Name: Chloroplastonderzoeksmethoden: Het onderzoeken van de targeting, lokalisatie en interacties van chloroplasteiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: Verken methoden voor chloroplastonderzoek om eiwitimport, lokalisatie en interacties te bestuderen in Arabidopsis thaliana. Deze technieken ondersteunen biotechnologische toepassingen voor landbouw en bio-energie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
</ol>

chloroplastonderzoeksmethoden: het onderzoeken van de targeting, lokalisatie en interacties van chloroplasteiwitten

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Chloroplastonderzoeksmethoden: Het onderzoeken van de targeting, lokalisatie en interacties van chloroplasteiwitten

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

Welkom bij de JoVE-methodecollecties over Chloroplast-onderzoeksmethoden, samengesteld door onze gasteditor, Paul Jarvis. Deze collectie behandelt een breed scala aan in vitro- en in vivo-technieken die eiwitinteracties binnen chloroplasten karakteriseren. Onderzoekers aan de Universiteit van Oxford beschrijven een in vitro-methode met behulp van geïsoleerde chloroplasten, die worden geïncubeerd met radioactief gelabelde eiwitten om hun opname te monitoren.Deze methode is een ontwikkeling van eerdere benaderingen die werden gebruikt om chloroplast-eiwitimport in vitro te bestuderen. Vervolgens wordt in een aanvullende methode de chloroplast-eiwitimport in vivo onderzocht. Deze methode gebruikt tijdelijke expressie van chimere eiwitten en protoplasten om eiwitgrootteveranderingen en lokalisatie te onderzoeken via immunoblotting en fluorescentiemicroscopie.In deze methodevideo onderzochten de auteurs het thylakoïd-membraansysteem aanwezig in chloroplasten. Door de membranen te isoleren, worden eiwittranslocatieroutes in chloroplasten geëlucideerd door SDS-PAGE en fosforbeeldvorming. Onderzoekers in Frankrijk passen verschillende centrifugatiemethoden toe om de subcompartimenten in chloroplasten te isoleren.Deze geïsoleerde cellulaire fracties worden vervolgens geanalyseerd door immunoblotting en proteomics om informatie te verkrijgen over de sub-organellaire lokalisatie van chloroplast-eiwitten. Vervolgens gebruikten Zwitserse onderzoekers affiniteitszuivering van chloroplast-multi-eiwitcomplexen om de moleculaire machinerie betrokken bij eiwitimport te onderzoeken. Specifiek de talk en tick multi-eiwitcomplexen ingebed in envelopmembranen.In een aanvullende benadering karakteriseren wetenschappers het plantaardige thylakoïd-eiwitcomplex in Arabidopsis met behulp van Blue Native PAGE, of BN-PAGE, die de scheiding van eiwitcomplexen in hun native en functionele vorm mogelijk maakt. De complexen worden verder geanalyseerd via 2D SDS-PAGE. Je hebt zojuist een blik geworpen op de verschillende methoden die worden gebruikt om chloroplast-eiwitten te bestuderen in onze JoVE-methodecollectie.Je kunt de artikelen in detail bekijken op de webpagina van de Chloroplast Research Methods Collectie die op het scherm wordt getoond.

chloroplast-research-methods-probing-targeting-localization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Hier beschrijven we een nieuwe methode om eiwit import te bestuderen in geïsoleerde chloroplasten onder stress. De werkwijze is eenvoudig en snel, en kan worden toegepast op de gevolgen van verschillende stress voor chloroplast eiwitimport en de overeenkomstige regulerende mechanismen te bestuderen.

Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.

Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

Hier presenteren we een bewezen en geteste protocol voor de zuivering van chloroplast importeren eiwitcomplexen (TOC-TIC complex) met behulp van de TAP-tag. Het protocol van de verwantschap-isolatie one-step potentieel kan worden toegepast op elke proteïne en worden gebruikt om nieuwe interactie partners door massaspectrometrie.

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Hier beschrijven we een methode om te zuiveren intact chloroplasten van Arabidopsis bladeren en hun drie belangrijkste sub compartimenten (envelop, stroma en thylakoiden), met behulp van een combinatie van differentiële centrifugations, continue Percoll verlopen, en discontinue sacharose verlopen. De methode is waardevol voor subplastidial en subcellular localisatie van eiwitten door immunoblotting en proteomics.

Voorbereiding van Chloroplast sub compartimenten van Arabidopsis voor de analyse van eiwit lokalisatie door Immunoblotting of Proteomics

Veel plantensoorten veranderen de positionering van chloroplasten om de lichtabsorptie te optimaliseren. Dit protocol beschrijft hoe een eenvoudig, zelfgebouwd instrument kan worden gebruikt om chloroplastbeweging in Arabidopsis thaliana-bladeren te onderzoeken met behulp van veranderingen in de transmissie van licht door een blad als proxy.

Veranderingen in bladtransmissie gebruiken om chloroplastbeweging in Arabidopsis thaliana te onderzoeken

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Verken methoden voor chloroplastonderzoek om eiwitimport, lokalisatie en interacties te bestuderen in Arabidopsis thaliana. Deze technieken ondersteunen biotechnologische toepassingen voor landbouw en bio-energie.

Chloroplastonderzoeksmethoden: Het onderzoeken van de targeting, lokalisatie en interacties van chloroplasteiwitten

Meer video's verkennen