Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

De fabricage van buisvormige structuren is een veelbelovende benadering van weefselmanipulatie van vasculaire netwerken, die een van de belangrijkste uitdagingen blijft bij de teelt van dikke weefsels in vitro. Het belangrijkste voordeel van de core/shell techniek is de eenvoudige productie van holle filamentsteigers in één stap, waardoor de fabricagetijd wordt verkort en direct afdrukken met cellen mogelijk wordt. Het voorbereiden van een hydrogelformulering met de juiste visco-elastische eigenschappen en het in stand houden van een continue evenwichtige stroom van de kern/schaalmaterialen is cruciaal voor 3D-printen van stabiele steigers.

Vul om te beginnen de steriele 5 mL spuit met vers bereide hydrogel. Vul een tweede 5 mL spuit, uitgerust met een 27-meter stompe naald, met vers voorbereide crosslinking oplossing. Monteer de kern/shell mondstuk.

Steek een G27 stompe naald als kerncomponent en bevestig de naald met behulp van de schroef. De binnennaald moet ongeveer 1 mm uitsteken van de buitenste kern shell mondstuk. Sluit de spuit aan met de crosslinking-oplossing op de G27-naald in het mondstuk en laad de spuit in een van de extrudersteunen van een ethanol-gesteriliseerde 3D-printer.

Monteer de spuit met hydrogel in de tweede extruder en sluit deze aan op het mondstuk. Gebruik een Luer lock om een korte buis aan te sluiten op de zijluer ingang van de kern / shell mondstuk. Pas de uitlijning voorzichtig handmatig aan totdat het mondstuk het oppervlak raakt voordat u het mondstuk intrekt tot een afstand die gelijk is aan de buitenste nozzlediameter.

Importeer de gegenereerde steigerg-code en druk op Afspelen om het afdrukproces te starten. Verwijder na het printen voorzichtig het substraat met het bedrukte steiger en giet de secundaire crosslinking-oplossing over het gehele steiger. Broed het schavot voor een minuut bij kamertemperatuur.

Om het schavot los te maken van het substraat, trek voorzichtig het schavot zijwaarts. Als het schavot sterk aan het substraat hecht, steek dan een scherpe rand tussen beide materialen om ze te scheiden. Breng de steiger over op een verse container.

UV steriliseren beide zijden van het schavot gedurende 30 minuten per zijde. Plaats vervolgens het steiger in een kleurloze celcultuurmedium en broed het schavot op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende ten minste 24 uur. De volgende dag, oogst huvex uit een in-vitro cultuur met 0,25% trypsin gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius.

Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de enzymatische reactie met 3 mL verse celkweek medium en verzamel de cellen door centrifugatie. Schort de pellet opnieuw op in vers kweekmedium dat fenolrood bevat en verdun de cellen tot een 3,4 keer 10 tot de vijfde endotheelcellen per milliliterconcentratie. Laad de cellen in een steriele spuit van 5 mL uitgerust met een naald van 27 meter en zoek een ingang in het schavot.

Het uitlijnen van de naald met het rechte gedeelte van de steiger filament, zorgvuldig doorboren van de steiger onder een lage hoek. Bevestig dat de naald zich in de holle gloeidraad van het kanaal bevindt en druk de zuiger voorzichtig in om ongeveer 1-2 mL celsuspensie in het schavot te injecteren. De stroom van de suspensie moet zichtbaar zijn door het doorschijnende schavot.

Wanneer het hele schavot is gevuld met celsuspensie, dompel het schavot onder in verse celkweekmedium en breng het steiger terug naar de celkweek incubator voor maximaal 10 dagen. Voor live/dode beeldvorming aan het einde van de incubatie, spoel het schavot met PBS en gebruik een stompe naald om zorgvuldig te injecteren live / dode oplossing in het schavot. Bevestig dat de oplossing het hele schavot heeft gevuld en plaats het schavot 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Spoel aan het einde van de incubatie de steiger af met PBS en breng de steiger voorzichtig over op een glazen glijbaan. De geverfde cellen kunnen dan worden waargenomen in de steigers onder een fluorescentiemicroscoop. In deze dwarsdoorsnede van een vers bedrukt en post-verwerkt steiger kan een duidelijk zichtbaar hol kanaal worden waargenomen in de gloeidraad.

Zelfs na 72 uur incubatie in celkweekmedium bij 37 graden Celsius, zoals aangetoond, behoudt de gloeidraad de holle structuur over de gehele steigerlengte. Hier wordt een representatieve levende/dode test van endotheelcellen na 48 uur cultuur binnen een steiger getoond. De levende cellen kunnen worden geïdentificeerd door hun felgroene tl-signaal.

Deze techniek is de basis voor de eenstapfabricage van holle buisvormige steigers en kan worden opgewaardeerd door direct te printen met behulp van cellen die in de bio-inkt zijn verwerkt.