Name: Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Leer de productie van CAR T-cellen voor adoptieve immunotherapie met behoud van functionele competentie. Deze methode optimaliseert T-celkwaliteit tijdens cultuur voor effectieve kankerbehandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd deels gesteund door middel van financiering door Novartis Pharmaceuticals via een onderzoeksinfrastructuur met de Universiteit van Pennsylvania (Michael C. Milone) en de St. Baldricks Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Pennsylvania.
1. T celactivering, transductie en uitbreiding
<ol><li>Activeer verse of cryopreserved primaire menselijke T cellen door te mengen met anti CD3/CD28 magnetische kralen (bijv. dynabeads) in een verhouding van 3 kralen per T cel in 6-well celcultuurgerechten. Kweek T cellen in X-VIVO 15 medium aangevuld met 5% normaal humaan AB serum, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES en IL2 (100 eenheden/mL). Houd T-cellen bij een concentratie van 106 T cellen/ml tijdens de uitbreiding. Kweek T-cellen bij 37 °C, 20% O2en 95% vochtigheid met 5% Co2.</li>
	<li>Voeg na nachtelijke stimulatie lentivirale supernatant toe aan geactiveerde T-cellen. Bereken het volume van supernatant dat nodig is om een multipliciteit van infectie (MOI) van 3 − 5 te bereiken. Opmerking: De CD19-Bbzeta CAR lentivirus plasmide bestaat uit een CD8 scharnier, 4-1BB costimulatory domein, en CD3ζ signalering domein21. CD19-Bbzeta lentivirale supernatant werd gegenereerd zoals eerder beschreven21.</li>
	<li>Op dag 3 Verzamel je een representatief aliquot van cellen voor cryopreservation. Voordat cryopreservation, verwijder de magnetische kralen door zachte pipetteren en magnetische scheiding. Bereid Vries middel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5% dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaar in 4 °C tot het gebruik.<ol>
<li>Centrifugeer T-cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en voeg 5 ml PBS toe. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten en gooi de PBS weg.</li>
		<li>Respendeer de celpellet in 1 ml koud cryopreservatie medium. Vries T cellen in een gekoelde Vries container en bewaar bij-80 °C voor 48 h. Breng de bevroren cellen over naar vloeibaar stikstof.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de rest van de T-cellen eenmaal in 5 mL PBS om de rest vector te elimineren. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. DECANTE de PBS en respendeer de celpellet in T-celkweekmedium met een concentratie van 0,5 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Splits de T-cellen in twee culturen, aangewezen voor dag 5 en dag 9. Count T cellen doorstroming flowcytometrieonderzoeken met behulp van tellen kralen (tabel van de materialen) en monoklonale antilichamen tegen menselijke CD4 en CD8, evenals een levensvatbaarheid kleurstof (tabel van materialen).<ol>
<li>Voor het meten van de celconcentratie, bereidt u een hoofdmix voor met 500 μL PBS, 5 μL telparels, 10 μL 7-amino-actinomycine D-levensvatbaarheid van de cel, 4 μL CD4-FITC en 4 μL CD8-APC. Voeg 40 μL T-cellen toe aan de Master Mix en meet de celconcentratie door Flowcytometrie op basis van het aantal levende T-cellen/kraal tellingen. Refeed om de culturen te behouden in een concentratie van 0,5 x 106 cellen/ml om de andere dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op dag 5, Count en invriezen dag 5 culturen zoals beschreven in de stappen 1,3 en 1,5.</li>
	<li>Was op dag 7 0,5 x 106 T cellen in PBS en respendeer in 100 μL fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) buffer. Detecteer de eiwit expressie van het auto-oppervlak door immunokleuring met een fluorescendig geconjugeerde anti-CAR19 idiotype door flow cytometrie.</li>
	<li>Op dag 9, Count Day 9 culturen en invriezen zoals beschreven in stap 1,3.</li>
</ol>2. fenotypische beoordeling van T-celdifferentiatie
<ol><li>Bereid een Master mix met vooraf getitreerde antilichamen voor anti-CD3 – BV605 (kloon OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (kloon HCD14), anti-CD19-PB (kloon HIB19), anti-CD4-BV510 (kloon OKT4), anti-CD8-H7APC (kloon SK1), anti-CCR7-FITC (kloon 150503), anti-CD45RO – PE (kloon UCHL1), anti-CD27 – PE-Cy7 (kloon 1A4CD27), anti-CD95 – PerCP-CY 5.5 (kloon DX2), en anti-CAR19-APC.</li>
	<li>Bereid individuele fluorescentie minus één (FMO) Controls voor anti-CD45RO – PE, anti-CCR7 – FITC, anti-CD27 – PE-Cy7 en anti-CD95 – PerCP-CY 5.5 om positief bevlekt cellen uit de achtergrond te onderscheiden.</li>
	<li>Bereid dode-celkleurings oplossing voor doorverdunten vanlevend/dode voorraad reagens (tabel met materialen) 1:10000 in PBS.</li>
	<li>Ontdooien dag 3, dag 5 en dag 9 T cellen die eerder cryopreserved waren. Centrifugeer 1 x 106 T cellen uit elke groep bij 300 x g gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg. Was de cellen eenmaal met PBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten en gooi de PBS weg.</li>
	<li>Meng T-cellen met dode kleurings oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen het licht.</li>
	<li>Voeg 1 mL FACS buffer toe om de dode celkleurings kleurstof te bluchen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten, gooi het supernatant weg en breng de celpellet in 100 ΜL FACS buffer met de antilichaam cocktail zoals beschreven in stap 2,1 en 2,2. Incuberen gedurende 1 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 1 mL FACS buffer toe en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten om ongebonden antilichamen af te spoelen. Herhaal driemaal met FACS-buffer.</li>
	<li>Respendeer cellen in 1% Paraformaldehyde (PFA) en bewaar ze bij 4 °C.</li>
	<li>Als CD45RO expressie afneemt na fixatie, analyseer de monsters door flow cytometrie na immunokleuring. Om differentiatie te beoordelen, Gate in de volgende volgorde: onderhemden (FSC-H vs FSC-A), Live CD3+ T cellen (dump [Live-Dead Violet, CD14-PB en CD19-PB VS CD3-BV605], CD4-BV510 VS CD8-APC-H7). In CD4+ -en CD8+ -SUBSETS, Gate on CD45RO-PE versus CCR7-FITC om naïeve T-cellen (CD45RO-CCR7+), TCM (CD45RO+CCR7+), tem (CD45RO+CCR7-) en TTE (CD45RO-CCR7-) te definiëren. Om TSCM te identificeren, Gate op CD27+ T cellen in naïeve-achtige t-cellen populatie. In dit compartiment zijn TSCM CD95+ en TN zijn CD95-.</li>
</ol>3. functionele analyse in vitro
<ol><li>AUTO T celproliferatie en cytokine secretie
	<ol>
<li>Controleer de auto-expressie en de levensvatbaarheid van de cel zoals beschreven in de stappen 1,5 en 1,7, door flow Cytometry.</li>
		<li>Was 5 x 106 T cellen uit elke groep (dag 3, dag 5 en dag 9) met PBS en regenereren in een 1 μM oplossing van carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl Ester (CFSE) in pbs voor 3,5 min bij RT.</li>
		<li>Voeg onmiddellijk 10 mL PBS met 10% foetaal runderserum (FBS) toe om de reactie te doven.</li>
		<li>Centrifugeer de oplossing bij 300 x g gedurende 3 min. Gooi de supernatant weg en herhaal deze Wash stap drie keer. Tel de cellen aan het einde van de CFSE-kleuring met een Coulter-teller (tabel met materialen).</li>
		<li>Oogst CFSE-gekleurd cellen (ongeprikkeld), regenereren in 1% PFA en bewaren bij 4 °C voor analyse door flow cytometrie.</li>
		<li>Inincuberen van het gewenste aantal CFSE-bevlekt auto T cellen met bestraalde K562-CD19 (target) evenals K562-wild type (controle) cellen in een verhouding van 1:1 voor 120 h in cytokine vrije cultuurmedium en cultuur voorwaarden zoals beschreven in stap 1,1.</li>
		<li>Centrifugeer na 24 uur het kweek vat bij 300 x g gedurende 5 minuten en verzamel 120 μL cellulaire supernatant. Evalueer de activerings afhankelijke productie van IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF en andere inflammatoire cytokines (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 en IL10) door luminex-analyses in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant.</li>
		<li>Vervang het volume van supernatant dat in stap 3.1.7 is verzameld met een equivalent volume (120 μL) vers medium.</li>
		<li>Op dag 3 (d.w.z. na 96 h), tellen en opnieuw voeden met een concentratie van 0,5 x 106 cellen/ml met behulp van op kraal gebaseerde Flowcytometrie zoals eerder in stap 1,5.</li>
		<li>Tel op dag 5 de Live CD3+ -cellen en bereken de vouw verandering van levende t-cellen ten opzichte van het aantal levende t Cells op dag 0.</li>
		<li>Voer een uitgebreide analyse uit van CFSE-verdunning in het verdelen van auto T-cellen met behulp van FlowJo-software om opeenvolgende rondes van celdeling te markeren. Opmerking: proliferatie testen worden goed beschreven in de FlowJo handleiding.</li>
	</ol></li>
	<li>Cytotoxiciteits test Opmerking: Het vermogen van CART19 cellen om doelcellen te doden die CD19 uitdrukken, wordt geëvalueerd met behulp van een 51CR-vrijgave test.<ol>
<li>Label de doelcellen door het mengen van 5 x 105 K562-CD19, K562-wild type controle cellen, of NALM6 leukemie cellen met 50 μL Na251Cro4 en 0,5 ml rpmi aangevuld met 10% fbs voor 90 min in de incubator bij 37 °c.</li>
		<li>Centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 2,5 min. Gooi de radioactieve supernatant weg in de juiste afvoerbakken en was de doelcellen in 5 ml PBS. Herhaal de wasstappen twee keer.</li>
		<li>Respendeer de doelcellen in fenolrood-vrij medium met 5% FBS. Gebruik dit medium voor de rest van de procedure om de achtergrond te verminderen.</li>
		<li>Na evaluatie van de auto-expressie en de levensvatbaarheid van de cel doorstroming cytometrie (zoals beschreven in paragraaf 5,1), meng auto T cellen met gelabelde doelcellen op Effector: target (E:T) verhoudingen van 10:1, 3:1 en 1:1, in drievuur. Transfer naar een 96-well U bodemplaat.</li>
		<li>Parallel, omvatten alleen doelcellen, en doelcellen met 1% natriumdodecylsulfaat (SDS), voor het bepalen van spontane (S) en maximale (M) 51CR release, respectievelijk.</li>
		<li>Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten en incueren gedurende 4 uur of 20 uur in een incubator van 37 °c met 5% Co2.</li>
		<li>Na de aangewezen tijd, Centrifugeer het kweek vat bij 300 x g gedurende 5 min. Verzamel 35 μL cellulaire supernatant en breng het over naar een lezers bord. Vermijd bubbels. Laat de plaat 's nachts drogen.</li>
		<li>Sluit de plaat af met een standaard plaat afdichting en Tel met een vloeibare Scintillatie teller. Chroom overvloed in de supernatant biedt een proxy van doelcel doden. Bereken het percentage van specifieke lysis als volgt: 100 x (tellingen per minuut [CPM] experimentele release – CPM S-release)/(CPM M-release-CPM S-release).</li>
	</ol></li>
</ol>4. in vivo functionele analyse
<ol><li>Verkrijg 6 − 10 weken oude NOD-scid γc–/– (NSG) muizen, die een adaptief immuunsysteem missen en ze willekeurig toewijzen aan behandeling/controlegroep.</li>
	<li>Injecteer de dieren intraveneus via een staart ader met 1 x 106 NALM6 cellen in 0,1 ml steriele PBS.</li>
	<li>Na 5 − 7 dagen, bevestig de tumor engraftment door bioluminescentie Imaging (BLI). Injecteer 150 mg/kg D-Luciferin aan muizen die zijn verdoeseerd met Isofluraan (volume is afhankelijk van de lichaamsmassa).</li>
	<li>Meet bioluminescentie waarden met behulp van een beeldvormings systeem. Kwantificeer de totale flux met behulp van de corresponderende software door rechthoeken van identiek gebied rond muizen te tekenen, van hoofd tot 50% van de staartlengte. De achtergrond voor elke afbeelding afzonderlijk aftrekken.</li>
	<li>Na het vaststellen van leukemie, injecteren 3 x 106 dag 9 CART19 cellen, 0,5 x 106 dag 3 auto t cellen, of overeenkomstige niet-transduced (NTD) menselijke t cellen via staart ader in een volume van 100 ΜL van steriele PBS/CA2 +. Opmerking: Aangezien de bioactiviteit van cellen die tijdens het cultuur proces met verschillende intervallen zijn geoogst, verschilt, is de gekozen concentratie van dag 3-cellen lager dan dag 9.</li>
	<li>Om de ziekteprogressie te bepalen, meet u de Bioluminescentie waarden tweemaal per week, zoals hierboven beschreven in stap 4,3.</li>
	<li>Om te bepalen auto T cel engraftment, verzamelen van 75 μL bloed via retro-orbitale bloeden in een EDTA-gecoate buis. Breng 50 μL bloed over naar absolute telbuisjes.</li>
	<li>Beits bloed met antilichamen tegen CD45, CD4, CD8 en auto gedurende 30 min bij RT. Voeg 400 μL 1x FACS lyseren oplossing toe aan de buizen en Vortex grondig. Na kleuring, analyseren oppervlak marker expressie door flow Cytometry. Opmerking: Andere oppervlakte markeringen kunnen worden gebruikt om de differentiatie en uitputting status van de T-cellen in het bloed te beoordelen.</li>
	<li>Voor het meten van cytokines niveaus in het bloed, centrifugeer bloed bij 1.200 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c om serum van de bovenste laag van het bloed te scheiden.</li>
	<li>Verzamel serum en meet de cytokines met een aangewezen Lees plaat volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we de benaderingen voor het meten van de functie en werkzaamheid van auto-T-cellen die met verschillende intervallen worden geoogst in de ex vivo-cultuur. Onze methoden bieden uitgebreid inzicht in assays die zijn ontworpen om proliferatieve capaciteit en Effector functie in vitro te beoordelen. We beschrijven hoe te meten auto t cel activiteit na stimulatie door de auto en detail xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie met behulp van auto t cellen geoogst op dag 3 vs dag 9 van hun logaritmisc...

Chimeric antigeen receptoren (Auto's) bieden een veelbelovende aanpak om te leiden T-cellen tegen verschillende tumor antigenen. Auto's zijn synthetische receptoren die een antigeen doelwit binden. Hoewel hun precieze samenstelling variabel is, bevatten Auto's over het algemeen 3 verschillende domeinen. Het extracellulaire domein leidt binding aan een doel antigeen en bestaat meestal uit een single Chain antilichaam fragment gekoppeld aan de auto via een extracellulaire scharnier. Het tweede domein, vaak afgeleid van de CD3ζ keten van het T Cell receptor (TCR) complex, bevordert de activering van de T-cel na de betrokkenheid van de auto. Een derde costimulatory domein is opgenomen ter verbetering van de functie van de T-cel, engraftment, metabolisme, en persistentie. Het succes van auto T-cel therapie in verschillende hematopoietische maligniteiten, waaronder B-cel acute lymfoblastische leukemie (alle), chronische lymfatische leukemie (CLL) en multipel myeloom wijst op de therapeutische belofte van deze aanpak1,2,3,4,5,6. De recente Food and Drug Administration (FDA) goedkeuringen voor twee CD19-specifieke CAR T Cell therapieën, tisagenlecleucel voor pediatrische en jong volwassen ALL en axicabtagene ciloleucel voor diffuus groot B-cel lymfoom, versterkt de translationele verdienste van auto T-cel therapie.
AUTO T-gebaseerde benaderingen omvatten het isoleren van T-cellen van perifeer bloed, activering, genetische modificatie en expansie ex vivo. Differentiatie is een belangrijke parameter die de werkzaamheid van de CAR T cel regelt. Daarom versterkt het beperken van de celdifferentiatie tijdens de ex vivo-cultuur het vermogen van het geïnfundeerd product om te graveren, uit te breiden en te blijven bestaan, waardoor lange termijn immunosurveillance wordt gegeven na adoptie overdracht2,7,8,9. T-cellen bestaan uit verschillende afzonderlijke subsets, waaronder: naïeve T-cellen (TN), centraal geheugen (TCM), Effector-geheugen (TEM), Effector-gedifferentieerd (TTE) en stamcel geheugen (TSCM). Effector gedifferentieerde T cellen hebben krachtige cytolytische vermogen; ze zijn echter van korte duur en graveren slecht10,11,12. T-cellen met een minder gedifferentieerd fenotype, met inbegrip van naïeve T-cellen en TCM vertonen daarentegen superieure engraftment en proliferatieve vaardigheden na adoptie van celoverdracht13,14,15,16,17,18. De samenstelling van de verzamelde T-cellen in het Voorgefabriceerde product kan variëren tussen patiënten en correleert met het therapeutische potentieel van auto T-cellen. Het aandeel van T-cellen met een naïef immunoffenol type in het startende aferese product is sterk gecorreleerd met zowel engraftment als klinische respons19.
Cultuur duur is een belangrijke parameter die de differentiatie in auto T-cellen voorbereid voor adoptie overdracht beïnvloedt. We hebben onlangs een aanpak ontwikkeld voor het genereren van superieure kwaliteit auto T-cellen met behulp van een verkorte cultuur paradigma20. Met behulp van onze aanpak, we toonden dat beperkte cultuur geeft aanleiding tot auto T cellen met superieure Effector functie en persistentie na adoptie overdracht in xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie. Hier presenteren we de benaderingen om betrouwbaar te genereren CART19 cellen (autologe T cellen ontworpen om uit te drukken anti-CD19 scFv gekoppeld aan CD3ζ en de 4-1BB signalering van domeinen) en bevatten een gedetailleerde beschrijving van de assays die inzicht geven in auto T bioactiviteit en werkzaamheid voorafgaand aan adoptie overdracht.

<table><tbody><tr><td>Anti CD3/CD28 dynabeads</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Life Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads,</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS, premium grade</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td><td>Molecular Probes</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-human CD14 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-human CD19 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-human CD45RO Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red-free medium</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Solution, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

productie van chimerische antigeen receptor (auto) t cellen voor adoptie immunotherapie

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Adoptie immunotherapie is veelbelovend voor de behandeling van kanker en infectieziekten. We beschrijven een eenvoudige benadering om primaire menselijke T-cellen te leiden met een chimerische antigeen receptor (auto) en hun nageslacht ex vivo uit te breiden. We nemen assays op om auto-expressie te meten, evenals differentiatie, proliferatieve capaciteit en cytolytische activiteit. We beschrijven assays meten Effector cytokine productie en inflammatoire cytokine secretie in auto T-cellen. Onze aanpak biedt een betrouwbare en uitgebreide methode voor cultuur auto T-cellen voor preklinische modellen van adoptie immunotherapie.

Met behulp van de hierboven beschreven methoden hebben we de T-cellen voor 3 of 9 dagen gestimuleerd en uitgebreid (Figuur 1A, B). We analyseerden ook hun differentiatie profiel, zoals aangegeven door de gating-strategie in Figuur 1C, door het meten van de overvloed aan verschillende glycoproteïnen uitgedrukt op het celoppervlak. We tonen een progressieve verschuiving naar Effector differentiatie in de tijd tijdens de ex vivo cu...

We beschrijven een aanpak om betrouwbaar te genereren chimeer antigeen receptor (auto) T cellen en testen hun differentiatie en functie in vitro en in vivo.

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating een CAR T Cell product met functionele competentie die engraft, vermenigvuldigen en heeft cit-el-uric activiteit na infusie is een belangrijk onderdeel van een effectieve adoptie-immunotherapie. Bijvoorbeeld, in vaste tumoren, CAR T cellen kunnen ze doordringen vaste tumoren en ze krijgen optimale antigeen stimulatie;echter, hun algehele engraftment en proliferatie wordt belemmerd bij mensen. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat het de kwaliteit van de CAR T-cellen of de differentiatietoestand van de CAR T-cellen kan behouden zonder terminaal gedifferentieerde of uitgeputte T-cellen te genereren, wat de proliferative capaciteit of een slechte effectieve functie na infusie zou hebben verminderd.Deze techniek kan moeilijk zijn omdat T-cellen zijn zeer gevoelig voor hun celconcentratie of het oppervlak van de vaten die hun gekweekt in. Evenals hun metabolische behoeften. In wezen T-cellen moeten gelukkig worden gehouden gedurende het hele proces, anders zullen ze niet groeien.Om deze procedure te beginnen, uiteengezet 6-well cultuur gerechten. Activeer verse of cryo-bewaarde primaire menselijke T-cellen door ze te mengen met anti-CD3 CD28 magnetische kralen, met een verhouding van drie kralen per T-cel in de putten van de kweekgerechten. Kweek de T-cellen in X-Vivo 15 medium aangevuld met normaal menselijk AB serum, L-glutamine, he-pees en IL2.Activeer de T-cellen met een concentratie van een miljoen T-cellen per milliliter tijdens de expansie. En kweek ze bij 37 graden Celsius met 20%zuurstof, 5% kooldioxide en 95% vochtigheid. Voeg na s nachts stimulatie lentivirale supernatants toe aan de geactiveerde T-cellen.Bereken het volume van supernatants die nodig zijn om een veelheid van infectie tussen drie en vijf te bereiken. Doorgaan met het kweken van de cellen met dezelfde voorwaarden. Verzamel op dag drie een representatief aliquot van de cellen van cryo-bewaring.Verwijder voorafgaand aan cryo-bewaring de magnetische kralen door zachtjes pipetten en magnetische scheiding. Bereid het vriesmedium, dat PBS bevat met 0,5%DMSO. En bewaar het op vier graden Celsius tot klaar voor gebruik.Vervolgens centrifugeren de T-cellen op 300 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en voeg vijf milliliter PBS toe. Centrifugeren de cellen opnieuw op 300 keer G gedurende vijf minuten en gooi de PBS.We schorten de pellant op in een milliliter koud cryo-conserveringsmedium. Vries de T-cellen in een gekoelde vriescontainer. En bewaar op min 80 graden Celsius voor 48 uur.Breng hierna de bevroren cellen over op vloeibare stikstof. Was de rest van de T-cellen eenmaal in vijf milliliter PBS om eventuele resterende vectoren te elimineren. Centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten.Decanteer de PBS en schort de cel pellant opnieuw op in T-celkweekmedium met een concentratie van 500.000 cellen per milliliter. Splits de T-cellen in twee culturen ontworpen 45 en negen. Tel de T-cellen door stroom cytometrie met behulp van het tellen van kralen en monoklonale antilichamen aan de menselijke CD4 en CD8.Evenals een levensvatbaarheid kleurstof. Voer de culturen om de andere dag om ze te handhaven op een concentratie van 500,000 cellen per milliliter. Op dag vijf, tellen en cryo-behouden de dag vijf culturen zoals eerder beschreven.Op dag zeven, was 500.000 cellen in PBS. En schors ze opnieuw in 100 microliters van fluorescentie geactiveerde celsorteerbuffer. Detecteer vervolgens de oppervlakte-eiwitexpressie van de CAR door immuno-kleuring met een fluorescerende geconjugeerde anti-CAR 19 idio-type door stroomcytometrie.Op dag negen tellen en cryo-behouden de dag negen culturen zoals eerder beschreven. In deze studie worden de functie en werkzaamheid van CAR T-cellen gemeten die met verschillende intervallen in de X-Vivo-cultuur worden geoogst. Met behulp van de methoden beschreven in deze video, T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid voor drie of negen dagen.Het cellendifferentiatieprofiel zoals aangegeven door de hier getoonde gatingstrategie, wordt geanalyseerd door de overvloed aan duidelijke glycoproteïnen op het celoppervlak te meten. Een geleidelijke verschuiving naar effector differentiatie wordt gezien in de tijd tijdens de X-Vivo cultuur. De effectorfunctie en proliferative capaciteit van CAR T-cellen in reactie op antigeen wordt vervolgens beoordeeld.Cellen die minder worden uitgebreid zijn functioneel superieur aan die op grote schaal gekweekt over een langere duur. In een menselijk xenograft muismodel van ALL wordt de potentie van CAR T-cellen die in verschillende perioden worden geoogst, vergeleken. De negen daagse cellen tonen een dosisafhankelijke anti-lukemische respons met een volledige respons ter waarde van een hoge dosis van drie miljoen; en een verlies van werkzaamheid voor de lage dosis van 500.000.Echter, de dag drie cellen toonde aanhoudende tumor controle in zowel hoge als lage doses. Deze respons wordt geassocieerd met de absolute telling van CAR-T 19 in het perifere bloed van muizen. Over het geheel genomen leveren deze resultaten aan dat CAR T-cellen die eerder zijn geoogst, beter presteren dan de later geoogste cellen.Na deze procedure kunnen aanvullende functietesten worden uitgevoerd, zoals zeepaardjestest om hun metabolische eigenschappen te meten, zoals zuurstofverbruik of spir-it-ed capaciteit. Verschillende rondes van re-stimulatie kunnen ook worden uitgevoerd om inzicht te geven in hun differentiatie en persistentie van CAR T-cellen. Met behulp van dit werk als basis zijn wij en andere onderzoekers bezig met studies om het cultuurproces verder af te korten.Het kan ook worden uitgebreid in de kern benaderingen ontwerp voor andere kanker antigenen. Zorg moet altijd worden genomen wanneer u werkt met lentivirus. Maar zelfs wanneer het lentivirus is ontworpen om replicatie incompetent te zijn.

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates a technique to manufacture chimeric antigen receptor (CAR) T cells ex vivo. Human T cells are incubated with magnetic beads coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, along with a medium supplemented with interleukin-2 (IL-2), leading to T cell activation and proliferation. Transgenic lentiviral vectors are introduced, allowing the transgenic RNA to integrate into the host genome and express the transgene. This results in the transduced T cells expressing chimeric...

An Ex Vivo Technique to Manufacture Chimeric Antigen Receptor T Cells

This video demonstrates a technique for the ex vivo generation of tumor antigen-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells. Retroviral vectors carrying transgenic RNA are mixed with spleen cells in a medium supplemented with interleukin-2 to promote T-cell survival and proliferation. The mixture is then transferred to a plate coated with recombinant human fibronectin fragments and centrifuged to facilitate the fusion of the virus with the cell, allowing the RNA to integrate into the host...

An Ex Vivo Technique to Generate Tumor-Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells

We beschrijven een kwantitatieve real-time in vitro cytolysis assay systeem om de potentie van chimere antigeen receptor T-cellen gericht op vloeibare en solide tumorcellen te evalueren. Dit protocol kan worden uitgebreid om andere immuuneffector cellen te beoordelen, evenals combinatie behandelingen.

Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

Hier presenteren we een protocol voor genbewerking in primaire menselijke T-cellen met behulp van CRISPR Cas-technologie om CAR-T-cellen te wijzigen.

Productie van menselijke CRISPR-engineered CAR-T-cellen

Dit artikel beschrijft het productieproces voor chimere antigeenreceptor-T-cellen voor klinisch gebruik, met name met behulp van een geautomatiseerde celprocessor die virale transductie en kweek van T-cellen kan uitvoeren. We geven aanbevelingen en beschrijven valkuilen waarmee rekening moet worden gehouden tijdens de procesontwikkeling en implementatie van een klinische studie in een vroege fase.

Chimere antigeenreceptor T-celproductie op een geautomatiseerde celprocessor

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Dit protocol schetst een gedetailleerde procedure voor het genereren van voorbijgaande chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen met behulp van niet-integrerend mRNA voor kankerimmunotherapie en biedt betrouwbare methoden voor het evalueren van CAR-T-cellen en hun cytotoxische functie.

Een niet-virale benadering om voorbijgaande chimere antigeenreceptor-T-cellen te genereren met behulp van mRNA voor immunotherapie bij kanker

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor de kweek van primaire T-cellen, waaronder hun isolatie, activatie, expansie en tijdelijke transfectie door mRNA-elektroporatie. Daarnaast worden een workflow en antilichaampanel voorgesteld voor flowcytometrische analyse van fenotype, activatiemarkers, levensvatbaarheid en chimere antigeenreceptor (CAR)-expressie.

Isolatie, cultivatie en tijdelijke transfectie van primaire menselijke T-cellen om chimerische antigeenreceptoren (CAR) T-cellen te genereren

Leer de productie van CAR T-cellen voor adoptieve immunotherapie met behoud van functionele competentie. Deze methode optimaliseert T-celkwaliteit tijdens cultuur voor effectieve kankerbehandeling.

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Meer video's verkennen