Name: Het uitvoeren van menselijke skeletspieren xenografts in Immunodeficiënte muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Ontdek een chirurgisch protocol voor menselijke skeletspierxenotransplantaties in immunodeficiënte muizen. Deze methode maakt in vivo modellering van spierziekten en preklinische therapietests mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de myositis Association en de Peter Buck Foundation. We willen Dr. yuanfan Zhang graag bedanken voor het delen van haar expertise en training in de xenotransplantaatmodellen is chirurgische techniek.

Alle gebruik van onderzoeksspecimens van menselijke proefpersonen werd goedgekeurd door de Johns Hopkins institutioneel Review Board (IRB) om de rechten en het welzijn van de deelnemers te beschermen. Alle dier experimenten werden goedgekeurd door het Comité voor de instelling van het Instituut voor dierenverzorging en-gebruik (IACUC) van de Johns Hopkins University in overeenstemming met de gids van de National Institutes of Health (NIH) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Mannelijke NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) host muizen (8-12 weken oud) worden gebruikt om xenotransplantaatmodellen is experimenten uit te voeren. Deze muizen zijn ondergebracht in geventileerde racks en krijgen HEPA-gefilterd, getemperd en bevoficeerde lucht evenals omgekeerde osmose gefilterd hyperchloorwater. Muizen zijn voorzien van water en een bestraald antibioticum dieet (tabel van materialen) ad libitum, en de faciliteit biedt 14 h van licht tot 10 h van donker, zoals bepaald door de centrale timer.
1. voorbereiding van de apparatuur
<ol><li>Verwerven NOD-Rag1NullIL2r γNull (NRG) muizen, 8-12 weken oud.</li>
	<li>Autoclaaf chirurgische uitrusting: schaar, Tang, naald houder, chirurgische nietmachine (tabel van materialen), wond klemmen, chirurgische doekjes (tabel van materialen) en bekerglas (Figuur 1a).</li>
	<li>Bereid 50 mL spier media (20% foetaal runderserum, 2% kuiken embryo extract, 1% antibioticum/antimycotic in Hams F10 medium). Houd alle chemicaliën/geneesmiddelen/oplossingen die worden gebruikt voor chirurgie bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld in het protocol.</li>
	<li>Bereid een 1 mL spuit met een 26 G naald die 3/8 inches lang met 2 mg/mL analgetische (tabel van materialen), en plaats op ijs. Het analgeticum kan worden verdund tot de juiste concentratie met behulp van steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
</ol>2. chirurgische voorbereiding
<ol><li>Verkrijgen van een menselijke spier biopsie onder een IRB-goedgekeurd Protocol van patiënten wier spieren sterkte weergeven > 4-/5 op de MRC (Medical Research Council) schaal12. Plaats het onderzoeksmodel in een 100 mm x 15 mm Petri schaaltje met spier media. Opmerking: De MRC schaal wordt gebruikt in de klinische praktijk als een beoordeling van spierkracht met 0 tonen geen contractie, 5 tonen normale kracht, en 4 (4-tot 4 +) tonen beweging tegen weerstand12. We hebben geconstateerd dat spieren met milde tot matige zwakte (MRC > 4-/5) meestal ziekte pathologie vertonen maar niet uitgebreid worden vervangen door vetweefsel of fibrose, die beide xenotransplantaat regeneratie belemmeren. In het geval van autopsie weefsel waar een recente MRC-score niet beschikbaar is, kan de spier kwaliteit worden benaderd via bruto observatie. Spier biopsieën die lichtroze in het uiterlijk of hebben grote gebieden van vetweefsel zijn niet waarschijnlijk xenotransplantaatmodellen is met succes.</li>
	<li>Verwijder eventueel overgebleven fascia-of vetweefsel uit het preparaat met chirurgische schaar met behulp van een stereomicroscoop en lichtbron om visualisatie te helpen.</li>
	<li>Ontleden de spier biopsie in ongeveer 7 mm x 3 mm x 3 mm stukken met chirurgische schaar met behulp van de stereomicroscoop en een lichtbron. Zorg ervoor dat de vezels in de lengterichting binnen het preparaat zijn gerangschikt.</li>
	<li>Plaats de Petri schaal met ontleed spier op ijs. Gemiddeld worden de xenotransplantaten gedurende 4 uur in de media bewaard terwijl er operaties worden uitgevoerd. Echter, biopsieën zijn opgeslagen in de media voor 24 h voorafgaand aan xenografting, en deze vertraging leek niet te negatief beïnvloeden transplantatie of regeneratie.</li>
	<li>Plaats synthetische, niet-absorbabele hechtingen (tabel met materialen) in een 100 mm x 15 mm Petri schaaltje met 70% ethanol.</li>
	<li>Opzetten van een dubbele procedure anesthesie circuit: regelen de mapleson E ademhaling circuit op de stereomicroscoop en plaats de inductie kamer in een bioveiligheid Cabinet (Figuur 1a,B).</li>
	<li>Haal het gewicht van de NRG-muis door in een autoclaaf bekerglas op een weegschaal te plaatsen en over te brengen naar de inductie kamer. Induceren van anesthesie onder 3% isoflurane. Zodra de juiste verdoving diepte wordt bereikt-zoals beoordeeld door observatie van de ademhalingsfrequentie, spierontspanning, en gebrek aan vrijwillige beweging-verminderen van de instelling van de verdamper 1,5% voor de rest van de operatie.</li>
	<li>Breng de muis van de inductie kamer naar de Mapleson E ademhaling circuit en breng oogheelkundige zalf op de ogen.</li>
	<li>Verwijder het haar boven de tibialis voorste (TA) van enkel naar knie met een trimmer, gevolgd door een 1 min behandeling met ontharing lotion (tabel van materialen) (Figuur 2a).</li>
	<li>Desinfecteer de operatieplaats door de poot met Povidon-jodiumoplossing te Zwaben. Spoel dan de overgebleven Povidon-jodium weg met 70% ethanol.</li>
	<li>Injecteer de muis subcutaan met analgeticum, zoals carprofen (tabel met materialen) in een dosis van 5 mg/kg.</li>
</ol>3. xenotransplantaat chirurgie
<ol><li>Tape langs het been en maak een rechte incisie over de tibilalis voorste (TA) spier met een schaar en Iris Tang van oorsprong uit de distale pezen en eindigen onder de knie (Figuur 2b).</li>
	<li>Scheid de huid van de spier met behulp van botte dissectie met chirurgische schaar.</li>
	<li>Snijd door de epimysium van de TA-spier met een schaar beginnend bij de pees en eindigend bij de knie. Opmerking: Dit is een zeer oppervlakkige snede (minder dan 0,5 mm; Figuur 2b, zwarte onderbroken lijn), en de onderliggende ta mag niet worden beschadigd in het proces, omdat dit zou verwijdering moeilijker te maken. Wanneer correct uitgevoerd, de spiervezels zal zichtbaar ontspannen.</li>
	<li>Snijd de distale pees van de TA met een schaar, pak de pees met de Iris Tang en trek de TA omhoog naar de knie (figuur 2c).</li>
	<li>Snijd de distale pees van de extensor digitorum Longus (EDL) met een schaar en trek de EDL omhoog naar de knie (figuur 2D). Zodra de proximale pees van de peroneus longus (PL) spier zichtbaar is, verwijder de EDL met een schaar (figuur 2D, groene stippellijn).</li>
	<li>Verwijder de TA met een schaar (figuur 2D, blauwe stippellijn) en gebruik een chirurgische veeg BEVOCHTIGD met PBS en lichte druk om hemostase te bereiken (figuur 2e).</li>
	<li>Rijg een hechtdraad door proximale peroneus longus (PL) pees en trim, waardoor ongeveer 1,5 inch draad aan weerszijden van de pees (figuur 2F).</li>
	<li>Voer de eerste helft van een twee-hand chirurgische vierkante knoop, maar niet aan te scherpen: dit zal een cirkel vormen. Plaats een xenotransplantaatmodellen is in deze cirkel en draai de lus aan om de xenotransplantaatmodellen is te beveiligen. Voltooi de andere helft van de vierkante knoop (figuur 2g,H). Dit zal de xenotransplantaatmodellen is aan de proximale pees van de PL hecht.</li>
	<li>Draad hechting door distale pl pees en herhaal de vierkante knoop techniek uit stap 3,8 om de xenotransplantaatmodellen is aan de distale pees te binden (figuur 2H,I). Opmerking: De mediale tarsale slagader en ader kunnen dicht bij of bovenop de distale pees van de PL liggen. Plaats geen hechtingen door of rond deze vaten. Het is gemakkelijk te zien of een hechtdraad verkeerd is geplaatst als schepen zullen blancheer of bloeden. Als dit gebeurt, verwijdert u de hechting en plaatst u deze op een andere locatie.</li>
	<li>Trek de huid over xenografted spier, Seal met chirurgische lijm, en plaats 2-3 chirurgische nieten over de incisie (figuur 2J).</li>
	<li>Plaats de muis in een schone kooi op een verwarmde pad om te herstellen. Monitor de muis tot volledig bewust en periodiek in de komende dagen op tekenen van lokale systemische infectie en om ervoor te zorgen dat de operatieplaats niet heropend is. Opmerking: Een enkelvoudige dosis analgeticum zoals beschreven in stap 2,11 is meestal voldoende voor pijnbestrijding. Echter, de muizen moeten ook worden gecontroleerd op aanhoudende pijn (bijvoorbeeld kreupelheid, gegolfde vacht, gejakte houding), en, indien nodig, opnieuw gedoseerd met analgeticum bij 24 h post-operatief.</li>
</ol>4. xenograft collectie
Opmerking: Xenografts worden meestal verzameld tussen 4 tot 6 maanden na de operatie. Echter, collecties zijn uitgevoerd tot 12 maanden na de operatie.
<ol><li>Plaats een afgedekt bekerglas met 200 ml 2-methylbutaan in een doos met droogijs gedurende minimaal 30 minuten voor de verzameling van xenotransplantaatmodellen is.</li>
	<li>Induceren van anesthesie onder 3% Isofluraan in inductie kamer. Zodra de juiste verdovings diepte is bereikt, verlaagt u de instelling van de verdamper tot 1,5% voor de rest van de operatie.</li>
	<li>Breng de muis over van de inductie kamer naar het Ademhalings circuit Mapleson E, gerangschikt op een stereomicroscoop.</li>
	<li>Verwijder het haar boven de tibialis voorste van enkel naar knie met een trimmer en ontharing lotion. De hechtingen die de xenotransplantaatmodellen is op zijn plaats houden, kunnen door de huid worden gezien (Figuur 3a).</li>
	<li>Plak het been omlaag en gebruik de schaar en de Iris tang om de huid over de xenotransplantaatmodellen is te openen totdat beide hechtingen zichtbaar zijn (Figuur 3b). De huid boven de xenotransplantaatmodellen is kan worden verwijderd, zoals getoond om het verwijderen van de xenotransplantaatmodellen is gemakkelijker te maken.</li>
	<li>Gebruik een scalpel om te snijden tussen de xenotransplantaatmodellen is en de tibia (Figuur 3b, pijl geeft de eerste plaats en richting van incisie). Dit zal een kant van de xenograft vrij te krijgen.</li>
	<li>Gebruik een scalpel te snijden tussen de PL spier en de gastrocnemius spier (figuur 3c, Ikncision langs epimysium gelabeld met pijl). De PL wordt verwijderd met de xenograft.</li>
	<li>Snijd onder de distale hechting en door de distale pees van de PL (figuur 3D, snijd langs stippellijn).</li>
	<li>Verwijder de xenotransplantaatmodellen is en pl door de hechting met de Iris Tang te grijpen en het naar de knie te buigen terwijl u een schaar gebruikt om het af te snijden van de onderliggende spier (figuur 3e).</li>
	<li>Snijd boven de proximale hechting met een schaar om de xenotransplantaatmodellen is en pl te verwijderen (figuur 3F, snijd langs stippellijn in 3e).</li>
	<li>Plaats het preparaat op een klein stukje karton of plastic en speld zo dicht mogelijk bij de hechtingen. Tijdens het vastmaken van het preparaat, strek de spier voorzichtig om ervoor te zorgen dat de vezel oriëntatie wordt gehandhaafd tijdens het snap vriesproces. Nadat de pinnen zijn stevig op zijn plaats, schuif de spier omhoog de pinnen zodat het ligt net boven het karton. Opmerking: Als alternatief kan een uiteinde van de xenotransplantaatmodellen is worden gemonteerd in Tragacanth op een kurk, of het kan volledig worden ondergedompeld in optimale snijtemperatuur (O.C.T.) verbinding in een cryomold. Met zorg, spier conformatie kan worden gehandhaafd met beide methoden.</li>
	<li>Snap Freeze de xenotransplantaatmodellen is in voorgekoelde 2-methylbutaan.</li>
	<li>Store xenotransplantaatmodellen is bij-80 °c.</li>
	<li>Onmiddellijk na xenotransplantaatmodellen is collectie, euthaniëren muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Amerikaanse veterinaire medische vereniging:
	<ol>
<li>Plaats muizen in een verzegelde kamer met een geschikt afvalgas opruimingssysteem. Gebruik Isofluraan bij een concentratie van 3-4% voor het opwekken van anesthesie.</li>
		<li>Zodra de juiste verdoving diepte wordt bereikt-zoals beoordeeld door observatie van de ademhalingsfrequentie, spierontspanning, en gebrek aan vrijwillige beweging-verhogen van de instelling van de verdamper 5% voor het opwekken van de dood. Laat de muizen nog 2 minuten in de kamer staan nadat de ademhaling is gestaakt. De dood wordt geverifieerd door te observeren dat de muizen niet binnen 10 minuten na overdosering van isoflurane herstellen.</li>
		<li>Ten slotte, uitvoeren cervicale dislocatie op de muizen. Opmerking: In het geval van bilateraal xenografted muizen, kan de contralaterale xenotransplantaatmodellen is worden opgeslagen voor een latere verzameling. Om een overlevings collectie uit te voeren, open je de huid boven de xenotransplantaatmodellen is met een enkele rechte snede met een chirurgische schaar en verwijder je de xenotransplantaatmodellen is zoals beschreven in de stappen 4,6 tot en met 4,10. Sluit vervolgens de huid over het lege tibiale compartiment met behulp van chirurgische lijm en nieten. Behandel de muis met analgeticum zoals beschreven in stap 2,11 en plaats de muis in een schone kooi op een verwarmde pad om te herstellen. Monitor de muis tot volledig bewust en periodiek in de komende dagen op tekenen van lokale systemische infectie en om ervoor te zorgen dat de operatieplaats niet heropend is.</li>
	</ol></li>
</ol>5. xenotransplantaat immunohistochemie
<ol><li>Gebruik een cryostaat om 10 tot 12 μm secties van de verzamelde xenotransplantaatmodellen is te snijden op positief geladen glijbanen (tabel van materialen).</li>
	<li>Vul de kleurpot met methanol en pre-cool bij-20 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Plaats dia's in ijskoude methanol gedurende 10 minuten om de xenotransplantaatmodellen is-secties op te lossen en te permeabiliseren.</li>
	<li>Plaats dia's in kleurenpot en was 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Blok met anti-muis IgG (tafel van de materialen) voor 2 uur bij 4 °c.</li>
	<li>DEP met primaire antilichamen, zoals spectrine, Lamine A/C, en embryonale myosine (tabel met materialen) in PBS, aangevuld met 2% geit serum, 's nachts bij 4 °c.</li>
	<li>Plaats dia's in een kleurings potje en was 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Blot met TL-kleurstof geconjugeerde secundaire antilichamen (tabel van materialen) in PBS aangevuld met 2% geit serum voor 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats dia's in kleurenpot en was 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Plaats het afdekmedium (Inhoudsopgave) over xenotransplantaten secties, plaats de Afdeklijst bovenop en gebruik nagellak om de dekslip te verzegelen.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59966/59966fig02.jpg"> Figuur 2: xenotransplantaat chirurgie. A) het haar wordt uit de operatieplaats verwijderd. B) er wordt een incisie gemaakt over het tibialis voorste (TA). De distale pezen van de TA en extensor digitorum Longus (EDL) zijn gemarkeerd met pijlen. De zwarte onderbroken lijn geeft aan waar de epimysium wordt geknipt in stap 3,3. (C) de distale pees van de TA wordt gesneden en de spier wordt naar de knie getrokken. D) de pees van de EDL wordt afgesneden en de EDL wordt naar de knie getrokken. Dit onthult de proximale pees van de peroneus longus (PL) gemarkeerd met een pijl. Onderbroken lijnen geven aan waar u met een schaar moet snijden om de EDL (groen) en PL (blauw) te verwijderen. E) de EDL en de ta worden verwijderd. F) een hechtmiddel wordt geplaatst door de proximale pees van de pl.G) de xenotransplantaatmodellen is wordt in het lege tibiale compartiment geplaatst en gehecht aan de proximale pl pees met behulp van een twee-handen chirurgische vierkante knoop. H) een hechtmiddel wordt geplaatst door de distale pees van de PL, gemarkeerd met een pijl, en een andere twee-hand chirurgische vierkante knoop wordt gebruikt om de xenotransplantaatmodellen is aan de distale pees te hecht. I) de xenotransplantaatmodellen is is volledig getransplanteerd en gehecht aan de pl. (J) de huid is gesloten met chirurgische lijm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59966/59966fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59966/59966fig03.jpg"> Afbeelding 3:4 maand xenograft collectie. A) het haar wordt uit de operatieplaats verwijderd. Hechtingen zijn zichtbaar onder de huid. B) de huid boven de xenotransplantaatmodellen is wordt verwijderd. Vervolgens wordt de xenotransplantaatmodellen is gegrepen met de Iris Tang bij de distale hechting en zachtjes naar boven getrokken. Beginnend bij de enkel, wordt een scalpel gebruikt om langs de Tibia te snijden en de xenograft vrij te maken. De pijl toont het begin van de incisie langs de Tibia. (C) door de gastrocnemius-spier aan de zijkant te trekken, wordt een zwakke witte lijn van epimysium die de peroneus LONGUS (PL)-spier scheidt en het gastrocnemius (getoond door de pijl) zichtbaar. Gebruik de scalpel om langs deze lijn te snijden om de PL van de andere beenspieren te scheiden. D) de rechterkant van de xenograft, en de PL zijn nu vrij van de andere spieren in het been en zijn klaar voor verwijdering. De onderbroken lijn geeft aan waar te snijden met een chirurgische schaar om te beginnen met het verwijderen van de xenotransplantaatmodellen is en pl. (E) na het snijden onder de distale hechting, afbuigen de xenotransplantaatmodellen is naar de knie. De onderbroken lijn geeft aan waar te snijden met een chirurgische schaar om de xenotransplantaatmodellen is en pl uit het tibiale compartiment te verwijderen. F) het lege tibiale compartiment met de xenotransplantaatmodellen is en pl met succes verwijderd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59966/59966fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<ol><li>Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+clinical+trial+success+rates+and+related+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Biostatistics%22%5BJournal%5D)">Estimation of clinical trial success rates and related parameters.</a> Biostatistics. 0, 1-14 (2018).</li>
<li>Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+development+success+rates+for+investigational+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Clinical development success rates for investigational drugs.</a> Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).</li>
<li>Perel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+treatment+effects+between+animal+experiments+and+clinical+trials%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review.</a> BMJ. 334, 1-6 (2007).</li>
<li>Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+xenograft+tumor+model+for+predicting+chemotherapeutic+drug+response+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients.</a> Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).</li>
<li>Roberts, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targetable+Kinase-Activating+Lesions+in+Ph-like+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF11+Controls+the+Timing+of+Progenitor+Cell+Competence+in+Developing+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina.</a> Science. 308, 1927-1930 (2005).</li>
<li>Sako, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+ligand+binding+functionality+of+the+extracellular+domain+of+activin+receptor+type+IIB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemisty%22%5BJournal%5D)">Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB.</a> Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+xenograft+as+a+new+preclinical+model+for+muscle+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders.</a> Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).</li>
<li>Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inappropriate+Gene+Activation+in+FSHD+%3A+A+Repressor+Complex+Binds+a+Chromosomal+Repeat+Deleted+in+Dystrophic+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle.</a> Cell. 110, 339-348 (2002).</li>
<li>Lemmers, R. J. L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unifying+Genetic+Model+for+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy.</a> Science. 329, 1650-1654 (2010).</li>
<li>Chen, J. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpholino-mediated+Knockdown+of+DUX4+Toward+Facioscapulohumeral+Muscular+Dystrophy+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics.</a> Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).</li>
<li>Medical Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Aids+to+the+investigation+of+the+peripheral+nervous+system%22">Aids to the investigation of the peripheral nervous system</a>. , Her Majesty’s Stationary Office. London. (1943).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Molecular+Anatomy+of+the+Human+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction.</a> Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Patiënt-afgeleide xenotransplantaten zijn een innovatieve manier om te modelleren spierziekte en preklinische studies uitvoeren. De hier beschreven methode om skeletspieren xenotransplantaten maken is snel, ongecompliceerd, en reproduceerbaar. Eenzijdige operaties kunnen worden uitgevoerd in 15 tot 25 minuten, of bilateraal in 30 tot 40 minuten. Bilaterale xenotransplantaten kunnen extra experimentele flexibiliteit bieden. Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld een gelokaliseerde behandeling van een xenograft uitvoeren, met de...

Er is gemeld dat slechts 13,8% van alle Programma's voor Geneesmiddelenontwikkeling die klinische proeven ondergaan succesvol zijn en leiden tot goedgekeurde therapieën1. Hoewel dit succespercentage hoger is dan de 10,4% eerder gerapporteerde2, is er nog steeds aanzienlijke ruimte voor verbetering. Een benadering om het succespercentage van klinische proeven te verhogen is het verbeteren van laboratorium modellen die worden gebruikt in preklinisch onderzoek. De Food and Drug Administration (FDA) vereist dierstudies om de werkzaamheid van de behandeling te tonen en de toxiciteit te beoordelen voorafgaand aan fase 1 klinische onderzoeken. Er is echter vaak een beperkte concordantie in behandelingsresultaten tussen dierstudies en klinische proeven3. Bovendien kan de noodzaak van preklinische dierproeven een onoverkomelijke barrière zijn voor therapeutische ontwikkeling bij ziekten die geen geaccepteerd diermodel hebben, wat vaak het geval is bij zeldzame of sporadische ziekten.
Een manier om het model van menselijke ziekte is door het transplanteren van menselijk weefsel in immunodeficiënte muizen om xenografts te genereren. Er zijn drie belangrijke voordelen voor xenotransplantaatmodellen is-modellen: ten eerste kunnen ze de complexe genetische en epigenetische afwijkingen die in een menselijke ziekte voorkomen, die nooit reproduceerbaar zijn in andere diermodellen, recapituleren. Ten tweede kunnen xenotransplantaten worden gebruikt om zeldzame of sporadische ziekten te modelleren als er patiënt monsters beschikbaar zijn. Ten derde modelleren xenotransplantaten de ziekte binnen een compleet in vivo systeem. Om deze redenen veronderstellen we dat de werkzaamheidsresultaten van de behandeling in xenotransplantaatmodellen is-modellen meer kans maken om te vertalen naar proeven bij patiënten. Menselijke tumor xenotransplantaten zijn al met succes gebruikt voor het ontwikkelen van behandelingen voor veelvoorkomende kankers, met inbegrip van multipel myeloom, evenals gepersonaliseerde therapieën voor individuele patiënten4,5,6, 7.
Onlangs zijn xenotransplantaten gebruikt voor de ontwikkeling van een model van de menselijke spierziekte8. In dit model worden menselijke spier biopsie specimens in de achterbenen van immunodeficiënte NRG muizen getransplanteerd om xenografts te vormen. De getransplanteerde humane myofibers sterven, maar menselijke spier stamcellen aanwezig in de xenotransplantaatmodellen is vervolgens uit te breiden en te differentiëren in nieuwe menselijke myofibers die herbevolken de geënt menselijke basale lamina. Daarom zijn de geregenereerde myovezels in deze xenotransplantaten volledig menselijk en worden ze spontaan revasculariseerd en geïnnerveerd door de muis gastheer. Belangrijker, fascioscapulohumeral spierdystrofie (FSHD) patiënt spierweefsel getransplanteerd in muizen aan belangrijkste kenmerken van de menselijke ziekte, namelijk de uitdrukking van de Dux4 transcriptiefactor8. FSHD wordt veroorzaakt door overexpressie van Dux4, wat epigenetisch wordt onderdrukt in normaal spierweefsel9,10. In het FSHD xenotransplantaatmodellen is-model is aangetoond dat behandeling met een Dux4-specifieke morpholino met succes Dux4 expressie en functie te onderdrukken en mogelijk een mogelijke therapeutische optie is voor FSHD-patiënten11. Deze resultaten tonen aan dat menselijke spier xenotransplantaten een nieuwe benadering zijn om de menselijke spierziekte te modelleren en mogelijke therapieën bij muizen te testen. Hier beschrijven we in detail de chirurgische methode voor het maken van menselijke skeletspieren xenotransplantaten in immunodeficiënte muizen.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutaan</td><td>Fisher</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>20 mm x 30 mm micro dekglas</td><td>VWR</td><td>48393-151</td><td></td></tr><tr><td>Dierweegschaal</td><td>Kent Scientific</td><td>SCL- 1015</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-antimycoticum oplossing</td><td>Corning, Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip systeem</td><td>F.S.T</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo naaldhouder</td><td>F.S.T</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Kikembryo extract</td><td>Accurate</td><td>CE650TL</td><td></td></tr><tr><td>CM1860 UV cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860UV</td><td></td></tr><tr><td>Coplin kleefpot</td><td>Thermo Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiepennen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13976</td><td></td></tr><tr><td>Droge ijs - pellet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9584462</td><td></td></tr><tr><td>Embryonale myosine antilichaam</td><td>DSHB</td><td>F1.652</td><td>aanbevolen concentratie 1:10</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Mi-150</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>F.S.T</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG1, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td>aanbevolen concentratie 1:500</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG2b, AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21145</td><td>aanbevolen concentratie 1:500</td></tr><tr><td>Gum tragacanth</td><td>Sigma</td><td>G1128</td><td></td></tr><tr><td>Hams F-10 Medium</td><td>Corning</td><td>10-070-CV</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl Blue topische huidkleefstof</td><td>Tissue seal</td><td>TS1050044FP</td><td></td></tr><tr><td>Humaan specifiek lamin A/C antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab40567</td><td>aanbevolen concentratie 1:50-1:100</td></tr><tr><td>Humaan specifiek spectrine antilichaam</td><td>Leica Biosystems</td><td>NCLSPEC1</td><td>aanbevolen concentratie 1:20-1:100</td></tr><tr><td>Inductiekamer</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Iris pincet</td><td>F.S.T</td><td>11066-07</td><td></td></tr><tr><td>Bestraald Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)</td><td>Envigo</td><td>TD.06596</td><td>Antibioticum knaagdier dieet om te beschermen tegen ademhalingsinfecties</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>chirurgische doekjes</td></tr><tr><td>Mapleson E ademhalingscircuit</td><td>VetEquip</td><td>921412</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Mobiele anesthesiemachine</td><td>VetEquip</td><td>901805</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on Mouse Basic Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>muis IgG blokkeringsreagens</td></tr><tr><td>Nagellak</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NAIR haartjes verwijdering lotion/olie</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>007799</td><td>2 tot 3 maanden oud</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstof</td><td>Airgas</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>4870500</td><td></td></tr><tr><td>Povidon jodium prep oplossing</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Gold Antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P10144 (geen DAPI); P36935 (met DAPI)</td><td></td></tr><tr><td>Puralube oogzalf</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (carprofen) injecteerbaar</td><td>Patterson Veterinary</td><td>10000319</td><td>chirurgisch analgeticum, subcutaan toegediend in een dosis van 5 mg/kg</td></tr><tr><td>Scalpelmessen - #11</td><td>F.S.T</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handvat - #3</td><td>F.S.T</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Accu-scope</td><td>3075</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus microscoopglaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Naad, synthetisch, niet-opneembaar, 30 inch lang, CV-11 naald</td><td>Covidien</td><td>VP-706-X</td><td></td></tr><tr><td>1ml spuit (26 gauge, 3/8 inch naald)</td><td>BD Biosciences</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Vannas veerschaar, 8,0 mm snijkant</td><td>F.S.T</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>VaporGaurd geactiveerde koolstoffilter</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Wondclips, 9 mm</td><td>F.S.T</td><td>12022-09</td><td></td></tr></tbody></table>

het uitvoeren van menselijke skeletspieren xenografts in immunodeficiënte muizen

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

De in dierstudies waargenomen behandelingseffecten worden vaak niet in klinisch onderzoek gerecapitculeerd. Hoewel dit probleem veelzijdig is, is een van de redenen voor deze mislukking het gebruik van inadequate laboratorium modellen. Het is een uitdaging om complexe menselijke ziekten in traditionele laboratorium organismen te modelleren, maar dit probleem kan worden omzeild door de studie van menselijke xenografts. De chirurgische methode die we hier beschrijven, zorgt voor de creatie van menselijke skeletspieren xenografts, die kunnen worden gebruikt om spierziekte te modelleren en om preklinische therapeutische testen uit te voeren. Onder een institutioneel Review Board (IRB)-goedgekeurd protocol, worden skeletspieren specimens verworven van patiënten en vervolgens getransplanteerd in NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) host muizen. Deze muizen zijn ideale gastheren voor transplantatie studies als gevolg van hun onvermogen om volwassen lymfocyten te maken en zijn dus niet in staat om cel-gemedieerde en humorale adaptieve immuunresponsen te ontwikkelen. Hostmuizen worden verdoofd met Isofluraan en de muis tibialis voorste en extensor digitorum Longus spieren worden verwijderd. Vervolgens wordt een stukje menselijke spier in het lege tibiale compartiment geplaatst en gehecht aan de proximale en distale pezen van de peroneus longus spier. De xenografted spier is spontaan gevasculariseerde en geïncubeerd door de muis gastheer, resulterend in robuust geregenereerde menselijke spier die kan dienen als een model voor preklinische studies.

Zoals gedemonstreerd door yuanfan Zhang et al., dit chirurgische protocol is een eenvoudige methode voor de productie van menselijke skeletspieren xenotransplantaten8. Geregenereerde xenotransplantaten worden spontaan geïnnerveerd en vertonen een functionele contractiliteit. Bovendien, spier xenografted van FSHD patiënten aan veranderingen in genexpressie waargenomen bij FSHD patiënten8.
In onze ervaring, ongeveer 7 van de 8 xenotransplantaten ui...

Complexe menselijke ziekten kunnen lastig zijn om te modelleren in traditionele laboratoriummodel systemen. Hier beschrijven we een chirurgische benadering om de menselijke spierziekte te modelleren door de transplantatie van menselijke skeletspier biopsieën in immunodeficiënte muizen.

Het uitvoeren van menselijke skeletspieren xenografts in Immunodeficiënte muizen

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Dit protocol is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om menselijke skeletspier xenografts te creëren, die kunnen worden gebruikt om spierziekte te modelleren en preklinische therapeutische testen uit te voeren. Dit xenograft-model stelt onderzoekers in staat om menselijke spieren in vivo te bestuderen om de menselijke spiercelbiologie beter te begrijpen en nieuwe modellen te ontwikkelen voor zeldzame of verworven spierziekten. Na het verkrijgen van een menselijke spierbiopsie, plaats het monster in een 100-bij-15-millimeter petrischaal met spiermedium, en gebruik een stereomicroscoop en chirurgische schaar om eventuele resterende fascia of vetweefsel te verwijderen.Ontleden de spierbiopsie in ongeveer zeven bij drie bij drie millimeter stukken, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de vezels in de lengterichting in het monster zijn gerangschikt. Breng vervolgens de petrischaal met de ontleed spier op ijs en plaats synthetische, niet-absorbeerbare hechtingen in een petrischaaltje van 100 bij 15 millimeter van 70%-ethanol. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen in een acht-tot 12-weken oude, verdoofd NOD-Rag-gamma muis, van toepassing zalf op de ogen van het immunod

performing-human-skeletal-muscle-xenografts-in-immunodeficient-mice

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

Een methode voor het betrouwbaar enten van luciferase-gemerkte menselijke maligne perifere zenuwschede tumorcellen in de heupzenuw van immunodeficiënte muizen wordt beschreven. Het gebruik van bioluminescentie imaging om een ​​goede invoering van de tumor enten en criteria voor willekeurige scheiding van dieren in studiegroepen aan te tonen worden ook besproken.

Orthotope Xenografting van de Mens Luciferase-label maligne perifere zenuwschede tumorcellen voor In vivo Het testen van de kandidaat-therapeutische middelen

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

This video demonstrates a method for grafting human skin onto an immunodeficient mouse with a suppressed neutrophil response. The method involves applying human split-thickness skin to the mouse's graft bed, sealing it, and covering it for recovery. Eventually, the human skin adheres to the mouse's skin, establishing vascularization and circulation, resulting in a successful skin xenograft.

A Technique for Human Skin Grafting in a Mouse Model

This video demonstrates an assay to generate a humanized xenograft mouse model. An immunocompromised mouse is injected with cyclophosphamide to cause immune cell depletion. Patient-derived tumor cells mixed with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in a hydrogel are subcutaneously injected into the mouse, forming a tumor with infiltrating T cells.

A Technique to Generate a Human PBMC-Engrafted Humanized Xenograft Mouse Model

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.

Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel.  hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke huid kan worden geënt op niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketen receptor (NSG) muizen. Een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van de menselijke huid voor transplantatie, de voorbereiding van muizen voor transplantatie, transplantatie van de menselijke huid van gespleten dikte en de herstelprocedure na de transplantatie zijn opgenomen in het rapport.

Xenograft huidmodel om menselijke immuunresponsen in vivo te manipuleren

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

Ontdek een chirurgisch protocol voor menselijke skeletspierxenotransplantaties in immunodeficiënte muizen. Deze methode maakt in vivo modellering van spierziekten en preklinische therapietests mogelijk.

Het uitvoeren van menselijke skeletspieren xenografts in Immunodeficiënte muizen

Meer video's verkennen