Name: High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer de fotolithografische synthese van DNA- en RNA-microarrays voor moleculaire biologie. Deze methode maakt parallelle synthese van unieke nucleïnezuursequenties en voorbereiding van retourneerbare bibliotheken mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het Oostenrijkse wetenschaps Fonds (FWF Grants P23797, P27275 en P30596) en de Swiss National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).

<ol><li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBumgarner%2C+R+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. 101, 22(2013).</li>
<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li>
<li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li>
<li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li>
<li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295(2010).</li>
<li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+%28AACED%29%3A+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li>
<li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li>
<li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li>
<li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+%28150mer%29+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li>
<li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLietard%2C+J+%22Enzymatic+and+Chemical+Synthesis+of+Nucleic+Acid+Derivatives%22">Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives</a>. Fernández-Lucas, J. , Wiley Online Books. (2018).</li>
<li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li>
<li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li>
<li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li>
<li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sustainable+Chemistry+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li>
<li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetal+Levulinyl+Ester+%28ALE%29+Groups+for+2%E2%80%B2-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li>
<li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chimica+Oggi-Chemistry+Today%22%5BJournal%5D)">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li>
<li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li>
<li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency%2C+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li>
<li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li>
<li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li>
<li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li>
<li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li>
<li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+%26+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li>
<li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+%26+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li>
<li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li>
<li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li>
<li>Wu, C. -H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li>
<li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2%27F-ANA%2FDNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen banden hebben met enige organisatie met een winstoogmerk.

Solid-phase DNA en RNA synthese is het brood en de boter van elk nucleïnezuur chemie lab, en hoewel de toevoeging van de photolithografie component is weliswaar een complexe operatie, microarray fabricage gemedieerd door UV-licht is ook een zeer betrouwbaar proces . Het is bovendien de enige beschikbare methode voor in situ RNA-synthese op micro arrays. Nog steeds, zoals in een multi-stage experimentele procedure, er is voldoende ruimte voor menselijke fouten.
Misschien is de meest kritische stap de koppeling van een fosforamidiet, omdat het een constant hoogproductieve chemische reactie moet zijn om oligonucleotiden te kunnen veroorloven met weinig synthetische fouten. In ons Microarray synthese protocol is de fosforamidtische koppeling nog belangrijker voor de algehele synthese kwaliteit, omdat het fabricageproces de capping omzeilt en de zuivering van oligonucleotide voorkomt. Stapsgewijze koppel efficiëntie boven 99% is berekend voor alle lichtgevoelige DNA-en RNA-fosforamidites, zelfs voor zeer korte koppelings tijden (15 s)24 , maar er kunnen soms lagere koppelings opbrengsten optreden, met name in het geval van DG amidites. De stabiliteit van de opgeloste fosforamidites bij kamertemperatuur is eerder onderzocht en werd aangetoond afhankelijk van de aard van de nucleobase, met calciumguanosine fosforamidites vatbaar voor uitgebreide afbraak in slechts een kwestie van dagen29, 30. Maar bij opslag bij-25 °C bleken dG fosforamidites opgelost in ACN als 30 mM oplossing gedurende enkele weken stabiel te zijn. De relatieve instabiliteit van dG fosforamidtische oplossingen bij kamertemperatuur betekent echter dat ze niet gedurende enkele dagen aan de DNA-synthesizer moeten worden gehecht.
Voor RNA-fosforamidites is de koppelings opbrengst zeer afhankelijk van de fosforamidtische kwaliteit (die kan worden beoordeeld met 31P NMR-spectroscopie) en koppelings tijd. Koppelings tijden van 5 minuten voor rA, rG, rC en 2 min voor rU lijken noodzakelijk. Inderdaad, we vonden dat verkorting van de condensatie tijd tot 2 min voor alle RNA-fosforamidites leidde tot significant lagere hybridisatie signalen.
De DNA-synthesizer zelf, evenals de reagentia en oplosmiddelen, moet zeker zo schoon mogelijk zijn om de hoogste opbrengst van oligonucleotide synthese te bereiken. Echter, onoplosbaar materiaal, zouten of deeltjes, kan zich in de loop van de tijd ophopen in de lijnen en slangen van het toedieningssysteem, wat leidt tot een geleidelijke afname van het verbruik van reagentia en reactanten. Wanneer een algemene reiniging van de synthesizer niet een lage output volume oplost, een toename van het aantal pulsen kan een alternatieve oplossing. Met name nuttig in het geval van een lage fosforamidtische consumptie, kan de lijn in het koppelings protocol overeenkomend met het pompen van een mengsel van fosforamidtische en verharder (derde regel van de Subsectie koppeling in tabel 1 en tabel 2) gewijzigd, van 6 naar 9 pulsen zonder merkbaar negatief effect op de kwaliteit van de synthese. Bovendien is het aantal pulsen van Activator dat nodig is om de amiite/Activator-mix te brengen naar het synthese substraat (momenteel 6, vierde lijn in de koppelings Subsectie, Zie tabel 1 en tabel 2) afhankelijk van de DNA-synthesizer zelf, evenals op buislengte in de synthese cel. Dit aantal kan worden aangepast na het vervangen van de fosforamiet met een gekleurde oplossing en het tellen van het aantal pulsen dat nodig is om de gekleurde mix naar het glas substraat te duwen voor koppeling.
De hier beschreven methode maakt het mogelijk om DNA en RNA synthese gelijktijdig te doorgaan, op dezelfde Microarray. Hybriden van DNA en RNA kunnen ook worden bereid zonder enige verandering in de matrix fabricage protocollen, en zolang het driedelige deprotection protocol wordt gevolgd. Echter, opgemerkt moet worden dat RNA-only micro arrays alleen een twee-stappen deprotection vereisen: een decyanoethylatie eerst met et3N gevolgd door hydroxylgroep en base deprotection met hydrazine. DNA-nucleobasissen bleken onder deze omstandigheden niet volledig te zijn gedebeschermd en hebben de extra stap in EDA nodig om de volledige verwijdering van fenoxyacetyl (PAC) groepen te kunnen uitvoeren. Deze extra behandeling met EDA is korter (5 min) dan voor de standaard deprotection van DNA micro arrays31, maar het is voldoende om het na de Triethylamine en hydrazine behandelingen tot voltooiing te brengen. Bovendien beperkt een korte reactietijd met EDA de blootstelling van een volledig deprotected RNA-oligonucleotide aan de basisomstandigheden.
Een voordeel van in-situ RNA array synthese over alternatieve methoden zoals spotting of DNA transcriptie32,33,34 is de mogelijkheid om de gesynthetiseerde RNA microchip in beschermde vorm op te slaan tot gebruik, waardoor de risico op mogelijke afbraak van RNA. Post-synthetische procedures voor RNA impliceren daarentegen dat verbruiksgoederen en reagentia steriel worden gehouden en dat de behandeling onder RNase-vrije condities wordt uitgevoerd. Van nota, we constateerden dat de toevoeging van RNase remmer aan de hybridisatie mix niet sterkere hybridisatie signalen voor de RNA-kenmerken oplevert.
De synthese van DNA-bibliotheken op een basis-gevoelige monomeer is complexer dan de synthese van een paar besturings sequenties op een oppervlak, en als zodanig is zeker meer vatbaar voorontwerp fouten. Maar als het sequentie ontwerp (d.w.z. de aard en het aantal sequenties) juist is, wordt deze lijst getransformeerd in een verzameling belichtings maskers en een geordende reeks koppelings cycli blijft een eenvoudig proces. Echter, belangrijke variaties van standaard Microarray synthese bestaan en zijn essentieel voor een succesvolle fabricage van een high-density Library array.
Eerst wordt een base-Sensitive dT monomeer gekoppeld als de eerste fosforamidiet na synthese van de linker. De koppelings opbrengst van dit monomeer (Figuur 1) bleek relatief laag te zijn, rond 85%28, daarom worden inspanningen geleverd om de opnamesnelheid te verbeteren, hetzij door de concentratie ervan in ACN te verhogen van 30 mm tot 50 mm, of door herhaling van de koppelings stap: twee opeenvolgende koppelings reacties met behulp van nieuwe monomeren of twee afzonderlijke maar opeenvolgende koppelings cycli.
De tweede verandering is de toevoeging van een β-caroteen oplossing in de achterkamer van de synthese cel, die gemakkelijk absorbeert 365 nm licht. Dit is een belangrijke wijziging van de fotolithografische Setup, omdat het voorkomt dat UV-licht terugkaatst op het array substraat. Inderdaad, na het doorkruisen van het interstitiële medium tussen de ondergronden, verlaat het binnenkomende UV-licht door de geboorde glijbaan en bereikt het kwarts blok van de cel. De Fresnel-vergelijkingen voorspellen dat ~ 4% van loodrecht incident UV-licht zal reflecteren van elk van de drie downstream lucht-glas interfaces (afrit zijde van de 2ND substraat en beide zijden van het kwarts blok) en terug op de synthese substraat, die leidt tot onbedoelde blootstelling aan fooprotected oligonucleotiden. Diffractie en verstrooiing dragen ook bij aan "off-target" photodeprotection en dus aan nucleotide inbrengen, die direct van invloed zijn op het foutenpercentage van de synthese, maar deze bijdragen zijn veel kleiner dan reflecties en kunnen vooral worden aangepakt door vermindering van de synthese dichtheid (het verlaten van de gaten tussen de functies). We hebben geconstateerd dat het niveau van β-caroteen oplossing in de onderste kamer van de cel de neiging heeft om iets te verminderen alleen tijdens de eerste minuten van array synthese, en daarom moet worden bewaakt en opnieuw afgesteld.
Tot slot, de derde verandering is de deprotection-oplossing, ter vervanging van EtOH voor tolueen, die de gespleten DNA-bibliotheek gebonden aan het oppervlak houdt, vermoedelijk door elektrostatische interacties. Het aanbrengen van een kleine hoeveelheid water op het synthese gebied na het wassen van ACN zorgt ervoor dat de bibliotheek gemakkelijk kan worden verzameld. Het proces is echter alleen succesvol als het watergehalte in EDA en tolueen minimaal is, waardoor het nucleïnezuur volledig onoplosbaar is in de deprotection cocktail. Als alternatief kunnen DNA-bibliotheken worden gespleten van de chip met behulp van ammoniak9,10,14,35, dan verder gedebeschermd door het verwarmen van de DNA-bevattende waterige ammoniakoplossing tot 55 °c 's nachts. Het herstel van DNA-bibliotheken met ammoniak is echter niet compatibel met RNA. RNA oligonucleotiden op een base-cleavable substraat kunnen van het oppervlak worden verwijderd met behulp van dezelfde EDA/tolueen-procedure als hierboven beschreven, maar alleen op het voorlaatste stadium na de et3N en hydrazine twee-stels deprotectie strategie28.
Alternatieve strategieën om oligonucleotide-Pools te herstellen van micro arrays zonder dat er een specifieke basisbehandeling nodig is, zijn in principe compatibel met foto lithografie en vertrouwen op het gebruik van enzymen. Een enkelvoudige deoxyuracil-nucleotide kan bijvoorbeeld het doelwit zijn van het uracil-DNA-glycosylase (UDG) en uit de rest van de DNA-sequentie worden uitgeschoven, of een enkele RNA-eenheid kan worden herkend door RNase H type 2-enzymen en de fosfodiëester binding 5 ' aan het RNA-gespleten , het vrijgeven van de 5 ' DNA deel23.
We hebben nu een krachtige, betrouwbare en hoge-dichtheids methode voor de synthese van DNA-, RNA-en hybride DNA/RNA-micro arrays. Deze kunnen niet alleen dienen als platformen voor hybridisatie of bindende assays36, maar ze vertegenwoordigen ook een snelle en goedkope manier om complexe nucleïnezuur bibliotheken te produceren. Voor DNA-gebaseerde digitale gegevensopslag kan Microarray-foto lithografie een mogelijke oplossing worden voor het "schrijven"-knelpunt (d.w.z. de codering van informatie door synthese). Het succes in digitale codering op DNA en in de Novo gen assembly is afhankelijk van sequentie getrouwheid die, op synthese niveau, zich vertaalt in het foutenpercentage. Synthetische en optische fouten in onze huidige array fabricage protocollen zullen elders worden besproken en gerapporteerd. Parallel hieraan worden momenteel inspanningen geleverd om de productieschaal en de doorvoer verder te verhogen.

Het praktische gebruik van DNA-micro arrays is van oudsher in de studie van de variaties in de genexpressie niveaus tussen twee celpopulaties, met behulp van complementaire strengen en fluorescentie als detectiemethode1. Af en toe venture DNA-micro arrays in bindende gebeurtenissen met niet-nucleïnezuur liganden, zoals eiwitten, met een strategie van systematische sequentie permutatie die een uitgebreid overzicht biedt van het bindende landschap2,3, 4,5. Deze aanpak transformeert effectief micro arrays van loutere hybridisatie oppervlakken in platforms met een brede sequentiedekking, wat een aanwinst zou zijn voor de studie van de rijkere en complexere wereld van RNA structuur en functie. Ondersteund door de uiterst efficiënte fosforamidtische koppelingsreactie6, in situ gesynthetiseerde DNA-arrays kunnen nu ook worden beschouwd als een goedkope bron van DNA7, die vooral relevant wordt gezien de steeds toenemende vraag naar nucleïnezuur materiaal voor genassemblage8,9, op DNA gebaseerde nanostructuren10, informatieopslag of sequencing11,12. Evenzo kunnen sequentie technologieën baat hebben bij de ontwikkeling van methoden die zeer complexe mengsels van RNA oligonucleotiden13opleveren. In deze context zijn array fabricage protocollen die het mogelijk maken om oligonucleotiden in situ en bij hoge dichtheid te synthetiseerd, ideaal geplaatst om tegemoet te komen aan de behoeften van het snel uitbreidende gebied van nucleïnezuur biotechnologie. Met een net zo divers gebied als de biotechnologie kan het doel van elke toepassing echter vereisen dat DNA op microarray wordt geproduceerd bij hoge doorvoer of met een zeer geringe hoeveelheid synthetische fouten14,15of beide, waarbij een nader bekijken van de synthese protocollen van DNA-micro arrays die, historisch, zijn voornamelijk geoptimaliseerd voor hybridisatie assays. Ondertussen, in situ synthese van RNA micro arrays is gebleken dat een uitdagende inspanning, met de meeste van de moeilijkheid in verband met de bescherming groep voor de 2 '-OH functie, meestal een silyl-deel in standaard solid-phase synthese die wordt verwijderd met op fluor gebaseerde reagentia, chemicaliën die onverenigbaar zijn met glas-of silicium oppervlakken. Deze problemen en uitdagingen in DNA en RNA Microarray synthese zijn de laatste tijd het onderwerp geweest van een grote hoeveelheid werk, in het bijzonder met de photolithografie aanpak16.
Photolithografie gebruikt UV-licht om oligonucleotiden te deblokkeren vóór koppeling en vereist maskers om een patroon van UV-blootstelling te construeren, waardoor het ruimtelijk organiseren en beheersen van de groei van oligonucleotiden. Fysieke maskers zijn vervangen door computergestuurde micro spiegels, waarvan het kantelen selectief UV-licht reflecteert op de microarray-ondergrond17,18,19. Als UV-bron gebruiken we 365 nm licht uit een High Power LED bron20. Huidige fotolithografische opstellingen zijn uitgerust met Micro mirror arrays met 1024 × 768 spiegels, overeenkomend met meer dan 780.000 individueel adresseerbare spots ("features") op een klein oppervlak van slechts 1,4 cm2, of 1080p met arrays van 1920 × 1080, of > 2 miljoen spiegels. Elk van de spiegels in het apparaat heeft daarom directe controle over de volgorde die op de corresponderende functie is geteeld. Met uitzondering van UV-licht werkt photolithografie als een Solid-phase synthese techniek en neemt de op cyclus gebaseerde fosforamidtische chemie aan. Alleen het vereist een heel andere beschermingsstrategie voor RNA-synthese om te slagen. We ontwikkelden een nieuwe reeks lichtgevoelige RNA-fosforamidites lager hydrazine-labile beschermende groepen21. Deze monomeren maken het mogelijk om het RNA te debeschermen onder milde omstandigheden die geen invloed hebben op de integriteit van het oppervlak. Een eerste deprotection-stap gebruikt Triethylamine om de beschermende groepen van cyanoethylfosfodiester te verwijderen, terwijl hydrazine wordt gebruikt in een tweede, aparte stap om die bij de 2 '-OH-en exocyclische amine-functies te verwijderen. Daarbij kunnen RNA oligonucleotiden ~ 30-NT in lengte en van elke sequentie nu in situ worden gesynthetiseerd op micro arrays22,23. Parallel hieraan zijn we ook recentelijk begonnen met het aanpakken van de doorvoer, kwaliteit en snelheid van DNA-en RNA-foto lithografie. We meten de koppelings efficiëntie > 99% voor alle DNA-en RNA-amidites (Figuur 1) en onderzochten elke afzonderlijke stap in de oligonucleotide-rek cyclus, van oxidatie tijd tot keuze van activator en tot optimale UV-belichting24 , 25. we hebben nieuwe lichtgevoelige 5 ' Bescherm groepen gebracht die alleen in enkele seconden kunnen worden verwijderd, waardoor de synthese van honderdduizenden 100mers wordt getransformeerd in een paar uur lang proces26. We hebben ook de doorvoer van array fabricage verdubbeld door het blootstellen van twee substraten tegelijk27. Ten slotte hebben we een dT-fosforamidiet met een base-Sensitive succinyl-groep geïntroduceerd als een handige manier om DNA en RNA oligonucleotiden te Cleave, te verzamelen en te analyseren, wat centraal staat in de voorbereiding van de bibliotheek28.
Ondanks het relatief alledaagse aspect van DNA en RNA Solid-phase synthese, in het bijzonder voor nucleïnezuur chemici, blijft Microarray photolithografie een niet-triviale upgrade die een complexe opstelling vereist, zorgvuldige controle en toezicht op het proces, en afzonderlijke instructies voor post-synthetische hantering, afhankelijk van de aard van het oligonucleotide en het type toepassing. In dit artikel willen we een gedetailleerde presentatie geven van de volledige stapsgewijze procedure voor in-situ synthese van DNA-en RNA-micro arrays door foto lithografie, van experimenteel ontwerp tot gegevensanalyse, met de nadruk op de voorbereiding van instrumenten en Verbruiksartikelen. Vervolgens beschrijven we de post-synthetische deprotectie methoden die overeenkomen met het beoogde doel van Microarray fabricage (d.w.z. hybridisatie of het herstel van nucleïnezuur bibliotheken).

```html
<table><tbody><tr><td>Slide functionalisatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur >99,8%</td><td>Sigma</td><td>33209</td><td>Voor RNA-deprotectie</td></tr><tr><td>CNC-router</td><td>Stepcraft</td><td>300 CK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluut</td><td>VWR</td><td>1.07017.2511</td><td>Voor deprotectie en functionalisatie</td></tr><tr><td>N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td><td>Gelest</td><td>SIT8189.5</td><td>Silaniserend reagens</td></tr><tr><td>Nexterion Glass D microscoopglazen</td><td>Schott</td><td>1095568</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Orbitale shaker</td></tr><tr><td>Proclean 507 ultrasoon waterbad</td><td>Ulsonix</td><td></td><td>Om glazen schoon te maken na het boren</td></tr><tr><td>Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner</td><td>Sigma</td><td>Z860086</td><td>Om glazen schoon te maken na het boren</td></tr><tr><td>Microarray-synthese</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 M dicyanoimidazool in ACN</td><td>Biosolve</td><td>0004712402BS</td><td>Activator</td></tr><tr><td>0,7 XGA DMD</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td>Digitaal Micromirror Device</td></tr><tr><td>20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td><td>Sigma</td><td>L860020-06</td><td>Oxidator</td></tr><tr><td>200 μm dik Chemraz 584 perfluorelastomeer</td><td>FFKM</td><td></td><td>Onderste teflon-pakking</td></tr><tr><td>2'-O-ALE RNA fosforamidieten</td><td>ChemGenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>365 nm hoge-vermogen UV-LED</td><td>Nichia</td><td>NVSU333A</td><td></td></tr><tr><td>5'BzNPPOC DNA fosforamidieten</td><td>Orgentis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'NPPOC DNA fosforamidieten</td><td>FlexGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitriel</td><td>Biosolve</td><td>0001205402BS</td><td>Voor DNA-synthese</td></tr><tr><td>Amidite Diluent voor DNA-synthese</td><td>Sigma</td><td>L010010</td><td>Voor het oplossen van fosforamidieten</td></tr><tr><td>Afsplitsbare dT</td><td>ChemGenes</td><td></td><td>Base-gevoelige monomeer voor bibliotheekvoorbereiding</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>0004474701BS</td><td>Als belichtingsoplosmiddel</td></tr><tr><td>DNA- en RNA-microarray-deprotectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiamien >99,5%</td><td>Sigma</td><td>3550</td><td>Voor deprotectie</td></tr><tr><td>Expedite 8909</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td></td><td>DNA-synthesizer</td></tr><tr><td>Hydrazinehydraat 50-60% hydrazine</td><td>Sigma</td><td>225819</td><td>Voor RNA-deprotectie</td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Industrial Strength lagere-dichtheid PTFE-tape</td><td>Gasoila</td><td></td><td>Dunne, bovenste teflon-pakking</td></tr><tr><td>Pyridine >99%</td><td>Sigma</td><td>P57506</td><td>Voor RNA-deprotectie</td></tr><tr><td>Triethylamine >99%</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td>Voor RNA-deprotectie</td></tr><tr><td>&beta;-caroteen</td><td>Sigma</td><td>C9750</td><td>Voor bibliotheekvoorbereiding</td></tr><tr><td>Hybridisatie en scannen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Natrium Saline Citraat</td><td>Roth</td><td>1054.1</td><td></td></tr><tr><td>5'Cy3-gelabelde complementaire streng</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Voor duplex hybridisatie</td></tr><tr><td>Biopur Safe-Lock microcentrifugebuis</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (10 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>R3961</td><td></td></tr><tr><td>EDTA moleculaire biologiekwaliteit</td><td>Promega</td><td>H5031</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4100A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Microarray-scanner</td></tr><tr><td>Hybridisatie-oven</td><td>Boekel Scientific</td><td>230500</td><td></td></tr><tr><td>MES monohydraat</td><td>Sigma</td><td>69889</td><td></td></tr><tr><td>MES natrium</td><td>Sigma</td><td>M3058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl >99,5%</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal SA200 hybridisatiekamer</td><td>Grace BioLabs</td><td>623503</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td>Microarray centrifuge</td></tr><tr><td>Tween-20 moleculaire biologiekwaliteit</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Gegevensextractie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Voor gegevensextractie</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Microarray ontwerp</td></tr><tr><td>NimbleScan 2.1</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ontzouten en kwantificeren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTip C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18s008</td><td>Ontzouting pipettentips</td></tr></tbody></table>
```

high-density dna en rna micro arrays-photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithografie is een krachtige techniek voor de synthese van DNA oligonucleotiden op glazen glijbanen, omdat het de efficiëntie van fosforamidtische koppelings reacties combineert met de precisie en dichtheid van UV-licht weerspiegeld van micrometer-grote spiegels. Photolithografie levert micro arrays die geschikt zijn voor honderdduizenden tot enkele miljoenen verschillende DNA-sequenties, 100-NT of langer, in slechts een paar uur. Met deze zeer grote sequentie ruimte zijn micro arrays ideale platforms voor het verkennen van de mechanismen van nucleïnezuur · ligand interacties, die bijzonder relevant zijn in het geval van RNA. We hebben onlangs gerapporteerd over de voorbereiding van een nieuwe set van RNA-fosforamidites compatibel met in situ foto lithografie en die vervolgens werden gebruikt om te groeien RNA oligonucleotiden, homopolymeren, evenals Mixed-base sequenties. Hier illustreren we in detail het proces van RNA-Microarray-fabricage, van het experimentele ontwerp, tot instrumentale opstelling, array synthese, deprotection en uiteindelijke hybridisatie test met behulp van een sjabloon 25mer-reeks met alle vier de basissen als voorbeeld. Parallel gaan we verder dan hybridisatie gebaseerde experimenten en benutten we Microarray photolithografie als een goedkope gateway naar complexe nucleïnezuur bibliotheken. Om dit te doen, worden high-density DNA micro arrays gefabriceerd op een base-Sensitive monomeer dat het mogelijk maakt het DNA gemakkelijk te gesplitst en te krijgen na synthese en deprotectie. Het fabricage protocol is geoptimaliseerd om het aantal synthetische fouten te beperken en in die zin wordt een laag β-caroteen oplossing geïntroduceerd om UV-fotonen te absorberen die anders weer op de synthese substraten kunnen reflecteren. We beschrijven in een stapsgewijze manier het volledige proces van bibliotheek voorbereiding, van ontwerp tot decolleté en kwantificering.

DNA en RNA Microarray hybridisatie Figuur 5 toont de resultaten van een hybridisatie test die wordt uitgevoerd op een microarray met de DNA-en RNA-versies van een 25mer-sequentie (5 '-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3 ' in DNA-vorm). De scan in Figuur 5a verschijnt in een greenscale-indeling die overeenkomt met het excitatie/emissiespectrum van Cy3 fluorescentie, waarbij de intensiteit van de fluorescentie wordt geregistreerd in willekeurige eenheden tussen 0 en 65536. Het ontwerp van de matrix volgde de 25:36 functie-indeling die wordt beschreven in de sectie Protocol. De scan wordt getoond na de juiste oriëntatie van de array, met de linker bovenhoek gevuld met de langste keten van fiducial features. Hier bevatten fiducial-functies de DNA-versie van de 25mer en moeten ze in principe altijd een positief fluorescentie signaal geven om scan uitlijning en gegevensextractie uit te voeren. De hybridiseerde Microarray moet gelijkmatig helder lijken, waarbij de randen van het synthese gebied echter meestal helderder zijn dan het midden (tot 50% helderder). De grote hoeveelheid reeks replicaten, willekeurig verdeeld in het gebied, vermindert de impact van ruimtelijke artefacten. Hier werd elke sequentie (DNA en RNA) gesynthetiseerd op 2.000 willekeurige locaties. Er is meestal een laag fluorescentie geluid (achtergrond), < 50 a.u., wat leidt tot een signaal/ruis verhouding in de orde van 200:1 tot 800:1 in hybridisatie testen. Na gegevensextractie worden fluorescentie intensiteiten gemiddeld uit en getekend ± SD.
Er is een significante variabiliteit in absolute fluorescentie waarden tussen experimenten. Hier tonen we de resultaten voor drie onafhankelijke syntheses met behulp van dezelfde fabricage parameters en dezelfde post-synthetische handling. Het 25mer-DNA, wanneer het wordt gehybridideerd tot zijn complementaire Cy3-gelabelde DNA-streng, zal fluorescentie signalen opleveren, variërend overal van 20.000 tot 30.000, zeer zelden boven of onder. Het 25-Mer-RNA, wanneer het wordt gehybridiseerd op hetzelfde Cy3-gelabelde DNA-complement, geeft fluorescentie intensiteiten op de corresponderende eigenschappen variërend van 15.000 tot 20.000. De intensiteit van de fluorescentie van de RNA/DNA-duplexen daalt echter af en toe onder 8.000, wanneer de corresponderende DNA/DNA-duplexen nog steeds fluorescerend zijn binnen het 20000-30000 bereik. In dergelijke gevallen kunnen de resultaten voor RNA als suboptimaal worden beschouwd. Een synthese of hybridisatie falen, hetzij voor DNA of RNA, zal onmiddellijk merkbaar tijdens het scannen van het duidelijke gebrek aan fluorescentie. Er zijn meerdere mogelijkheden voor de synthese van RNA om ofwel falen of gedeeltelijk slagen en ze zullen worden geschetst in het discussie gedeelte.
Bibliotheek deprotection, splijting en herstel Afhankelijk van de complexiteit en de dichtheid van de bibliotheek, kan de vorm en omtrek van de gesynthetiseerde array worden gezien zonder vergroting, maar onder goede belichting (Figuur 4), waarbij het DNA nog steeds in beschermde vorm is. Na deprotection met EDA/tolueen, en voor de toevoeging van water om de gespleten bibliotheek te verzamelen, kan het synthese gebied met de nu gedebeschermde oligonucleotiden opvallen als een hydrofiele zone, wanneer de rest van de glazen glijbaan zal verschijnen bedekt met een troebele hydrofobe laag. De directe observatie van het synthese gebied hangt af van de totale oppervlakte die wordt gebruikt voor het synthetiseren van oligonucleotiden: een groter gebruik van het synthese gebied komt overeen met een grotere kans op een duidelijk onderscheid tussen hydrofiele en hydrofobe gebieden op het oppervlak. Omgekeerd, Bibliotheken gesynthetiseerd met behulp van minder spiegels en met kleinere functies zijn mogelijk niet onmiddellijk waarneembaar.
Evenzo is de hoeveelheid teruggewonnen DNA na ontdesalting direct evenredig met de totale oppervlakte die voor synthese wordt gebruikt. Als alle functies worden gebruikt voor de synthese van oligonucleotide, moet de decolleté en terugwinnings procedure tussen 25 en 30 pmol van het DNA opleveren. Een 10% gebruik van het synthese gebied zal dus slechts ongeveer 3 pmol van DNA veroorloven.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Figuur 1 . Chemische structuren van het DNA en RNA-fosforamidites gebruikt in Oligonucleotide Synthese door Microarray foto lithografie. Standaard nitrofenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) lichtgevoelige bescherming groepen op de 5 '-OH worden gebruikt in reguliere DNA en RNA Microarray synthese voor hybridisatie doeleinden. Voor de synthese van complexe DNA-Bibliotheken, de meer fotolabile BENZYL-NPPOC (BzNPPOC) hebben de voorkeur bij de 5 '-OH, als BzNPPOC wordt verwijderd twee keer zo snel als NPPOC, die aanzienlijk vermindert totale Microarray synthese tijd. DNA oligonucleotiden voor bibliotheken vereisen ook de koppeling van een splijtbaar DT monomeer aan het uiteinde van de 3. Dit monomeer, dat een succinyl-Ester functie draagt, zal worden gecleaved tijdens deprotection, waardoor het DNA kan worden verzameld van de microchip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Figuur 2 . Voorbeeld van een masker als een afbeeldingsbestand dat wordt verzonden naar het Digital-apparaat tijdens blootstelling aan UV-straling. De witte pixels corresponderen met spiegels die in de "on" positie zullen worden gekanteld, wat UV-licht reflecteerd op de synthese cel. Zwarte pixels komen overeen met "uit"-spiegels, waar het UV-licht wordt weerkaatst van de cel. Witte pixels zullen daarom de koppeling mogelijk maken van het volgende inkomende fosforamidiet op de oligonucleotiden op de overeenkomstige eigenschappen op de glas substraten. Oligonucleotiden gesynthetiseerd op de functies waarvan de overeenkomstige spiegels zijn, in dit masker bestand, zullen zwarte pixels echter inert blijven tijdens de volgende koppelingsgebeurtenis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Figuur 3 . Foto's van de microarray foto lithografie optische en synthese Setup. A) optisch circuit voor blootstelling aan UV-straling. UV-licht van de UV-LED wordt eerst gehomogeniseerd door middel van een rechthoekige-dwarsdoorsnede lichtpijp en reflecteert vervolgens op de micro spiegels. Micro spiegels die in een "OFF"-positie zijn gekanteld, weerspiegelen UV-licht van de synthese cel, maar micro spiegels in de "ON"-positie reflecteren het licht op de synthese-cel, gelegen op het brandvlak, door eerst een 1:1 Offner-relay te passeren Imaging System. B) de synthese cel, eenmaal geassembleerd, bestaat uit een geboorde dia die eerst op het kwarts blok van de cel wordt geplaatst, gescheiden door een dikke PTFE-pakking (niet weergegeven). Een tweede, niet-geboorde glijbaan wordt dan geplaatst over de geboorde glijbaan, gescheiden door een dunne PTFE pakking. Een metalen frame (niet afgebeeld) houdt de assemblage bij elkaar. C). voor de bereiding van de bibliotheek, zodra de synthese cel is bevestigd op het brandvlak van het binnenkomende UV-licht, wordt de kamer die zich tussen het kwarts blok en de geboorde glijbaan bevindt, gevuld met een 1%-oplossing van β-caroteen in2cl2. Hiervoor wordt een extra inlaat-en Uitlaatslang aan het kwarts blok bevestigd en stroomt de oranje oplossing van de meest rechtse naar de meest linkse positie. De stroom van reagentia en oplosmiddelen voor de synthese wordt getoond in witte pijlen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Figuur 4 . Het synthese gebied is meestal zichtbaar voor het blote oog. Hier, een DNA-bibliotheek kan worden gezien op het glasoppervlak direct na synthese, met het DNA nog steeds in beschermde vorm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Figuur 5 . Hybridisatie assays aan de 25mer DNA en RNA sequenties gesynthetiseerd in situ op micro arrays. A) fluorescentie scan van het volledige HYBRIDISEERDE DNA en RNA-Microarray. 25mer DNA en RNA oligonucleotiden worden gehybridideerd tot hun Cy3-gelabelde complementaire strengen. De array werd gescand met een laser op een 532 nm excitatie golflengte, bij een resolutie van 5 μm. B) fluorescentie intensiteiten (willekeurige eenheden) van het DNA: DNA en RNA: DNA-duplexen in drie afzonderlijke experimenten. De licht groene gegevens voor in situ gesynthetiseerde RNA-oligonucleotiden kunnen als suboptimaal worden beschouwd, vergeleken met de intensiteit van de fluorescentie van de corresponderende DNA-sequenties. Foutbalken zijn SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Figuur 6 . Schematische weergave van de deprotectie-, splijting-en herstelprocedure voor DNA-bibliotheken die zijn gesynthetiseerd op micro arrays. DNA-sequenties worden geteeld op een base-gevoelige splijtbaar DT nucleoside (weergegeven in het ingezoomde gebied). Na synthese, de debescherming van de DNA oligonucleotiden (basisbescherming groepen worden weergegeven als rode bollen) in EDA/tolueen verlaat het gedebeschermde materiaal elektrostatisch gebonden aan het oppervlak en kan vervolgens worden gepipeterd door het toepassen van een kleine hoeveelheid water op het gesynthetiseerde gebied. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Figuur 7 . Representatief extinctie spectrum (220-350 nm) van een gespleten, ontuwde DNA-bibliotheek met 4.000 verschillende sequenties, 100-NT in lengte. Een totaal van 940 ng DNA werd geïsoleerd uit één array synthese, overeenkomend met 30 PMOL DNA totaal, of 15 pmol per glas substraat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tabel 1. Representatieve cyclus protocol voor koppeling/oxidatie/photodeprotection van 5 '-BzNPPOC-da, ervan uitgaande dat de overeenkomstige fosforamiet werd geladen op de poort "A". Koppelings tijd (in seconden) wordt weergegeven op de lijn "koppel monomeer". De UV photodeprotection tijd, hier overeenkomend met een stralingsenergie van 3 J/cm2 (bznppoc photochemistry), wordt berekend als de tijd die is verstreken tussen de twee "gebeurtenis 2 out" communicatie signalen.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tabel 2. Representatieve cyclus protocol voor koppeling/oxidatie/photodeprotection van 5 '-NPPOC-RA, ervan uitgaande dat het overeenkomstige RNA-fosforamidiet op de poort "A" werd geladen. Koppelings tijd (in seconden) wordt weergegeven op de lijn "koppel monomeer". De UV photodeprotection tijd, hier overeenkomend met een stralingsenergie van 6 J/cm2 (nppoc photochemistry), wordt berekend als de tijd die is verstreken tussen de twee "gebeurtenis 2 out" communicatie signalen.

In dit artikel presenteren en bespreken we nieuwe ontwikkelingen in de synthese en toepassingen van nucleïnezuur micro arrays die in situ zijn gefabriceerd. Concreet laten we zien hoe de protocollen voor DNA-synthese kunnen worden uitgebreid naar RNA en hoe micro arrays kunnen worden gebruikt om opvraagbaar nucleïnezuur bibliotheken te creëren.

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

DNA en RNA microarrays zijn zeer nuttig om de interacties tussen nucleïnezuren en eiwitten te bestuderen, maar ze zijn ook een handige methode voor de voorbereiding van sequentiebibliotheken. Fotolithografie maakt het mogelijk om honderdduizenden unieke sequenties parallel te synthetiseren en is momenteel de enige directe methode voor RNA-synthese op microarrays. De in situ fotolithografische synthese van microarrays kan ook worden uitgebreid tot chemisch gemodificeerde oligonucleotiden, bijvoorbeeld met twee priemfluor van peptide nucleïnezuren.Het zien van het proces van microarray fabricage en handling kan helpen begrijpen hoe deze complexe machines is ontwikkeld op basis van de bekende standaard vaste fase DNA synthese. Begin deze procedure met microarray ontwerp en dia functionalisatie zoals beschreven in het tekstprotocol. Zet de DNA synthesizer UV LED en de koelventilator aan.Bevestig een UV-intensiteitsmeter op het brandpunt van binnenkomend UV-licht en zet deze aan. Start op de computer de WiCell Controller-software. Schakel het micromere-apparaat in en initialiseer deze.Laad een volledig wit maskerbestand door met de rechtermuisknop op DMD te klikken en vervolgens de afbeelding laden te selecteren. Klik met de rechtermuisknop op het UVS-pictogram en selecteer UV-sluiter open. Lees de vermogenswaarde op de intensiteitsmeter en tel 60 seconden.Lees na 60 seconden de vermogenswaarde opnieuw en noteer de begin- en eindwaarden. Sluit de sluiter door UV-sluiter te selecteren dicht en schakel de intensiteitsmeter uit. Bereken de gemiddelde UV-intensiteit in milliwatt per vierkante centimeter.Laad in de WiCell-software de taak-, sequentie- en protocolbestanden in hun respectievelijke subvensters en klik vervolgens op verzenden om de sequentie- en protocolbestanden naar de DNA-synthesizer te verzenden. Voor het monteren van de synthesecel plaatst u een dikke perfluoroelastomerpakking op het kwartsblok van de cel. Plaats vervolgens een geboorde, gefunctionaliseerde microscoopplaat bovenop de eerste pakking en controleer of de gaten op de glijbanen verbinding maken met de inlaat- en uitlaatbuizen van de synthesecel.Plaats een tweede, dunne polytetrafluorethyleenpakking over de geboorde glijbaan, rond de twee gaten. Tot slot, plaats een tweede, gefunctionaliseerde maar ongeboorde dia bovenop de tweede pakking. Plaats nu een 4-schroef metalen frame op de top van de geassembleerde dubbele substraat cel Draai de schroef aan dezelfde klemkracht met behulp van een koppel schroevendraaier.Bevestig de inlaat en uitlaatbuizen aan de DNA-synthesizer. Prime de acetonitrile waslijn en controleer de juiste stroom acetonitril door de substraten. Meet het volume acetonitril aan de afvallijn na zeven cycli acetonitrile priming.Dit volume moet twee milliliter zijn. Bevestig de synthesecel aan het brandpuntsvlak van binnenkomend UV-licht. In het geval van bibliotheekvoorbereiding bevestigt u een extra inlaat- en uitlaatlijn aan de achterkant van de cel en vul de achterkamer met de twee milliliters van de betacaroteenoplossing.Start de synthese door eerst te klikken op Draaien in de WiCell-software. Bij de eerste wachtopdracht in het taakbestand drukt u op start op de DNA-synthesizer. Na synthese van gewone microarrays, koppel de cel los van de synthesizer en demontage van de cel.Gebruik een diamantpen om het synthesenummer op de glazen platen te etneren. Etch het nummer op de niet-gesynthetiseerde gezicht van elke dia. Breng de glijbanen in 50 milliliter centrifugebuizen en bewaar in een uitgedroogd gebied tot verder gebruik.Na de synthese van bibliotheekmicroarrays, giet eerst de betacaroteenoplossing uit de kamer en was de kamer vervolgens twee maal door vijf milliliter methyleenchloride door te stromen voordat u aftaste. Voor DNA microarry deprotectie, vul een kleuring glazen pot met 20 milliliter ethanol en 20 milliliter EDA. Plaats de DNA-only microarrays verticaal in de pot, sluit het deksel en laat de dia's twee uur deprotecteren bij kamertemperatuur.Haal na twee uur de glijbanen op met een pincet en spoel ze grondig af met dubbel gedestilleerd water. Droog de glijbanen in een microarray centrifuge voor een paar seconden voordat ze worden opgeslagen in een desiccator. Voor RNA microarray deprotectie, bereid een droge oplossing van 20 milliliter triethylamine en 30 milliliter acetonitril in een 50 milliliter centrifuge buis.Breng een RNA microarray-dia in de centrifugebuis, sluit het deksel en wikkel met plastic afdichtingsfilm. Schud de centrifugebuis voorzichtig op een orbitale shaker gedurende een uur en 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de glijbaan en was twee keer met 20 milliliter droge acetonitrile voordat u een paar seconden in een microarraycentrifuge droogt.Na de eerste deprotectiestap breng de RNA-schuif in de hydrazinehydreoplossing, sluit het deksel en wikkel met plastic afdichtingsfolie. Na twee uur zachtjes schudden op een orbitale shaker, verwijder de dia en was het twee keer met 20 milliliter droge acetonitril. Dan droog in een microarray centrifuge voor een paar seconden.Als de RNA-microarray ook DNA-nucleotiden bevat, ga dan verder met een derde deprotectiestap. Voeg de DNA/RNA microarray toe aan een buis van 50 milliliter met een eda-ethanoloplossing Na 5 minuten bij kamertemperatuur, verwijder de glijbaan en was de microarray twee keer met 20 milliliter steriel water. Droog de glijbaan in een microarray centrifuge en bewaar in een desiccator.Bereid in een 1,5 milliliter steriele microcentrifugebuis de hybridisatiebuffer met Cy3-gelabeld DNA voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng en vortex de oplossing. Plaats voorzichtig een zelfklevende 300 microliter hybridisatiekamer over het synthesegebied op elke glijbaan en pipet in de hybridisatieoplossing.Bedek de gaten van de kamer met kleefpunten en wikkel de hele glijbaan in aluminiumfolie. Plaats de microarray schuif in de hybridisatie oven, dek af en laat het zachtjes draaien op de geselecteerde hybridisatie temperatuur gedurende twee uur. Na twee uur, los de glijbaan, verwijder de aluminiumfolie, pipette uit de hybridisatie oplossing, en voorzichtig scheuren uit de hybridisatiekamer.Breng de glijbanen in een centrifugebuis met 30 milliliter niet-strenge wasbuffer. Schud twee minuten krachtig bij kamertemperatuur. Breng de glijbaan in een centrifugebuis met 30 milliliter Stringent Wash Buffer en schud krachtig gedurende een minuut.Breng ten slotte de schuif over in een centrifugebuis met 30 milliliter Final Wash Buffer. Schud een paar seconden. Droog de glijbaan in een microarray centrifuge.Plaats nu de droge microarray, synthese gebied naar beneden gericht, in de diahouder van de microarray scanner. Om DNA-bibliotheken te beschermen en te klemmen, dompel je de glijbaan onder in de decolletéoplossing, in een 50 milliliter centrifugebuis. Sluit de buis en wikkel met plastic afdichting film, voordat zachtjes draaien in een orbitale shaker gedurende twee uur op kamertemperatuur.Na twee uur, verwijder de glijbaan en was twee keer met 20 milliliter van nauwgezet droge acetonitril voordat u het lucht drogen. Breng met een pipet 100 microliter steriel water aan boven het nu waarneembare synthesegebied. Pipet de oplossing op en neer een paar keer voor de overdracht van het in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Herhaal het proces en combineer de microarray eluaat in dezelfde buis. Verdamp de chip eluate tot droogte en vervolgens redissolve in 10 microliter van nuclease-vrije H2O. Hier zijn de resultaten van een hybridisatie test uitgevoerd op een microarray met de DNA en RNA versies van een 25mer sequentie.De scan in verschijnt in een groenschaal formaat dat overeenkomt met de excitatie, emissiespectrum van Cy3 fluorescentie, met fluorescentie intensiteit geregistreerd in willekeurige eenheden. Er is aanzienlijke variabiliteit in absolute fluorescentiewaarden tussen experimenten. De resultaten voor drie onafhankelijke syntheses met dezelfde fabricageparameters en dezelfde postsynthetische behandeling worden weergegeven.Het 25mer DNA, wanneer gehybridiseerd aan zijn aanvullende Cy3-geëtiketteerde bundel van het etiket, zal fluorescentiesignalen leveren die overal van 20. Het 25mer RNA, wanneer gehybridiseerd aan de zelfde Cy3-geëtiketteerde aanhang van DNA, zal fluorescentieintensiteiten op de overeenkomstige eigenschappen geven die zich van 15., 000 tot 20. Fluorescentieintensiteit van de RNA/DNA duplexen zal echter af en toe dalen tot onder de 8.000, wanneer de overeenkomstige DNA/DNA duplexen nog steeds zullen fluoresceren binnen het bereik van 20.000 tot 30.000.In dergelijke gevallen kunnen de resultaten voor RNA als suboptimaal worden beschouwd. Zoals met elk ander RNA-gebaseerd experiment is het belangrijk om te onthouden dat RNA microarrays gevoelig zijn voor afbraak, en moet worden behandeld onder steriele omstandigheden. Nucleïnezuurbibliotheken verzameld uit microarrays kunnen zowel in DNA- of RNA-sequencing als bij het coderen van digitale informatie over DNA worden gebruikt.De NED produceert een intens UV-licht dat niet direct bekeken mag worden. Daarom wordt geadviseerd om een beschermende bril te dragen terwijl het instrument in gebruik is.

high-density-dna-rna-microarrays-photolithographic-synthesis

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.

Technische demonstratie van Whole Genome Array comparative genomic hybridisatie

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

De Hi-C methode maakt het mogelijk onpartijdige, genoom-brede identificatie van chromatine interacties (1). Hi-C paren nabijheid ligatie en massaal parallelle sequencing. De resulterende gegevens kunnen worden gebruikt om de genomische architectuur studeren op meerdere schalen: eerste resultaten geïdentificeerd functies zoals chromosoom gebieden, scheiding van open en gesloten chromatine, en chromatine structuur op de megabase schaal.

Hi-C: een methode om de driedimensionale architectuur van genoom-onderzoek.

We demonstreren het gebruik van DNA-microarrays voor expressie profilering van het zenuwstelsel. We beschrijven RNA kwaliteitscontrole, monster etikettering, en array-hybridisatie en scannen.

DNA Microarrays: Voorbeeld Quality Control, Array Hybridisatie en scannen

Deze video artikel beschrijft een in vitro microarray gebaseerde methode om het gen doelstellingen en bindingsplaatsen bepalen voor twee componenten systeem respons toezichthouders.

DNA-affiniteit-gezuiverd Chip (DAP-chip) methode om Gene Doelen bepalen voor bacteriële Twee componenten Regulatory Systems

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Hier presenteren we een protocol om RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interacties vast te leggen voor het in kaart brengen van RNA-gerelateerde driedimensionale genoomorganisatie.

RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie methode

Hier worden we gedetailleerd beschreven over de methode van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-wide mapping van intramoleculaire en intermoleculaire RNA-RNA interacties in vivo mogelijk maakt . SPLASH kan toegepast worden om RNA-interacties van organismen te bestuderen, waaronder gist, bacteriën en mensen.

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Leer de fotolithografische synthese van DNA- en RNA-microarrays voor moleculaire biologie. Deze methode maakt parallelle synthese van unieke nucleïnezuursequenties en voorbereiding van retourneerbare bibliotheken mogelijk.

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken (Video) | JoVE Journal

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

Meer video's verkennen