Identificeren van mutaties door een hoge resolutie smelting in een TILLING populatie van rijst
2 september 2019
In dit artikel presenteren we het protocol dat wordt beschreven als High-Resolution smelt analyse (HRM) gebaseerde doel geïnduceerde lokale laesies in Genomes (TILLING). Deze methode maakt gebruik van fluorescentie veranderingen tijdens het smelten van de DNA-duplex en is geschikt voor screening met hoge doorvoer van zowel inbrengen/deletie (Indel) als single base substition (SBS).
Het zou heel nuttig zijn voor fokeigenschappen die technisch moeilijk of kostbaar zijn om te bepalen, zoals ziekteresistentie, mineraalgehalte. Het is een vrij eenvoudige, kosteneffectieve en hoge doorvoertechniek. Om te beginnen, plaats vier bladschijven in elke put van een 96-well PCR-plaat.
Voeg 50 milliliter buffer een oplossing in elke put. Vries de plaat in een min 80-graden Celsius vriezer voor 10 minuten. Bevries vervolgens de plaat op kamertemperatuur.
Incubeer op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg 50 microliter buffer B toe aan elke put en meng goed door vortexen. Centrifugeren de plaat gedurende een minuut op 1, 500 keer g.
Verzamel de supernatant als DNA voor PCR. Gebruik eerst de DNA-supernatant van één goed en PCR-sjabloon om de temperatuur te optimaliseren. Voeg reagentia en een microliter van DNA supernatant in elke PCR goed.
Plaats de PCR-buizen in een gradiënt-geschikt thermisch blok, en pas het verwarmingsprogramma aan volgens het manuscript om de optimale annealing temperatuur voor elk doelfragment te bepalen. Voer elektroforese uit voor het PCR-product op 1%agarose gels om amplicons te onderzoeken. Bepaal de optimale annealing temperatuur die specifieke versterking van het doelfragment mogelijk maakt.
Om HRM-analyse uit te voeren, combineer reagentia, waaronder een microliter van 10 keer fluorescentiekleurstof en één microliter van het DNA-supernatant in elke bron van HRM-compatibele platen. In elke plaat, omvatten een wild-type ouderschap monster en een negatieve controle zonder DNA. Voeg een druppel minerale olie aan elke put om verdamping te voorkomen.
Sluit vervolgens de plaat af met kleeffolie en vermaal 1000 keer g gedurende een minuut. Voer de PCR uit met de geoptimaliseerde annealing temperatuur. Verwijder nu de kleeffolie van de plaat en steek de plaat in een HRM-machine.
Selecteer in de software Nieuwe run in het bestandsmenu of druk op de knop Uitvoeren boven aan het scherm. Geef de begin- en eindtemperaturen op voor de smelt van 55 tot 95 graden Celsius. Selecteer monsters voor smeltanalyse met hoge resolutie en sluit monsters uit die vergelijkbaar zijn met de negatieve controle.
Normaliseer de smeltende rondingen om dezelfde begin- en eindfluorescentie te hebben. Bevestig visueel dat de lagere minimum- en lagere maximumtemperatuurcursors zich in een gebied van de curven bevinden. Houd de delta F, verschil van fluorescentie, niveau op de standaard instelling van 05.
Selecteer in de selectielijst Standaarden de algemene versus-variant en kies de normale gevoeligheid. Selecteer H12 om het wilde type als besturingselement te gebruiken. Monsters met een delta F-waarde groter dan 05 worden geacht gemuteerde planten te bevatten.
Vervolgens, met behulp van een CTAB-methode, extract DNA uit elk van de vier planten uit de mutant zwembad met de smeltcurve aanzienlijk verschillend van het wilde type. Na kwantificering met behulp van een spectrofotometer, pas het DNA met de NanoDrop 2000 aan een uiteindelijke concentratie van ongeveer 25 nanogram per microliter. Voeg 0,4 microliter PCR-primers toe aan het DNA-monster in de PCR-buizen, plaats ze in een thermische cycler en pas het programma aan om het doelfragment te versterken.
Stuur vervolgens de PCR-producten naar een bedrijf voor sequencing. Na Sanger sequencing, vergelijk de moleculaire laesie door het vergelijken van de sequenties tussen de M2 plant en het wilde type. In deze studie toonden HRM-scanning en -analyse van M2-zaailingen voor mutaties in OsLCT1- of SPDT-genen aan dat de meeste monsters smeltcurven hadden die niet significant verschilden van het wilde type met delta F minder dan 05.
De mutanten vertoonden aanzienlijk verschillende HRM-curven met delta F's groter dan 05 bij temperaturen van respectievelijk 90 tot 92 graden Celsius en 81,5 tot 83,5 graden Celsius. Het mutatietype en de positie op de genen van 4, 560 M2 zaailingen werden bevestigd door de sequencing chromatogrammen. Een heterozygoot met een mutatie van G naar A op 4, 304 basisparen van OsLCT1 werd geïdentificeerd.
Een enkele nucleotide Een invoeging verscheen op de 4, 240 basisparen van OsLCT1, en een TTC trinucleotide verwijdering werd waargenomen op de positie van 5, 948 tot 5, 950 basisparen van SPDT. Ik optimaliseer de PCR voor HRM analyse. De kleurstof in de gel is een beetje schadelijk.
Vergeet niet om handschoenen aan te trekken bij het uitvoeren van de gel.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presente করে een protocol voor Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) op basis van high-resolution melting analyse (HRM). Deze methode is effectief voor high-throughput screening van insertie/deletie (Indel) en single base substitution (SBS) mutaties.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Genomics
- Plantenveredeling
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- High-resolution melting analyse is een techniek die wordt gebruikt om genetische variaties te detecteren.
- TILLING maakt de identificatie van mutaties op een kosteneffectieve manier mogelijk.
- Deze methode is bijzonder nuttig voor eigenschappen die moeilijk te beoordelen zijn.
- Het kan worden toegepast in diverse vakgebieden, waaronder de landbouw en de genetica.
Doel van de studie
- Om een protocol te bieden voor het gebruik van HRM bij TILLING.
- Om high-throughput screening van genetische variaties te faciliteren.
- Om de efficiëntie van het identificeren van mutaties gerelateerd aan belangrijke eigenschappen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van bladschijfjes in een 96-well PCR-plaat.
- Toevoeging van buffer A-oplossing aan elke well.
- Invriezen en ontdooien van de PCR-plaat ter voorbereiding van de monsters.
- Monitoren van fluorescentieveranderingen tijdens het smelten van DNA.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt effectieve detectie van Indels en SBS mogelijk.
- High-throughput-capaciteit verhoogt de screeningsefficiëntie.
- Kosteneffectieve methode die geschikt is voor diverse onderzoeksapplicaties.
- Faciliteert veredeling voor eigenschappen zoals ziekteresistentie.
Conclusies
- HRM-gebaseerde TILLING is een waardevolle tool in genetisch onderzoek.
- De methode vereenvoudigt het proces van het identificeren van mutaties.
- Het kan aanzienlijk bijdragen aan de ontwikkeling van verbeterde plantenvariëteiten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
TILLING op basis van high-resolution melting (HRM) maakt hoogdoorvoer- en kostenefficiënte detectie mogelijk van zowel enkelvoudige basissubstituties als insertie/deletie-mutaties in plantgenomen. Deze benadering ondersteunt de validatie van targets in een vroeg stadium door kwantitatieve screeningsgegevens van mutaties te leveren, die de basis vormen voor veredelingsbeslissingen voor complexe eigenschappen zoals ziekteresistentie en nutriëntengehalte. De integratie met eenvoudige DNA-extractie verbetert de efficiëntie van de workflow in ontdekkingspipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het detecteren van geïnduceerde mutaties in doelgenen zoals OsLCT1 en SPDT.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van HRM-analyse na PCR zonder aanvullende verwerking, waardoor de handmatige tijd wordt verminderd en de doorvoersnelheid wordt verhoogd.
- Voorspellende waarde: Delta F-waarden boven 0,5 identificeren mutante monsters, wat zorgt voor een betrouwbare selectie van hits voor downstream validatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: HRM-compatibele platen met een overlay van minerale olie voorkomen verdamping en waarborgen een reproduceerbare acquisitie van de smeltcurve.
- Kwantitatieve output: Genormaliseerde smeltcurves en delta F-metingen maken een objectieve vergelijking tussen wild-type en variant-monsters mogelijk.
- Schaalbaarheid: Het format van een 96-wells plaat maakt het mogelijk om duizenden M2-zaailingen te screenen, zoals aangetoond met 4.560 monsters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Bevestigde mutaties via Sanger-sequencing leveren moleculaire laesiegegevens die het genotype aan het fenotype koppelen in veredelingsprogramma's.
- Afstemming van Biomarkers: Geïdentificeerde SNP's en indels dienen als detecteerbare markers voor kenmerkassociatie bij gewasverbetering.
- Risicoreductie: Vroege detectie van mutaties vermindert onzekerheid over de overerving van kenmerken voorafgaand aan veldproeven.
Integratie van Pipeline & Workflow
HRM-TILLING past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase door mutatiescreening mogelijk te maken na mutagenese en voorafgaand aan fenotypische validatie, wat de identificatie van lead-kandidaten in de agrarische biotechnologie ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door het identificeren van allelische varianten in doelgenen via gevoelige smeltcurve-analyse.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve HRM-resultaten die mutatiedetectie standaardiseren over grote populaties.
- Analytics: De Delta F-drempelwaarde (>0.5) biedt een statistische basis om mutantmonsters van wild-type monsters te onderscheiden.
- Translationeel onderzoek: Door sequencing bevestigde mutaties maken genotype-fenotype mapping mogelijk voor kweekbeslissingen gekoppeld aan specifieke kenmerken.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Het protocol is aanpasbaar aan verschillende doelgenen en gewassoorten buiten rijst, wat hergebruik van het platform bevordert.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Detecteert zowel SNP's als indels met een hoge gevoeligheid, waardoor het aantal fout-negatieven bij mutatiescreening wordt verminderd.
- Operationele waarde: Eenvoudige, veilige en snelle (SSF) DNA-extractie in combinatie met HRM minimaliseert het gebruik van reagentia en de behoefte aan apparatuur.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk in veredelingsprogramma's door nuttige allelische varianten snel te identificeren.
- Impact op de portfolio: Verhoogt het vertrouwen bij het verder brengen van lijnen met gevalideerde mutaties, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
Overwegingen voor implementatie
- Kennis van de instelling van het HRM-instrument en de normalisatie van de smeltcurve is vereist.
- Toegang tot gradiënt-thermocyclers is nodig voor de optimalisatie van de annealingtemperatuur.
- Afhankelijk van HRM-compatibele platen en fluorescentiekleuren voor een nauwkeurige smeltanalyse.
- Sequentiecapaciteit is vereist om de via HRM geïdentificeerde mutaties te bevestigen.
- De prestaties kunnen variëren afhankelijk van de ampliconlengte en het GC-gehalte, waardoor doelspecifieke optimalisatie noodzakelijk is.
