Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

Dit protocol is belangrijk omdat het gebruik van bevroren weefsel de logistiek vereenvoudigt bij de evaluatie van meerdere weefsels, monsteroverdracht naar een extern laboratorium voor analyse mogelijk maakt en een beslissing om een weefsel maandenlang te analyseren, kan uitstellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik van bevroren kubusweefsel geen personeel vereist dat is opgeleid in de komeettest bij obductie, en minimaliseert de kans op technische fouten en mechanische DNA-schade die tijdens monstermanipulatie is geïntroduceerd. Deze techniek heeft toepassing in preklinische geneesmiddelenontwikkeling, de veiligheidsbeoordeling van chemische stoffen die het milieu binnenkomen en levensmiddelenadditieven.

Bevroren weefsels kunnen worden gebruikt in de komeettest om genotoxische mogelijkheden, DNA-herstel, beschermende effecten tegen DNA-schade veroorzaakt door chemotherapie of bestraling, en voor milieubio-monitoring te evalueren. Idealiter moeten experimenten worden opgezet om de verwerking van elk weefselmonster tot de vriesstap mogelijk te maken voordat organen die van het volgende dier worden geoogst, beschikbaar komen voor verwerking. Bevroren weefsels kunnen worden aangeklaagd in de komeettest om genotoxic potentieel, DNA-herstel, beschermende effecten tegen DNA-schade veroorzaakt door chemotherapie of bestraling, en voor milieubio-monitoring te evalueren.

Technisch trainer Carole Bobbitt en onderzoekslaborator Eileen Gilas zullen vandaag dienst doen als prosector. Onderzoeksmedewerker Lincoln Martin en histologietechnicus Amelie Ladesseur demonstreren monsterbehandeling. Om deze procedure te beginnen, verwijder alle aangesloten bindweefsel, organen en puin uit een orgaan van belang.

Onmiddellijk zwiepen het orgaan krachtig in een middelgrote weegboot met ongeveer zeven milliliter koude, vers bereide snijoplossing om resterende bloed en puin te verwijderen. Breng het orgaan over naar een andere schone weegboot met voldoende koude gehaktoplossing om het weefsel ondergedompeld te houden en het op ijs te houden tot verdere verwerking. Voor de lever, snijd een vijf millimeter longitudinale sectie van de linker kwab en zachtjes zwiepen in ongeveer zeven milliliter koude snijoplossing.

Plaats vervolgens de strook weefsel in een schone middelgrote weegboot met ongeveer zeven milliliter koude snijoplossing en houd op ijs tot het klaar is om verder te verwerken. Verwijder een deel van de lever en plaats het in een inbedding cassette. Uitvoeren van vaststelling, trimmen, en paraffine inbedding volgens het laboratorium standaard procedures voor mogelijke toekomstige histopathologie evaluatie.

Snijd voor de twaalfvingerige darm een 10 millimeter gedeelte van de twaalfvingerige proximale in de maag. Steek een naald van 21 tot 25 meter in het ene uiteinde van de twaalfvingerige darm en spoel deze door met een milliliter koude snijoplossing om vuil en bacteriën te verwijderen. Draai de twaalfvingerige darm om, spoel het opnieuw met een andere milliliter van het snijden oplossing en gooi de naald.

Snijd de twaalfvingerige darm open en spoel het in ongeveer zeven milliliter van snijoplossing. Spoel vervolgens de twaalfvingerige darm opnieuw en houd deze in een gehaktoplossing op ijs totdat deze klaar is om verder te verwerken. Snijd en fix een deel van de resterende twaalfvingerige darm voor mogelijke toekomstige histopathologie evaluatie zoals eerder beschreven voor de lever.

Voor de hersenen kan het nuttig zijn om eerst de hersenen in twee hersenhelften te verdelen, waarbij één halfrond wordt opgeslagen voor mogelijke histopathologie. Ontleden de hersengebieden van belang, dan voorzichtig spoelen, en te handhaven op ijs in snijoplossing tot klaar om verder te verwerken, zoals eerder beschreven voor de lever en twaalfvingerige darm. Voor de maag, verwijder en gooi de voormaag.

Snijd de kliermaag open en was deze vrij van voedsel door het te zwiepen in een middelgrote weegboot met ongeveer zeven milliliter koude snijbuffer. Verwijder een vijf millimeter strook kliermaag proximale aan de twaalfvingerige darm voor fixatie voor mogelijke histopathologie evaluatie zoals eerder beschreven. Plaats de resterende maag in een middelgrote weegboot met ongeveer zeven milliliter koude snijbuffer en broed gedurende 15 tot 30 minuten op ijs.

Breng hierna de maag over op een schoon stuk paraffine en gebruik een scalpelblad of plastic celschraper om het oppervlakteeptheel minstens twee keer voorzichtig te schrapen om puin te verwijderen. Pak het maagslijmvlies met tangen en gebruik een pipet om het te spoelen met een milliliter koude snijbuffer. Breng het gespoelde maagweefsel over op een schoon oppervlak of schaal en voeg koude hakoplossing toe.

Gebruik de achterkant van een scalpelmes of een plastic celschraper om het maageptheel vier tot vijf keer zorgvuldig te schrapen om de cellen vrij te geven. Gebruik vervolgens een pipet om de gehaktoplossing met de vrijgekomen cellen te verzamelen en breng deze over naar een microcentrifugebuis op ijs. Voor het snijden van weefsel monsters, snijd een deel van de lever, hersenen, of twaalfvingerige darm en breng het naar een gelabelde microcentrifuge buis met een milliliter koude snijoplossing.

Gebruik een schaar om het monster snel te gehakt totdat het uiteindelijk wordt verspreid, terwijl het monster koud blijft. Het monster moet er licht troebel uitzien. Echter, het is gebruikelijk voor sommige stukken te blijven die zich zal vestigen op de bodem van de buis.

Om het weefsel te gebruiken terwijl het vers is, moet u de buizen met de monsters op ijs houden. Om de weefselmonsters te bevriezen, bevestigt u het deksel van de buis onmiddellijk na het hakken of verzamelen en laat u de buis in een Dewar-kolf met vloeibare stikstof vallen. Gebruik aan het einde van de weefseloogst een pollepel om de monsterbuizen op te halen en leg ze op droogijs om te sorteren.

Breng de buizen naar een vrieskist op droogijs en bewaar de doos in een vriezer op min 80 graden Celsius. Om bevroren blokjes weefsel voor te bereiden, snijd verschillende kleine stukjes weefsel en laat ze individueel direct in een middelgrote weegboot of een ander geschikt vat met vloeibare stikstof voor een paar seconden. Nadat de stukken volledig zijn bevroren, breng de bevroren weefselblokjes individueel over op gelabelde microcentrifugebuizen, of cryobuizen, op droogijs.

Breng de buizen aan het einde van de weefseloogst over naar een vrieskist op droogijs en bewaar de doos in een vriezer bij min 800 graden Celsius. Bij gebruik van vers gehakt of geschraapt weefsel onderhouden op nat ijs, bereiden komeet glijbanen binnen een uur na de oogst. Bij gebruik van bevroren gehakt of geschraapt weefsel, plaats buizen van bevroren weefsel in een waterbad bij kamertemperatuur totdat de monsters volledig ontdooid zijn, terwijl ervoor te zorgen dat ze koud worden gehouden.

Zodra de monsters ontdooid zijn, breng je de buizen onmiddellijk over op ijs. Voor in blokjes blokjes, haal de buizen met de blokjes uit de vriezer en te handhaven op droogijs tot dia voorbereiding. Aliquot een milliliter van het medium van de handelaar of een snijoplossing in een gelabelde 1,7 milliliter microcentrifuge buis voor elk monster en te handhaven op ijs.

Snel werken om ontdooien te voorkomen, plaats een kubus van weefsel in het open uiteinde van een kamertemperatuur weefsel vermenging apparaat. Steek snel een maat gematchte spuitzuiger in het apparaat om het weefsel in het mesh-uiteinde te duwen, dat vervolgens in de microcentrifugebuis moet worden geplaatst met de koude gehaktoplossing. Dompel het gaaseind van het apparaat ongeveer vijf tot tien seconden onder in de koude mesoplossing om het weefsel volledig te ontdooien.

Druk de zuiger volledig in totdat cellen door de mazen worden zien extruderen. Trek vervolgens de zuiger ongeveer 2,5 centimeter omhoog en druk weer volledig naar beneden. Herhaal dit meerdere malen, totdat de hakoplossing troebel wordt.

Om dia's voor te bereiden, meng een celsuspensie voorzichtig en breng 50 microliter over naar een buis met 450 microliter van 0,5% laag smeltpunt bij 37 graden Celsius. Bereid en scoor de dia's zoals beschreven in het tekstprotocol. In de eerste studie, lever werd geoogst uit twee cohorten van mannelijke Sprague Dawley voertuig controle ratten gespreid door een week.

Glijbanen werden bereid uit vers gehakt weefsel, bevroren gehakt weefsel, en bevroren blokjes weefsel. Aangezien de OESO aanbevolen bovengrens voor procent staart DNA in verse rat lever is 6%deze resultaten tonen aan dat een van de vriesmethoden goed kan werken voor de evaluatie van weefsel. Over het algemeen, het percentage egels parallel met het procent staart DNA, hoewel bevroren weefsels vertoonden grotere variabiliteit.

In het tweede onderzoek werden vrouwelijke B6C3F1 muizen toegediend voertuig of de mutagen ethylmethaansulfonaat. De procent staart DNA resultaten geven aan dat leverweefsel bevroren als kubussen en vervolgens verwerkt met behulp van het weefsel snijden apparaat resultaten zeer vergelijkbaar met die verkregen voor vers gehakt weefsel. Een statistisch significante toename van EMS geïnduceerde DNA-schade werd gemeten in weefselmonsters die met alle drie de methoden werden verwerkt.

In de derde studie werden levermonsters van vrouwelijke B6C3F1-muizen in een 90-daagse chemische toxiciteitsstudie geanalyseerd. DNA-schade in bevroren gehakt weefsel was hoog in alle dosisgroepen, met aanzienlijke variabiliteit van dieren tot dieren. De procenten staart DNA resultaten gecorreleerd met procent egels, wat aangeeft dat egels aanzienlijk bijgedragen aan het hoge niveau van DNA-schade die werd waargenomen in deze monsters.

In tegenstelling, zowel DNA beschadigd en procent egels waren zeer laag in de flits bevroren blokjes weefsel dat was bereid in parallel met het gehakte weefsel monsters. Zo waren de sterk beschadigde cellen gemanifesteerd als egels in het gehakte weefselmonsters duidelijk niet het resultaat van een biologisch proces, maar werden waarschijnlijk geïntroduceerd door mechanische verstoring, en, of weefsel opwarming tijdens de gehaktprocedure voordat ze flash bevroren. Daarom werden de gegevens voor gehakt weefsel als onbetrouwbaar beschouwd.

Ter vergelijking: er werden gegevens van hoge kwaliteit verkregen uit het bevroren blokjesweefsel, zelfs na langdurige opslag. Het is van cruciaal belang om geoogste weefsels koud en vochtig te houden en snel te werken om de monsters te bevriezen. Ook moet bevroren kubusweefsel onmiddellijk voorafgaand aan de homogenisatiestap ontdooid worden.

Bevroren weefselmonsters zijn geschikt voor andere downstreamtoepassingen, waaronder bijvoorbeeld wijzigingen van de komeettest om oxidatieve schade of kruisverband op te sporen, en evaluatie van veranderingen in genexpressie. Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van scalpelbladen om weefsels te snijden of te schrapen en bij het hanteren van vloeibare stikstof tijdens het vriesproces.