Name: Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer de isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten voor immunologisch onderzoek naar HIV-gerelateerde immuundisfunctie. Deze methode ondersteunt studies naar monocytfunctie en immuunrespons.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen de HIV klinische/tumor Biorepository kern bedanken voor het verstrekken van patiënt monsters en de cellulaire immunologie metabolisme kern voor het verstrekken van Flowcytometrie analyse. Dit project werd gefinancierd door NIH P20GM121288 en P30GM114732.

Alle hieronder beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institutioneel Review Board. Al het bloed werd verzameld na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming.
Opmerking: de gehele procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een faciliteit voor bioveiligheid niveau 2 (BSL2), zodat voorzichtigheid wordt gebruikt voor het omgaan met biologische materialen. In het bijzonder wordt elke stap uitgevoerd met behulp van steriele technieken onder een bioveiligheidskast. Na elke stap waarbij bloed, bloedproducten, cellen of pipetteren van het product zijn betrokken, is het belangrijk om al het plastic materiaal (d.w.z. Serologische pipetten, pipetpunten en buizen) te spoelen met 10% bleekwater uit een afvalbak in de afzuigkap voorafgaand aan de juiste afvoer.
1. isolatie van primaire humane monocyten door immunomagnetische negatieve selectie
<ol><li>Verzamel 40 mL vers, menselijk volbloed (van ofwel een HIV+ patiënt of een gezonde controle) in 4 10 ml ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) vacuümbuizen (10 ml bloed per buis). Gebruik steriele technieken onder een bioveiligheidskast en breng alle 40 mL bloed over in 1 50 mL conische propyleen buis.</li>
	<li>Volg het Protocol van de fabrikant voor de geselecteerde Human monocyt Isolation Kit (tabel met materialen), voeg 2 ml monocyt Isolation cocktail toe, in de kit, aan de buis van het bloed. Vortex magnetische kralen, ook voorzien in de kit, voor 30 s, en voeg 2 mL aan de buis van bloed.<ol>
<li>Als er minder dan 40 mL bloed beschikbaar is, schaaf dan de toegevoegde reagentia. Om de oplossing te mengen, Pipetteer op en neer met een plastic 25 mL serologische pipet en inincuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scheid het bloed mengsel gelijkmatig in 4 50 mL buizen en Voeg 30 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 mM EDTA toe aan elke buis. Meng door Pipetteer op en neer met een plastic 25 mL serologische pipet.</li>
	<li>Plaats de buisjes in magneet houders gedurende 10 minuten om de antilichaam-geconjugeerde magnetische kralen te verwijderen. Gebruik vier magneet houders tegelijk, één voor elke buis, om consistente incubatie-en isolatie tijden toe te staan voor elk bloedmonster.</li>
	<li>Trek de inhoud uit het midden van elke buis met behulp van een pipet, terwijl ze zich nog in de magneet houders bevinden. Zorg ervoor dat u geen rode bloedcellen optekent (niet meer dan 10% van het 10 mL start volume) en plaats de inhoud in een van de vier nieuwe buizen van 50 mL.</li>
	<li>Voeg 500 μL gevortext magnetische kralen toe aan elke buis van 50 ml. Pipetteer op en neer met een pipet van 25 mL en inincuberen op RT gedurende 5 minuten. Plaats de buisjes vervolgens in magneet houders gedurende 5 min.</li>
	<li>Breng de inhoud voorzichtig vanuit het midden van elke buis over terwijl u nog steeds in magneet houders in een van de vier nieuwe buizen van 50 mL zit. Plaats elke nieuwe tube van 50 mL direct in de magneet houders gedurende 5 min.</li>
	<li>Breng de inhoud van het midden van elke buis voorzichtig over in een van de vier nieuwe buizen van 50 mL. Spin alle nieuwe 50 mL tubes bij 300 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en Redigeer alle vier celpellets in een totaal van 10 ml steriele PBS.</li>
	<li>Tel cellen door trypan blauwe uitsluiting met behulp van een hemocytometer. Opmerking: 8-20 x 106 cellen worden over het algemeen verkregen uit 40 ml volbloed.</li>
</ol>2. culturing van primaire humane monocyten
<ol><li>Met behulp van een 37 ° c waterbad, warme serum vrije rpmi 1640 media aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine (pen/STREP), en (terwijl u steriele technieken onder een bioveiligheid Cabinet blijft gebruiken) hervat de geïsoleerde monocyten in deze media met een concentratie van 1 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Voeg 1 mL geresuspendeerde cellen toe aan elk goed van een 6-goed plaat of in een 35 mm-schotel (het laatste aantal cellen moet 1 x 106 -cellen/plaat zijn) en plaats in een incubator van 37 °c met 5% Co2. Wacht 0,5-1,0 h voor cellen om te hechten.</li>
	<li>Met behulp van een 37 °C waterbad, warm warmtegeïnactiveerd (HI) foetaal runderserum (FBS). Voeg aan elke plaat 100 μL (10% eindconcentratie) van de FBS toe. Voeg groeifactoren toe aan de cellen om macrofaag differentiatie te bevorderen.<ol>
<li>Prime macrofagen voor een M1-achtig fenotype door toevoeging van 25 ng/mL granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) aan de media. Prime macrofagen voor een m2-achtig fenotype door toevoeging van 50 ng/mL macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) aan media28. Opmerking: zowel GM-CSF als M-CSF maken het mogelijk om monoyte-differentiatie toe te staan aan een algemeen macrofaag-fenotype (M0) terwijl het priming van cellen voor M1 of m2, respectievelijk7,28,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. transfecting primaire humane monocyten in cultuur
<ol><li>Monocyten met Mirna bootst of remmers of siRNA met behulp van een kit die een polymeer-gebaseerd transfectie-reagens bevat (tabel met materialen).<ol>
<li>Na het Protocol van de fabrikant voor de transfectie Kit (en voortzetting van het gebruik van steriele technieken onder een bioveiligheid Cabinet), Verdun eerst de geselecteerde Mirna Mimics/remmers of sirna's in de buffer tot een eindconcentratie van 1,83 μM. bereid 10 μL verdund nabootsen/inhibitor per transfectie van 1 x 106 cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid het transfectie reagens door 1 μL van het meegeleverde polymeer toe te voegen aan een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL, onmiddellijk gevolgd door toevoeging van 90 μL meegeleverde buffer (voor een totaal van 91 μL reagens per trans fectie). Vortex voor 3-5 s.</li>
	<li>Pipetteer 90 μL van de transfectie oplossing in de buis met 10 μL verdunde miRNA-nabootsen/remmers of siRNA. Meng door voorzichtig pipetteren en inbroed gedurende 15 minuten bij RT.</li>
	<li>Voeg 100 μL transfectie complex toe aan één put (of schotel) van 1 x 106 geplateerde monocyten. Inbroed cellen gedurende 4 uur bij 37 °C en vervang vervolgens het medium door 3 mL complete media (RPMI 1640 aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine en 10% warmte-geïnactiveerd FBS) die ofwel GM-CSF of M-CSF bevatten.</li>
</ol>4. M1/M2 differentiatie en activering
<ol><li>Monocyten beginnen onmiddellijk te differentiëren naar brede M0 macrofagen bij het beplating in de cultuur. Op de derde dag na het beplating, doorgaan met het gebruik van steriele technieken onder een bioveiligheid Cabinet en vervangen van media met 3 ml verse rmpi 1640 media (aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine, 10% warmte-geïnactiveerd FBS, en 25 ng/ml GM-CSF ter bevordering van M1-achtige polarisatie of 50 ng/ml M-CSF ter bevordering van m2-achtige Kweek de cellen in deze omstandigheden voor een totaal van 6 dagen vanaf de initiële beplating in een incubator bij 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Voor de polarisatie van de GEPRIMEERDE cellen naar het M1-macrofaag fenotype, Activeer cellen op dag 6 van incubatie door het vervangen van celmedia met nieuwe media die 5% warmte-geïnactiveerd FBS, 1% pen/STREP, 100 ng/mL E. coli-afgeleide lipopolysaccharide (LPS), en 20 ng/ml interferon-gamma (IFN-γ).</li>
	<li>Om polarisatie van GEPRIMEERDE cellen naar het m2-macrofaag fenotype te voorkomen, activeert u cellen op dag 6 van incubatie door celmedia te vervangen door nieuwe media met 5% warmte-geïnactiveerde FBS, 1% pen/STREP, 10 ng/mL M-CSF en 20 ng/mL Interleukine 4 (IL-4).</li>
	<li>Oogst na 24 uur de cellen voor RNA-, proteïne-of Flowcytometrie-analyses.<ol>
<li>Wanneer cellen klaar zijn om te worden afgekoeld, wast u cellen in de schaal 2x met PBS (bij RT voor RNA-extractie of gekoeld op ijs voor EiwitExtractie). Omdat de gedifferentieerde macrofagen nu stevig aan de platen zijn bevestigd, lyseer de cellen in platen rechtstreeks om materiaal te verkrijgen voor RNA-en eiwit analyses.</li>
		<li>Voor het verzamelen van materiaal voor Flowcytometrie, voeg PBS met 2 mM EDTA toe aan het schaaltje, inbroed de cellen gedurende 10 minuten bij 37 °C, schuif de cellen voorzichtig uit de schaal en verzamel de inhoud in een micro centrifugebuis van 1,5 mL voordat u verdergaat met standaardprotocollen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. stroom cytometrie
<ol><li>Spoel cellen in PBS uit om het kweekmedium te verwijderen. Draai 100.000 cellen uit (per elke stroom cytometrie voorwaarde) en regeer de pellet in 100 μL PBS met 2 μL HuFcR bindings remmer. Incuberen bij RT gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Voeg 50 μL kleurings buffer en de gewenste antilichamen (hier, CD80, CD83, CD163 en CD209 gebruikt) toe in de aanbevolen hoeveelheden.</li>
	<li>Meng zachtjes en inincuberen bij 4 °C in het donker gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Was 2x met PBS en hervat de bevlekte cellen in 150 μL PBS voordat u het monster op een cytofluorimeter uitvoert.</li>
</ol>

<ol><li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638(2016).</li>
<li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+the+Macrophage%3A+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li>
<li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li>
<li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Monocyte%2FMacrophages+during+HIV%2FSIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693(2017).</li>
<li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells%3A+Contribution+to+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+M1%2FM2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264(2013).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097(2017).</li>
<li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage+polarization+in+vitro%3A+maturation+and+activation+methods+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li>
<li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li>
<li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li>
<li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li>
<li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li>
<li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses%3A+possible+pathogenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li>
<li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li>
<li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li>
<li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15(2016).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection%3A+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852(2015).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175(2018).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing%3A+A+Pilot+Study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li>
<li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li>
<li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535(2014).</li>
<li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li>
<li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593(2015).</li>
<li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic%2C+functional%2C+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gepresenteerde protocol toont het gebruik van primaire cellen van HIV-geïnfecteerde onderwerpen als een model voor het bestuderen van monocyten en macrofagen. HIV+ patiënten ondergaan kar leven met infectie voor meerdere jaren en kunnen ook andere co-infecties gerelateerd een gecompromitteerd immuunsysteem. Om immunomodulatie te bestuderen in de aanwezigheid van een chronische HIV-infectie, werden cellen rechtstreeks van patiënten geoogst. Aangezien miRNAs belangrijke rollen speelt in celontwikkeling en di...

Humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1) infectie veroorzaakt ernstige immuundisfunctie, wat kan leiden tot opportunistische infecties en verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS). Hoewel HIV-geïnfecteerde patiënten die cART ondergaan worden gekenmerkt door lage virale belastingen en normale CD4+ T-celtellingen, kan de werking van het immuunsysteem in deze individuen worden aangetast, wat leidt tot een disfunctionele immuunrespons die is gekoppeld aan een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker1. De mechanismen van immuun disfunctie bij HIV-patiënten in de winkelwagen blijven grotendeels onbekend. Daarom is het karakteriseren van patiënt afkomstige immuuncellen en het onderzoeken van hun biologie en functie een essentieel onderdeel van het huidige HIV-onderzoek.
Monocyten en macrofagen zijn belangrijke regulatoren van immuunresponsen en spelen fundamentele rollen bij HIV-infectie2,3,4,5. Heterogene en kunststof in de natuur, macrofagen kunnen breed worden geclassificeerd in klassiek geactiveerde (M1) of als alternatief geactiveerd (m2). Hoewel deze algemene indeling nodig is bij het instellen van experimentele omstandigheden, kan de polarisatie status van macrofagen worden omgekeerd door een verscheidenheid van cytokines6,7,8,9. Hoewel verschillende studies de effecten van HIV-infectie op monocyten en dendritische cellen hebben onderzocht, zijn de moleculaire Details van monocyte-gemedieerde reacties grotendeels onbekend6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Onder de factoren die betrokken zijn bij de regulering en functie van immuun cellen, microRNAs (miRNAs), korte niet-Codeer Rna's die na transcriptioneel de genexpressie reguleren, is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt in de context van belangrijke cellulaire trajecten (d.w.z. groei, differentiatie, ontwikkeling en apoptosis)20. Deze moleculen zijn beschreven als belangrijke regulatoren van transcriptiefactoren die essentieel zijn voor het diceren van de functionele polarisatie van macrofagen21. De mogelijke rol van miRNAs in monocyten van HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan is onderzocht, maar vooruitgang in het veld vereist veel meer werk22,23,24,25,26. Deze paper bespreekt een geoptimaliseerde methode om miRNAs en siRNAs te transfect in primaire humane monocyten van HIV-geïnfecteerde patiënten en controles.
Dit protocol is gebaseerd op in de handel verkrijgbare reagentia en kits, omdat de continuïteit in de technische procedure helpt bij het elimineren van onnodige experimentele variabelen bij het werken met klinische monsters. Niettemin, de methode biedt belangrijke tips (dat wil zeggen, het aantal cellen verguld of korte incubatie met serum vrije media om de hechting van cellen aan de plaat te bevorderen). Bovendien zijn de in dit Protocol gebruikte polarisatie omstandigheden afgeleid van het gepubliceerde werk27,28,29.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>CD14 PerCP</td><td>Invitrogen</td><td>46-0149-42</td><td>Flow cytometry- conjugated antibody</td></tr><tr><td>CD163 BV711</td><td>BD Horizon</td><td>563889</td><td>Flow cytometry- conjugated antibody</td></tr><tr><td>CD209 BV421</td><td>BD Horizon</td><td>564127</td><td>Flow cytometry- conjugated antibody</td></tr><tr><td>CD80 FITC</td><td>BD Horizon</td><td>557226</td><td>Flow cytometry- conjugated antibody</td></tr><tr><td>CD83 APC</td><td>BD Horizon</td><td>551073</td><td>Flow cytometry- conjugated antibody</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19669</td><td></td></tr><tr><td>EIF4EBP1 mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>Monoclonal antibody for Western blot</td></tr><tr><td>EIF4EBP1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-29594</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43618</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47724</td><td>Monoclonal antibody for Western blot</td></tr><tr><td>HuFcR Binding Inhibitor</td><td>eBiosciences</td><td>14-9161-73</td><td>Flow cytometry- blocking buffer</td></tr><tr><td>Kaluza Analysis Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>B16406</td><td>Software to analyze flow cytometry data</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td><td>Sigma</td><td>L4524</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>YM00472124</td><td></td></tr><tr><td>MISSION miRNA Negative Control</td><td>Sigma</td><td>HMC0002</td><td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td></tr><tr><td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human GM-CSF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>215-GM-050</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IFN-&gamma;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>204-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human M-CSF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>216-MC-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>10040CVMP</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled Control siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td></td></tr><tr><td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td>Colorimetric assay to assess cell viability</td></tr></tbody></table>

isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een belangrijke gezondheidszorg ondanks de introductie van gecombineerde antiretrovirale therapie (cART) in het midden van de jaren 1990. Hoewel antiretrovirale therapie de systemische virale belasting efficiënt verlaagt en het normale aantal CD4+ T-cellen herstelt, vormt het geen volledig functioneel immuunsysteem. Een disfunctioneel immuunsysteem in HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan kan worden gekenmerkt door immuun activering, vroege veroudering van immune cellen, of aanhoudende ontsteking. Deze voorwaarden, samen met comorbide factoren die gepaard gaan met HIV-infectie, voegen complexiteit toe aan de ziekte, die niet gemakkelijk kan worden gereproduceerd in cellulaire en dierlijke modellen. Om te onderzoeken van de moleculaire gebeurtenissen onderliggende immuundisfunctie bij deze patiënten, een systeem voor cultuur en manipuleren van menselijke primaire monocyten in vitro wordt hier gepresenteerd. Specifiek, het protocol maakt het mogelijk voor de cultuur en transfectie van primaire CD14+ monocyten verkregen van HIV-geïnfecteerde personen die kar en HIV-negatieve controles ondergaan. De methode omvat isolatie, cultuur en transfectie van monocyten en monoyte-afgeleide macrofagen. Terwijl in de handel verkrijgbare kits en reagentia worden gebruikt, biedt het protocol belangrijke tips en geoptimaliseerde voorwaarden voor een geslaagde hechting en transfectie van monocyten met Mirna bootst en remmers, evenals met sirna's.

Met behulp van de beschreven procedure werden primaire humane monocyten van HIV-geïnfecteerde personen en gezonde donoren geïsoleerd. Alle hier gepresenteerde gegevens werden verkregen van HIV+ -proefpersonen die een kar ondergingen met een lage (< 20 kopieën/ml) of niet-detecteerbare virale ladingen en normale CD4+ T-cellen. Onmiddellijk na isolatie, cellen werden gekleurd, en flow cytometrie werd uitgevoerd om te bevestigen van de zuiverheid van de celpopulaties. R...

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV-infectie veroorzaakt immuundisfunctie, zelfs bij personen die antiretrovirale therapie ondergaan zonder detecteerbaar virus. Deze methode maakt het mogelijk voor de studie van monocyten functie die belangrijke regelgevers van de immuunrespons. We hebben deze techniek geoptimaliseerd voor de isolatie, cultuur en transfectie van menselijke primaire monocyten.We gebruiken deze methode om de moleculaire mechanismen van immuundisfunctie bij hiv-geïnfecteerde personen te begrijpen, maar het kan worden toegepast op andere immuunstudies met monocyten. Als dit de eerste keer is dat u met menselijk bloed werkt, vergeet dan niet om de juiste bioveiligheidsprotocollen te volgen en alle monsters te behandelen als mogelijk besmettelijk materiaal. Na het verzamelen van 40 milliliter vers menselijk volbloed in vier edta vacuümbuizen van 10 milliliter, gebruik steriele techniek om al het bloed in één 50 milliliter conische propyleenbuis in een bioveiligheidskast over te brengen.Voeg volgens de instructies van de fabrikant van een geselecteerde menselijke monocyten isolatiekit twee milliliter monocyten isolatiecocktail toe van de kit aan de buis van bloed en vortex de magnetische kralen uit de k

isolation-transfection-and-culture-of-primary-human-monocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the isolation of monocytes from whole human blood by immunomagnetic negative separation. The isolated monocytes can be used for further downstream analysis.

Isolation of Monocytes from Whole Blood by Immunomagnetic Negative Selection

This video demonstrates the priming of primary monocytes into macrophages. Primary human monocytes can be isolated and differentiated to an M1-like pro-inflammatory phenotype using the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) or to an M2-like anti-inflammatory phenotype using the macrophage colony-stimulating factor (M-CSF).

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Deze studie vergelijkt twee verschillende methoden voor het isoleren van humane monocyten voor het verkrijgen van in vitro dendritische cellen (DC's). Monocyten worden geselecteerd door adhesie of negatief verrijkt door magnetische scheiding. De monocytenopbrengst en levensvatbaarheid, samen met de levensvatbaarheid van MDDC, proliferatie en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsuitdrukking, zullen worden vergeleken tussen beide methoden.

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Deze studie schetst een nieuwe benadering voor de oprichting van menselijke monocyt-afgeleide microglia-achtige (iMG) cellen die de indirecte beoordeling van hersenontsteking mogelijk maken. Dit presenteert een cellulair model dat nuttig kan zijn voor onderzoek dat zich richt op mogelijke ontsteking van de hersenen en bijbehorende neuropsychiatrische stoornissen.

Engineering van door menselijk bloed geïnduceerde microglia-achtige cellen voor omgekeerd translationeel hersenonderzoek

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

Leer de isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten voor immunologisch onderzoek naar HIV-gerelateerde immuundisfunctie. Deze methode ondersteunt studies naar monocytfunctie en immuunrespons.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Meer video's verkennen