgens de procentremming als 100 minus de procentreactie. Om een wasmiddel teller scherm test uit te voeren, voeg 300 microliter van deuteriumoxide en 25 microliter enzym oplossing aan een 15-milliliter buis met 2,59 milliliter van de reactie buffer.

Draai de buis voorzichtig twee keer om om de reactievoorraadoplossing te mengen en voeg twee microliters van Triton X-100 wasmiddel toe aan 20 milliliter reactiebuffer. Voeg vervolgens 2,59 milliliter reactiebuffer, met 0,01%Triton X-100 wasmiddel, toe aan een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens 300 microliter deuteriumoxide en 25 microliter enzymoplossing toe aan de buis.

Draai de buis voorzichtig twee keer om om de oplossing van de reactievoorraad te mengen. Bepaal vervolgens de procentremming voor de 100-micromolar en 50-micromolar testverbindingen zoals net aangetoond. Met behulp van de reactie voorraad oplossing zonder wasmiddel, voor een set van vier buizen en de reactie voorraad oplossing met wasmiddel voor een tweede set van vier buizen.

Om een jump-verdunning uit te voeren, breng je 468 microliter reactiebuffers en 60 microliter deuteriumoxide over naar een buis met 53,8 microliter reactiebuffer, vijf microliter enzymoplossing en 1,2 microliter DMSO die 30 minuten heeft uitgebroed. Aspirate en afzien van het mengsel twee keer in een langzame, maar opzettelijke manier. Voordat 468 microliters van reactiebuffer en 60 microliter deuteriumoxide worden overgebracht naar een buis met 53,8 microliter reactiebuffers, vijf microliter enzymoplossing en 1,2 microliter teststof die gedurende 30 minuten is uitbroed.

Meng de tweede reactie twee keer zoals aangetoond. En breng onmiddellijk 588 microliter oplossingsmiddel uit de jump-dilution DMSO-regelbuis naar een buis met 12 microliter substraat met mengen. Doorgaan met de overdracht van 588 microliters uit de jump-dilutie test compound buis, de onverdunde DMSO controle buis, en de onverdunde reageerverbinding buis aan elk van drie 1,5-milliliter buizen, met 12 microliter substraat per buis met mengen op 30-seconden intervallen daarna.

Wacht vervolgens 30 minuten voordat u de reacties doven, de NMR-spectra verzamelt en de procentremming voor elke verbinding berekent, zoals zojuist is aangetoond. Hier worden de resultaten voor het testen van twee verbindingen tegen AgNH in een eerste testsamenstelling met behulp van proton NMR zoals aangetoond getoond. De enzymreactie wordt het gemakkelijkst waargenomen en gekwantificeerd door het verdwijnen van de adenosine singlet en doublet resonanties bij respectievelijk 8,48 en 6,09 delen per miljoen.

En het uiterlijk van een adenine singlet residence op 8,33 delen per miljoen zoals waargenomen in de 30 minuten controle spectrum. In dit cijfer worden de resultaten voor het testen van een verbinding bij twee concentraties tegen AgNH in een wasmiddel tegenschermtest weergegeven met behulp van proton NMR zoals aangetoond. Slechts minimale verschillen worden waargenomen in de intensiteiten van het substraat en productsignalen met behulp van de twee voorwaarden, wat aangeeft dat de waargenomen enzymremming geen artefact van samengestelde aggregatie is.

Houd er rekening mee dat resonanties die voortvloeien uit de geteste verbinding en het wasmiddel het substraat of de productresonanties niet verstoren. De resultaten voor het testen van een verbinding in een jump-dilutie test tegen AGNH met behulp van proton NMR zoals aangetoond blijkt een verminderde intensiteit van het substraat signaal in de 20-micromolar reactie in vergelijking met de 200-micromolar reactie, wat aangeeft dat de remming omkeerbaar is. Een volledig monster mengen tijdens de initiatie van elke reactie en voor de jump-verdunningen is van cruciaal belang.

Een zorgvuldige en consistente aspiratie en dispensing is vereist. Op NMR-gebaseerde tests kunnen ook worden gebruikt om de enzymactiviteit in hele cellen te meten, met behulp van een oplossing die zwevende cellen bevat in plaats van de reactiebuffer en het enzym. Onze anti-trichomonale drug discovery inspanningen blijven vertrouwen op deze tests om de potentie van nieuw gesynthetiseerde verbindingen te meten tegen de ribohydrolase enzymen.

Hoewel het slechts in zeer kleine hoeveelheden wordt gebruikt, is het zoutzuur dat wordt gebruikt om de reacties te blussen gevaarlijk en moet het worden gebruikt met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.