Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Het is moeilijk om het stadium van de gastheerinfectie van T.cruzi te gebruiken in experimenten omdat amastigote een obligate intracellulaire parasiet is. Onze kweektechniek stelt de amastigote in staat om tijdelijk buiten de gastheercel te repliceren, zodat we direct experimenten kunnen uitvoeren op dit klinisch relevante stadium van de parasiet. Het aantonen van de procedure zal Yukie Akutsu, een technicus van ons instituut.

Behoud een gastheer parasiet co-cultuur volgens het manuscript richtingen. Wanneer de Cas9-uitdrukkende parasiet klaar is voor differentiatie, verzamel je de supernatant in een conische buis en controleer je op monsterkwaliteit onder een microscoop. Als er een aanzienlijk aantal extracellulaire amastigotes is, voert u een zwemprocedure uit om de trypomastigotes te isoleren.

Spin vaststelling van het mengsel van trypomastigotes en amastigotes gedurende vijftien minuten als 2, 100 keer G.Dan gooi het grootste deel van de supernatant, waardoor 0,5 tot 1 milliliter medium in de buis. Sluit de buis losjes af en broed de pellet één tot twee uur uit op 37 graden Celsius, waardoor de actieve trypomastigotes uit de pellet kunnen zwemmen. Breng na de incubatie de supernatant met de trypomastigotes over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Draai het naar beneden, en resuspend de pellet met 5 milliliter DMEM. Breng de parasiet over naar een T-25-kweekkolf en kweek de kolf bij 37 graden Celsius onder 5% kooldioxide in een bevochtigde couveuse. Ongeveer 95% van de parasieten zal zich na 24 uur onderscheiden in amastigotes.

Centrifuge de cultuur van extracellulaire amastigotes gedurende 15 minuten op 2, 100 keer G, en gooi de supernatant. Resuspend de pellet met elektroporatie buffer met verstrekte aanvulling oplossing voor een uiteindelijke celdichtheid van een keer 10 tot de 8e cellen per milliliter. Aliquot 100 microliters van de geresuspended parasieten in 1.5 liter microcentrifuge buizen.

Voeg vervolgens vijf tot 10 microgram Guide RNA toe en meng voorzichtig door pipetting. Breng het mengsel naar een twee millimeter gap elektroporatie cuvette, en breng een puls met de elektroporatie-apparaat. Breng vervolgens de cuvetteinhoud over in een T-25-kolf, met vijf milliliter voorverwarmd LIT-medium, laat de dop los en broed de kolf uit bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide.

Monitor de celgroei door voortzetting van axenic kweken of als intracellulaire amastigotes na gastheercelinfectie. Als u de celgroei als axenische amastigotes controleert, schudt u voorzichtig de kolf om de extracellulaire amastigotes in de oplossing te resuspend en meng 20 microliters van de cultuur met één microliter propidiumjodideoplossing in een microcentrifugebuis. Het is belangrijk om de kweekfles niet langer buiten de couveuse te laten staan, omdat de temperatuur een van de factoren is die de bijlproliferatie van amastigote mogelijk maakt.

Breng het monster op een hemocytometer, en observeer het onder een fluorescentie microscoop. Tel dan het aantal levensvatbare amastigotes die niet gekleurd zijn door propidium jodide. Om de groei van knock-outcellen als intracellulaire amastigotes te monitoren, host zaad 3T3-cellen in een 12-put plaat met DMEM.

Een dag na elektroporatie verzamelen de knock-out amastigotes door centrifugatie, gooi de supernatant, en resuspend de parasieten met twee milliliters DMEM. Verwijder het medium uit de gastheercelcultuur en voeg de geresuspendeerde amastigotes toe. Broed de plaat twee dagen lang uit op 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide, waardoor de amastigotes een infectie kunnen vaststellen.

Na de twee dagen, was weg de extracellulaire amastigotes buiten gastheercellen met DMEM, en voeg verse DMEM. Ga nog twee dagen door met de incubatie en visualiseer vervolgens de kernen van de gastheercellen en de intracellulaire amastigotes. Het is aangetoond dat T.Cruzi amastigotes getransfecteerd met Guide RNA tegen het essentiële gen TcCGM1 tonen een aanzienlijke groei defect in vergelijking met een controlegroep.

Bij het monitoren van de groei als intracellulaire amastigotes, de fractie van de gastheer kernen geassocieerd met T.Cruzi kernen is aanzienlijk lager in de TcCGM1 knock-out groep in vergelijking met de controle. Integendeel, transfectie van Gids RNA tegen een van paraflagellar staafeiwitten TcPAR1 heeft geen significante invloed op de celgroei na vier dagen van axenicculuring of remt de groei van intracellulaire amastigotes. Echter, vijf dagen na infectie, het aantal trypomastigotes die ontstaan uit de gastheer cel is aanzienlijk lager in TcPAR1 knock-out co-cultuur in vergelijking met de controle co-cultuur.

Bovendien bleken de gedifferentieerde trypomastigotes in de hostcel in de controlegroep actiever dan die in de knock-outgroep. Deze methode kan ook worden gebruikt om de effecten van exogene genen op amastigote stadium te bestuderen in plaats van Gids RNA transfecteren in Cas9-uitdrukkende amastigote, u het plasmid transfecteren in een wild-type amastigote om een exogene gen uit te drukken.