Cortisol extractie van Sturgeon Fin en Jawbone matrices
10 september 2019
In deze studie presenteren we een protocol voor cortisol extractie uit de Fin en kaakbeen van steursoorten. De cortisol spiegels van Fin en Jawbone werden verder onderzocht door twee wasoplosmiddelen te vergelijken, gevolgd door ELISA-assays. Deze studie bestuurde de haalbaarheid van Jawbone cortisol als een nieuwe stress-indicator.
Onze methode introduceert een nieuwe alternatieve stress-indicator die een platform zou kunnen zijn voor tal van toekomstige studies voor het meten van cortisol in nieuwe niet-plot- en haarmatrices. De voordelen van deze techniek zijn de eenvoud en het vermogen om te worden gebruikt om stress niveaus te evalueren, zelfs bij geslachte dieren. Het vaststellen van een relatie tussen hoge cortisolniveaus en gezonde dieren of mensen met behulp van deze techniek kan helpen bij de diagnose van sommige ziekten.
Deze methode kan ook worden gebruikt om eeuwenoude biologische monsters zoals deze oude fossielen te bestuderen om stressniveaus binnen de levensduur van het monster te evalueren. Voor cortisol extractie, wegen 300 plus of min 10 milligram van elk monster op een digitale analytische schaal met een 0,0001 nauwkeurigheid voor het plaatsen van de monsters in individuele 15 milliliter conische buizen. Voeg drie milliliter isopropanol toe aan elke monsterbuis en draai de buizen gedurende 2,5 minuten met 80 rotaties per minuut om de cortisol uit te wassen en eventuele externe verontreiniging te verwijderen.
Na de laatste wasbeurt droogt de lucht de monsters zeven dagen op kamertemperatuur voordat de monsters nog drie keer worden gewassen, zoals aangetoond met vers ultrazuiver water voor elke wasbeurt. Weeg 75 plus of min vijf milligram gedroogd vin- of kaakbeenmonster af en gebruik een kraalklopper om het monster uiteindelijk 32 minuten op 50 hertz te malen. Lever vervolgens 1,5 milliliter methanol aan elke buis van poedervin of kaakbeen en plaats de monsters op een buisrotator op 40 rotaties per minuut gedurende 18 uur bij kamertemperatuur.
Na cortisolextractie, sediment de monsterweefsels door centrifugatie. En breng de bovenste milliliter van de gelige, organische cortisol met laag van elk monster in individuele 1,5 milliliter microcentrifuged buizen. Droog de cortisolmonsters bij 38 graden Celsius 's nachts in een rookkap om de methanol te verdampen.
De volgende ochtend, voeg 400 microliters van PBS aan elke buis en vortex en centrifuge de monsters om de cortisol te verzamelen. Voor ELISA-analyse, laad 25 microliter van elk geëxtraheerd standaard cortisol monster en controle in dubbele in de juiste putten van een 96 goed ELISA plaat. Laad 25 microliter van Assay verdunningsmiddel in twee putten om te dienen als de nul en in elke niet-specifieke binding goed.
Meng 15 microliters enzymconjugaat met 24 milliliter Assay verdunningsmluend en voeg 200 microliter conjugaat toe aan elke put. Meng de plaat vijf minuten op een rotator bij 500 rotaties per minuut. Gevolgd door een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.
Aan het einde van de incubatie was de plaat vier keer met 300 microliters van 1x Wasbuffer per put. Snel omkeren van de plaat over de gootsteen na elke wasbeurt om de buffer te ontdoen en blotting de plaat op een stapel papieren handdoeken. Voeg na de laatste wasbeurt 200 microliter TMB-substraatoplossing toe aan elke put en plaats de plaat gedurende vijf minuten op de rotator bij 500 rotaties per minuut.
Na het mengen, incubeer de plaat gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Voeg aan het einde van de incubatie 50 microliter stopoplossing toe aan elke put. En meng de inhoud van de plaat op de rotator gedurende drie minuten bij 500 rotaties per minuut of totdat alle putten zijn veranderd van groen naar geel.
Lees vervolgens de optische dichtheid van de monsters en gebruik de microplaatsoftware om de cortisolniveaus in elk monster om te zetten in picogrammen per milligram. In deze representatieve analyse waren de cortisolgehalten meestal hoger bij vinmonsters die met isopropanol werden gewassen dan in die welke met water werden gewassen, maar er werden geen significante verschillen in fin cortisolgehaltes waargenomen bij steursoorten. Er was geen significante interactie tussen het wassen van oplosmiddelen en steursoorten.
Onderzoek van cortisol van H.Huso kaakbeenderen om te bepalen of steur kaakbeenderen kunnen worden gebruikt als een alternatieve matrix voor vinnen bleek dat het wasoplosmiddel had geen significant effect op de cortisol niveau gemeten in h.Huso's steur. Verder, de gegevens bleek een hoge gelijkenis tussen de vinnen van drie steur soorten getest en in H.Huso kaakbeenderen. Het is belangrijk om de kraalklopper te gebruiken om de monsters in fijn poeder te malen en een geschikte commerciële ELISA Assay Kit te gebruiken voor een succesvolle cortisolmeting.
Deze methode kan ook worden gebruikt voor het opsporen van cortisol in tanden en andere harde matrices als cortisol niveau metingen bieden belangrijke informatie over hoe het milieu van invloed op de dierbiologie. De methode kan worden gebruikt als een nieuwe benadering voor de beoordeling van cortisol niveaus in menselijke kindermelk tanden en in pediatrische endocrinologie, psycho biologie, gedrags-, archeologische en forensische studies.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor de extractie van cortisol uit de vin en het kaakbot van steursoorten, waarbij de effectiviteit van twee wasoplosmiddelen wordt onderzocht, gevolgd door ELISA-assays. Het onderzoek benadrukt het potentieel van cortisol in het kaakbot als een nieuwe stressindicator.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
Achtergrond
- Cortisol is een belangrijk stresshormoon.
- Traditionele methoden voor het meten van cortisol kunnen invasief zijn.
- Het verkennen van alternatieve matrices voor cortisolmeting is essentieel.
- Cortisol in het kaakbot is nog niet uitgebreid bestudeerd als stressindicator.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor de extractie van cortisol uit de vin en het kaakbeen van steur.
- Het evalueren van de haalbaarheid van cortisol in het kaakbeen als stressindicator.
- Het vergelijken van de effectiviteit van verschillende wasoplosmiddelen bij de extractie van cortisol.
Gebruikte methoden
- Monsters van de vin en het kaakbeen werden verzameld van steursoorten.
- De extractie van cortisol omvatte het wegen van de monsters en het gebruik van isopropanol als wassolvent.
- Er werden ELISA-assays uitgevoerd om de cortisolspiegels te meten.
- Er werd een vergelijkende analyse van de wassolventen uitgevoerd.
Belangrijkste resultaten
- Cortisolgehaltes in het kaakbot zijn succesvol geëxtraheerd en gemeten.
- Verschillende wassolventen vertoonden een variërende effectiviteit bij de extractie van cortisol.
- De studie ondersteunt het potentieel van cortisol in het kaakbot als stressindicator.
- Deze methode zou toekomstig onderzoek naar stress in diverse biologische monsters kunnen faciliteren.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is een eenvoudige en effectieve methode voor de extractie van cortisol.
- Cortisol in de kaak kan dienen als een betrouwbare stressindicator in onderzoek.
- Deze techniek opent mogelijkheden voor het bestuderen van stress in zowel hedendaagse als oude biologische monsters.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze studie stelt een non-invasief cortisol-extractieprotocol vast vanuit vinnen- en kaakbotmatrices van steur, wat een nieuwe stressindicator biedt voor preklinisch en translationeel onderzoek. De methode maakt stressbiomarker-beoordeling mogelijk in gearchiveerde en geslachte monsters, wat longitudinale en cross-species studies ondersteunt. De eenvoud en aanpasbaarheid aan harde weefsels bieden strategische waarde voor het verminderen van risico's bij de validatie van targets in neuro-endocriene en gedragsmatige ontdekkingspipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar stress-responspaden mogelijk via cortisol als functionele biomarker in gewervde modellen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare extractieworkflow voor vinn- en kaakweefsels met behulp van gestandaardiseerde oplosmiddelwasbeurten en homogenisatie op basis van beads.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt target de-risking door cortisolniveaus te correleren met fenotypische stresstoestanden in preklinische modellen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve cortisolmetingen via ELISA die compatibel zijn met high-throughput screening van omgevings- of genetische modulatoren.
- Operationele waarde: Toont een lage intra- en inter-assay variabiliteit aan (14,15% en 7,70% CV), wat de betrouwbaarheid van de assay waarborgt voor screeningcampagnes van verbindingen.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van een minimale monstermassa (300 ± 10 mg) en standaard laboratoriumapparatuur, waardoor aanpassing naar multi-well formats mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Cortisol in het kaakbeen is veelbelovend als cross-matrix biomarker, waardoor correlatie mogelijk is tussen stressreacties in vinstructuren en skeletweefsel.
- Relevantie van preklinische modellen: Toepasbaar op zebravis, knaagdieren en andere vertebratemodellen waarbij vin- of schedelbotmatrices toegankelijk zijn.
- Nut van archiefmonsters: Maakt analyse van stressbiomarkers in historische of gefossiliseerde monsters mogelijk, ter ondersteuning van evolutionaire en developmental toxicology-studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van discovery tot prekliniek door een stressbiomarker-uitlezing te bieden die inzicht geeft in target-engagement en de resultaten van fenotypische screening.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing van neuroendocriene targets door cortisol te kwantificeren als een downstream effector van HPA-asmodulatie.
- Screening: Levert ELISA-compatibele cortisolmetingen die dosis-responsanalyse in compound-bibliotheken mogelijk maken.
- Analytics: Levert cortisolconcentraties (pg/mg) op die geschikt zijn voor statistische vergelijking tussen behandelingsgroepen met behulp van GLM of soortgelijke modellen.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt biomarker-continuïteit van discovery-specimens naar preklinische weefsels via cross-matrix validatie in vinnen en kaakbot.
- Enterprise Reuse: Het protocol vereist weinig reagentia en apparatuur, wat standaardisatie tussen locaties mogelijk maakt voor biomarkerprogramma's met meerdere studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van stressgerelateerde targets door directe hormoonmeting mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van toegankelijke oplosmiddelen (water, isopropanol, methanol) en standaard laboratoriumapparatuur (centrifuge, rotator, ELISA-lezer).
- Strategische waarde: Maakt eerdere go/no-go-beslissingen mogelijk door target-gerelateerde stressfenotypes te identificeren vóór de functionele assays.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets met een aangetoonde modulatie van de cortisolrespons in vivo.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefselhomogenisatie, extractie op basis van oplosmiddelen en het uitvoeren van ELISA-assays.
- Afhankelijk van toegang tot een centrifuge, buizenrotator, bead beater en een microplaatlezer met temperatuurregeling.
- Vereist standaardisatie van de keuze van het wasoplosmiddel en de droogtijd tussen laboratoria voor vergelijkbaarheid tussen studies.
- Aanpassing aan andere soorten of weefsels kan optimalisatie van de monstermassa en extractietijd vereisen.
- Beperkt door de specificiteit van de ELISA-antilichamen en potentiële matrixeffecten in sterk gemineraliseerde monsters zoals kaakbot.
