Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie

Proliferatie is een belangrijke maat voor de celfunctie. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om een gevoelige proliferatietest in hun laboratoria te ontwikkelen zonder de hoge kosten van commercieel beschikbare kits. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een harde behandeling van cellen en/of het gebruik van radioactiviteit vermijdt.

Het aantonen van deze techniek zal Vicky Wong zijn, de manager van mijn laboratorium. Om proliferatie te testen, verwijder vasculaire gladde spiercellen uit een kolf met gladde spiercelmedia in 2%foetaal runderserum en plaat bij 20.000 cellen per milliliter in DMEM in een 96-putplaat. Laat de cellen 's nachts groeien op 37 graden Celsius.

Voeg 30 nanogram per milliliter bloedplaatjes afgeleide groeifactor aan drie tot zes putten als een positieve controle om proliferatie te stimuleren. Voeg vervolgens PBS toe aan hetzelfde aantal putten als een negatieve controle. 72 uur lang incubeer.

Verdun eerder bereide vijf millimolar EdU voorraad tot een millimolar en voeg twee microliters aan elke put voor de laatste 24 uur van de 72 uur cultuur periode. Houd een set van replica's zonder EdU om achtergrond fluorescentie en luminescentie te bepalen. Vierentwintig uur later, fix de cellen door het verwijderen van media, dan het toevoegen van 150 microliters per put van 4% paraformaldehyde en incubaat 10 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de paraformaldehyde en voeg 150 microliter van 1%TX-100 toe in water per put en incubeer 30 minuten op kamertemperatuur. Was drie keer met PBS om de TX-100 te verwijderen. Om opgenomen EdU op te sporen met behulp van fluorescentie, maken 10 milliliter etikettering oplossing per 96-well plaat net voor gebruik door het toevoegen van reagentia uit voorraad oplossingen in de juiste volgorde:20 microliter THPTA, 20 microliter kopersulfaat, vijf microliter fluoresceïne picolyl-azide, en 100 microliter natrium ascorbate in PBS voor een totaal volume van 10 milliliter.

De meest kritieke stap is om de etiketteringsoplossing vlak voor gebruik te maken. Verwijder PBS uit putten, voeg 150 microliter etiketteringsoplossing toe aan elke put en broed 30 minuten uit bij 37 graden Celsius. Om alle kernen te detecteren, voeg DAPI toe aan elke put en afbeelding op een fluorescerende microscoop of beeldplaatlezer.

Om handmatig tellen te voorkomen en wanneer een beeldplaatlezer niet beschikbaar is, kan dit protocol worden aangepast aan een luminescentieuitlezing met behulp van HRP-azide en een ELISA-substraat. Om EdU te detecteren met behulp van luminscence, eerst voorbereiden tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% polysorbate 20. Voeg vervolgens 150 microliter blokkeerbuffer toe aan elke put en broed gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.

Na het verwijderen van de blokbuffer, was de cellen drie keer met 200 microliter PBS. Om de ingebouwde EdU op te sporen, moet u eerst 10 milliliter etiketteringsoplossing per 96-putplaat voorbereiden door reagentia uit voorraadoplossingen in de juiste volgorde toe te voegen. Eerst 20 microliters THPTA, dan 20 microliter kopersulfaat, vijf microliters biotine picolyl-azide, 100 microliters natrium ascorbaat in PBS voor een totaal volume van 10 milliliter.

Was putten vijf keer drie minuten met 200 microliters van TBST met schudden. Doof endogene peroxidases met 150 microliter van 0,3% waterstofperoxide gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van waterstofperoxide, was vijf keer drie minuten met 200 microliter van TBST met schudden.

Voeg 50 microliters verdunde streptavidin-mierikswortelperoxidase in tbst toe aan elke put en broed een uur bij kamertemperatuur in. Was vijf keer drie minuten met 200 microliters van TBST met schudden. Voeg 50 microliter van chemiluminescent ELISA substraat toe aan elke put en lees onmiddellijk in een plaatlezer die luminescentie kan detecteren.

Hoewel fluorescerende kernen kunnen worden gedetecteerd door een standaard fluorescentieplaatlezer, wordt de fluorescerende scan met behulp van het luminescentieprotocol omgezet in een homogene vloeistofuitlezing die wordt gedetecteerd met streptavidin-mierikswortel peroxidase en een standaard ELISA-substraat. Het voordeel van deze methode in vergelijking met een fluorescerende uitlezing is een meer homogene uitlezing en de plaat kan worden gelezen in seconden zoals hier te zien wanneer de proliferatie van VSMC in reactie op PDGF werd gemeten. Het nadeel is dat de achtergrond hoger is dan bij fluorescentie, dus negatieve controles zijn meestal hoger.

In een poging om de variabiliteit te verminderen, werden de resultaten genormaliseerd tot de eerste celtellingen. In een aparte reeks experimenten werd echter aangetoond dat deze methode niet gevoelig genoeg is om kleine verschillen in celnummers op te sporen. De meest efficiënte en nauwkeurige manier om EdU positieve en totale cellen te tellen is met behulp van een imaging plaatlezer.

Als dit type plaatlezer niet beschikbaar is, zal handmatig tellen ook nauwkeurige resultaten opleveren. Bij het vergelijken van deze twee methoden, de EdU positieve handmatige telling was identiek aan de geautomatiseerde telling net als de totale niet-geprikkelde telt. Het voordeel van deze twee methoden is de zichtbaarheid van de cellen te tellen, verbeterde nauwkeurigheid, en dat niet-specifieke kleuring van puin kan worden gezien en vermeden.

Het belangrijkste nadeel van de handmatige telmethode is tijd. Vergeet niet om de etiketteringsoplossing vlak voor gebruik vers te maken en de ingrediënten toe te voegen in de volgorde in het geschreven protocol. Als de intensiteit van de kleuring is zwak, probeer het aanpassen van de chelator koper verhouding.

Vergeet niet dat paraformaldehyde giftig is. Het moet worden gebruikt in een rookkap tijdens het dragen van handschoenen. De procedure zelf is niet moeilijk, maar moet mogelijk worden geoptimaliseerd door de chelator-aan-koperverhoudingen in de etiketteringsoplossing aan te passen.

Bovendien kunnen incubatietijden en lengte van de EdU-behandeling worden aangepast afhankelijk van het celtype en de specifieke vraag die wordt gesteld. Deze techniek is compatibel met celoppervlak en intracellulaire kleuring, zodat de kenmerken van scheidings- en niet-delende cellen kunnen worden bepaald. Hoewel vaak gebruikt om proliferatie te meten, klik chemie kan ook worden gebruikt voor de metabole etikettering van RNA, eiwitten, vetzuren en koolhydraten.

Als het metabolische doelwit van belang is op het celoppervlak, levende cellen kunnen worden gelabeld.