Een robuuste polymerase kettingreactie op basis van Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide herhalingen in fragiele X mentale retardatie-1 gen

Deze kosteneffectieve methode kan brede toepassingen vinden in moleculaire diagnose en screening van FXS en Fragile X-gerelateerde aandoeningen. Het is snel in doorlooptijd en minder investeringen in apparatuur. Onze pcr-gebaseerde test kan de classificatie van het volledige spectrum van de FXS en Fragile X-geassocieerde aandoeningen vergemakkelijken, inclusief tussenliggende, premutatie en volledige mutatie met robuustheid en snelle rapportagetijd.

De procedure zal worden aangetoond door Weng Chua uit PerkinElmer Singapore. Begin met het verwijderen van de PCR buffer mix, monster verdunningsbedunning, en DNA-monsters uit de 20 graden Celsius vriezer, en laat ze op kamertemperatuur voor 20 tot 30 minuten te ontdooien. Voorafgaand aan het gebruik van de reagentia, vortex en kort draai ze naar beneden.

Meet de concentratie van het DNA-monster met een spectrofotometer en verdun deze indien nodig tot 25 nanogram per microliter met monsterverdunningsstof. Label de putten van een PCR-plaat om referentie- en geteste DNA-monsters te identificeren en het aantal reacties te berekenen dat nodig is voor de test-, referentie- en negatieve controlemonsters. Bereid de PCR master mix door het combineren van 15 microliters van PCR buffer mix tot 0,6 microliter monster verdunningsproducten en 0,4 microliter polymerase voor elke reactie.

Vortex de mix en draai het naar beneden. Dan afzien van 18 microliter van het mengsel in elke put. Dan pipette twee microliters van elk DNA in de juiste put.

Meng de reagentia door vijf keer op en neer te pipetten en sluit de plaat af. Plaats de plaat in de thermocycler en voer de PCR volgens de handschriftaanwijzing. Verwarm de incubatorshaker voor op 65 graden Celsius en voeg 80 microliter 1x TE-buffer toe aan elk PCR-product.

Gebruik een multichannel pipet om de monsters over te zetten naar een PCR opschoning plaat en zet de plaat in de shaker. Incubeer het bij 65 graden Celsius terwijl het schudden bij 1200 RPM gedurende 10 minuten. Na de incubatie koelt u de incubatorshaker af tot 25 graden Celsius, stelt u het vacuüminstrument op 250 millibar en zuigt u de oplossing door het filter.

Na 15 minuten mogen de putten geen vloeistof meer hebben. Schakel het vacuüm uit en voeg 50 microliters 1X TE-buffer toe aan elke put. De oplossing gedurende 10 minuten aanzuigen met behulp van de vorige vacuüminstellingen.

Droog de onderkant van de filterplaat door het stevig op een stapel papieren handdoeken te drukken en voeg vervolgens 20 microliter van 1X TE-buffer toe aan het onderste midden van elke put. Plaats de plaat in de shaker en incubbateren op 25 graden Celsius tijdens het schudden op 1200 RPM gedurende vijf minuten. Breng na de incubatie minstens 15 microliter van het gezuiverde PCR-product over op een verse 96 put PCR-plaat.

Breng voor aanvang het DNA-kleurconcentraat, DNA-gelmatrix, DNA-marker, DNA-ladder en gezuiverde DNA-monsters naar kamertemperatuur. Stel het primingstation in door de spuit te vervangen en de bodemplaat aan te passen, laat vervolgens de hendel van de spuitclip los en schuif deze naar de bovenste positie. Start de maatsoftware en bereid de gelverfmix voor.

Vortex de kleurstof concentreren voor 10 seconden, dan draai het naar beneden. Voeg vervolgens 25 microliter van de kleurstof toe aan een gelmatrix flacon en vortex de oplossing om te mengen. Breng de gelverfmix over op een spinfilter, plaats het in de centrifuge en draai deze 10 minuten op 1500 keer g.

Wanneer u klaar bent om de gelverfmix te laden, plaatst u een nieuwe DNA-chip in het primingstation en voegt u negen microliters van de gelkleurstofmix toe in de put die is gemarkeerd met G.Sluit het primingstation en zorg ervoor dat de zuiger op het merk van één milliliter wordt geplaatst. Druk de spuitzuiger naar beneden totdat deze door de clip wordt vastgehouden. Wacht precies 30 seconden en laat de clip los.

Wacht nog vijf seconden, en trek dan langzaam de zuiger terug naar de een milliliter positie. Open het priming station en voeg negen microliters van gel kleurstof mix in de putten gemarkeerd met G.Voeg vijf microliters van marker in de put gemarkeerd met een ladder symbool en elk van de 12 monster putten. Voeg een microliter van de ladder aan de put met de ladder symbool en een microliter van het PCR-product of water aan de monster putten.

Vortex de chip voor een minuut op 2400 RPM. Steek het in de bioanalyzer en voer de chip binnen vijf minuten. Wanneer de run is voltooid, exporteert u de piekgegevens als csv-tabelbestanden.

Een premutatie vrouwelijk monster en een volledige mutatie vrouwelijk monster worden gebruikt als referentiemonsters. Een bovenste en onderste marker piek zijn opgenomen in het fragment grootte profiel, en er is meestal een primer complexe piek op ongeveer 95 basisparen. Deze referentiemonsters worden gebruikt om een regressiestandaardcurve te maken.

De lineaire regressiestandaardcurve wordt vervolgens gebruikt om herhalingsgroottes van onbekende monsters te berekenen. Klinische normale, intermediaire, premutatie, volledige mutatie, en mozaïek volledige mutatie monsters kunnen correct worden ingedeeld met deze methode. In sommige gevallen wordt slechts één piek weergegeven in de microfluïde elektroforeseresultaten, wat waarschijnlijk te wijten is aan de aanwezigheid van normale homozygoot allelen.

Een type suboptimaal resultaat is baseline bias, die dubbelzinnig of oninterpreteerbaar kan zijn, en wordt vermoed dat wordt veroorzaakt door instrument storing. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de juiste hoeveelheid DNA en kwaliteit te garanderen voordat u met het protocol begint. FMR1-gensequencing kan worden uitgevoerd om het AGG-onderbrekingspatroon te identificeren.

En methylatie-gevoelige beperking enzym of bisulfide modificatie test kan worden gebruikt om de methylatie status te controleren. Dit is een snelle, robuuste en kosteneffectieve techniek. Het zal andere onderzoekers helpen bij het uitvoeren van een populatie-gebaseerde studie over de drager status van FXS en Fragile X-geassocieerde aandoeningen.