Name: Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptose na genotoxische stress door flowcytometrie. Deze methode combineert DNA-dubbelstrengsbreukanalyse met celcyclusdistributie voor onderzoek naar behandelingseffecten in radiobiologie en oncologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het flow Cytometry Facility team van het Duitse kanker onderzoekscentrum (DKFZ) voor hun steun.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De aanbevolen methode is eenvoudig te gebruiken en biedt een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare meting van de DNA-schade respons inclusief dubbele-strand break (DSB) inductie en reparatie, celcyclus effecten en apoptotische celdood. De combinatie van deze eindpunten biedt een vollediger beeld van hun onderlinge relaties dan individuele assays. De methode kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op het gebied van stralings biologie, therapie en bescherming, en meer in het algemeen i...

Het doel van oncologie is om kankercellen te doden of te deactiveren zonder de normale cellen te schaden. Veel therapieën induceren direct of indirect genotoxische stress in kankercellen, maar ook bij sommige zich uitstrekken in normale cellen. Chemotherapie of gerichte geneesmiddelen worden vaak gecombineerd met radiotherapie om de radio gevoeligheid van de bestraalde tumor1,2,3,4,5te verbeteren, wat een reductie van de stralingsdosis om normale weefselbeschadiging te minimaliseren.
Ioniserende straling en andere genotoxische middelen induceren verschillende soorten DNA-schade, waaronder basis modificaties, strand verknopingen en enkel-of dubbel strand pauzes. DNA Double-strand Breaks (DSBs) zijn de ernstigste DNA laesies en hun inductie is de sleutel tot het celdodende effect van ioniserende straling en diverse cytostatica in radio chemotherapie. Dsbs schaden niet alleen de integriteit van het genoom, maar bevorderen ook de vorming van mutaties op6,7. Daarom hebben verschillende DSB-reparatie trajecten en mechanismen om onherstelbaar beschadigde cellen zoals apoptosis te elimineren tijdens de evolutie ontwikkeld. De gehele DNA-schade respons (DDR) wordt gereguleerd door een complex netwerk van signalerings trajecten die reiken van DNA-schade herkenning en celcyclus arrestatie om DNA-herstel mogelijk te maken, tot geprogrammeerde celdood of inactivatie in geval van reparatie storing8.
De gepresenteerde Flow-cytometrische methode is ontwikkeld om de DDR na genotoxische stress te onderzoeken in een uitgebreide test die de inductie en reparatie van DSB dekt, evenals de gevolgen van herstel fouten. Het combineert de meting van de veeltoegepaste DSB marker γH2AX met analyse van de celcyclus en inductie van apoptosis, met behulp van klassieke subG1 analyse en specifiekere evaluatie van caspase-3 activering.
De combinatie van deze eindpunten in één assay vermindert niet alleen de tijd, arbeid en kosten uitgaven, maar maakt ook de celcyclus-specifieke meting van DSB inductie en reparatie, evenals caspase-3 activering. Dergelijke analyses zijn niet mogelijk met onafhankelijk uitgevoerde testen, maar ze zijn zeer relevant voor een uitgebreid begrip van de DNA-schade respons na genotoxische stress. Veel anti-kanker drugs, zoals cytostatische verbindingen, zijn gericht tegen het verdelen van cellen en hun efficiëntie is sterk afhankelijk van de fase van de celcyclus. De beschikbaarheid van verschillende DSB reparatie processen is ook afhankelijk van de celcyclus fase en traject keuze die essentieel is voor de reparatie nauwkeurigheid, en op zijn beurt bepaalt het lot van de cel9,10,11, 12. Bovendien is celcycle-specifieke meting van DSB-niveaus nauwkeuriger dan gepoolde analyse, omdat DSB-niveaus niet alleen afhankelijk zijn van de dosis van een genotoxische verbinding of straling, maar ook van het DNA-gehalte van de cel.
De methode is gebruikt om de werkzaamheid van verschillende radio therapieën te vergelijken om de resistentiemechanismen in multiform glioblastoom13 te overwinnen en het samenspel tussen ioniserende straling en gerichte geneesmiddelen in Osteosarcoom te ontleden14,15 en atypische teratoïde rhabdoïde kankers16. Bovendien is de beschreven methode op grote schaal gebruikt voor het analyseren van bijwerkingen van radio-en chemotherapie op mesenchymale stamcellen17,18,19,20,21, 22,23,24, die essentieel zijn voor de reparatie van de behandeling veroorzaakte normale weefselbeschadiging en een mogelijke toepassing in regeneratieve geneeskunde.

<table><tbody><tr><td>1,000 &micro;L filter tips</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &micro;L pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 &micro;m mesh pore size</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L filter tips</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro;L pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Los op in water bij 200 &micro;g/mL en bewaar aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>Verdun 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Verdun 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSClean solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>Voor cytometer reiniging routine na meting</td></tr><tr><td>BD FACSRinse solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Voor cytometer reiniging routine na meting</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>Los op in water tot 1x concentratie</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Excel software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (fetal bovine serum)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol</td></tr><tr><td>FlowJo v10 software</td><td>LLC</td><td>online bestellen</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Inbedmedium voor optionele bereiding van microscopische preparaten van gekleurde monsters</td></tr><tr><td>Folded cellulose filters, grade 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII or LSRFortessa cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>Optioneel medicijn voor apoptose positieve controle</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>Bereid verse 4,5% oplossing. Verdun in PBS door te verwarmen tot 80 &deg;C met langzaam roeren onder de afzuigkap. Bedek de flacon met aluminiumfolie om warmteverlies te voorkomen. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en pas het eindvolume aan. Laat de oplossing door een cellulosefilter passeren.</td></tr><tr><td>Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor&reg; 555 Conjugate) RRID: AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>Verdun 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>Optioneel medicijn voor apoptose positieve controle</td></tr><tr><td>T25 cell culture flasks</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>Routine celkweek materiaal voor de voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol</td></tr><tr><td>U87 MG glioblastoma cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Voorbeeldcellijn gebruikt in het protocol</td></tr></tbody></table>

celcyclus-specifieke meting van γh2ax en apoptosis na genotoxische stress door flow cytometrie

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

De gepresenteerde methode of licht gewijzigde versies zijn bedacht om specifieke behandelings responsen en bijwerkingen van verschillende anti-kankerbehandelingen te bestuderen, zoals gebruikt in de klinische oncologie. Het maakt een kwantitatieve en longitudinale analyse van de DNA-schade reactie mogelijk na genotoxische stress, zoals geïnduceerd door radiotherapie en een veelheid aan anti-kanker drugs. De methode dekt alle stadia van de DNA-schade reactie, het verstrekken van eindpunten voor inductie en reparatie van DNA dubbel strand Breaks (DSBs), arrestatie van de celcyclus en celdood door Apoptosis in geval van herstel falen. Het combineren van deze metingen geeft informatie over de celcyclus afhankelijke behandelingseffecten en maakt zo een grondige studie mogelijk van de wisselwerking tussen cellulaire proliferatie en het omgaan met DNA-beschadiging. Aangezien het effect van veel kankertherapieën, waaronder chemotherapeutische middelen en ioniserende straling, beperkt is tot of sterk varieert naargelang de specifieke celcyclus fasen, vertrouwen correlatieve analyses op een robuuste en haalbare methode om de behandelingseffecten te beoordelen op het DNA in een celcyclus-specifieke manier. Dit is niet mogelijk met assays met één eindpunt en een belangrijk voordeel van de gepresenteerde methode. De methode is niet beperkt tot een bepaalde cellijn en is grondig getest in een veelheid van tumor en normale weefsel cellijnen. Het kan op grote schaal worden toegepast als een uitgebreide genotoxiciteitstest op vele gebieden van oncologie naast radio-oncologie, waaronder milieueffectbeoordeling, geneesmiddelen screening en evaluatie van genetische instabiliteit in tumorcellen.

Humane U87 of LN229 multiform glioblastoom cellen werden bestraald met 4 GY foon of koolstofionstraling. Celcyclus-specifieke γH2AX niveaus en apoptosis werden gemeten op verschillende tijdstippen tot 48 uur na bestraling met behulp van de hier gepresenteerde Flow cytometrische methode (Figuur 3). In beide cellijnen induceerde koolstofionen hogere γH2AX piek niveaus die langzamer daalden en bleven significant verhoogd bij 24 tot 48 h vergeleken met fotopstraling bij dezelfde fysieke dosis (<...

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

De methode biedt informatie over celcyclusafhankelijke behandelingseffecten en maakt het mogelijk om het samenspel tussen cellulaire proliferatie en copingmechanismen tegen DNA-schade en diepgaande studie mogelijk te maken. Deze methode combineert belangrijke eindpunten van de DNA-schade respons met inbegrip van double-streng frag erkenning en reparatie, cel cyclus effecten, en uiteindelijke cel dood door apoptose in een uitgebreide test. We hebben deze techniek voornamelijk gebruikt om specifieke behandelingsreacties en bijwerkingen van radiochemotherapeutische behandelingen in klinische oncologie te onderzoeken.De test is zeer nuttig voor correlatieve studies op het gebied van radiobiologie en radiotherapie, maar het kan ook worden toegepast op verschillende andere gebieden van oncologie. Na het verzamelen van de cellen uit de cultuur volgens standaard cel collectie procedures, resuspend de pellet in een milliliter van PBS. En breng de cellen over in twee milliliter fixatieoplossing in een kap.Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur, verzamel de cellen door centrifugatie en decanteer de supernatant. Het is belangrijk om de cellen vast te stellen als een enkele cel suspensie, en om de fixatie tijd constant te houden voor alle monsters. Geef aanhangende cellen genoeg tijd om los te maken om mooi afgeronde cellen te verkrijgen voor analyse.Maak vervolgens de pellet los door de cellen af te tappen en opnieuw op te hangen in drie milliliter ethanol van 70%. Om de cellen te wassen voor het beitsen, sediment de cellen door centrifugatie, en los de pellet door te tikken. Dan resuspend de cellen met twee opeenvolgende wasbeurten met drie milliliter wasoplossing en één was met één milliliter wasoplossing.Gooi de supernatant tussen elke was. Na de laatste wasbeurt, zorgvuldig aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet en resuspend de lucent pellet in 100 microliters van de antilichaam cocktail van belang. Na een uur bij kamertemperatuur, verzamel de cellen door centrifugatie en zorgvuldig aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet.Dan, resuspend de losgemaakte pellet in 100 tot 250 microliter van DNA-kleuroplossing en de cellen af te geven via de cel zeef dop van een monster buis met een 35 micrometer mesh porie grootte. Als u de cellen wilt analyseren op stroomcytometrie, opent u het tabblad parameters in het cytometervenster en selecteert u de parameters zoals aangegeven in de tabel. Open vervolgens het werkbladvenster en maak plots zoals aangegeven.Laad een controlemonster op de cytometer en druk op de run-knop. Selecteer de eerste buis in het browservenster en klik op de naam van de buis. Pas de detectorspanningen aan voor voorwaartse en zijverstrooiing en DAPI in het parameterstabblad van het inspecteurvenster.Druk op de stand-byknop om door te gaan met de werkbladinstelling in de software. Gebruik het gereedschap veelhoekpoort om de populatie van de cellen in het voorwaartse spreidingsgebied ten opzichte van de perceel van het zijverstrooiingsgebied te definiëren en gebruik het gereedschap rechthoekpoort om de populatie van de afzonderlijke cellen in de DAPI te definiëren met versus DAPI-gebiedsplot. Druk op control G om de bevolkingshiërarchie weer te geven en klik op de standaardpoortnamen om de naam ervan te wijzigen.Klik vervolgens met de rechtermuisknop op alle histogrammen om tonen populaties en enkele cellen in het contextmenu te selecteren. Verwerf controle en behandelde monsters om de detectorspanningen voor de met antilichamen gekoppelde fluoroforen te optimaliseren om het volledige dynamische signaalbereik te dekken. Om de monsters te meten, drukt u op de run-knop op de cytometer en gebruikt u het acquisitiedashboard in de software om de monsters te meten.Selecteer vervolgens bestands-, export- en experimenten om directoryexport in het dialoogvenster te selecteren om de gegevens op te slaan als punt FCS-bestanden. Als u de gegevens wilt evalueren, sleept en dropt u de FCS-bestanden in de voorbeeldbrowser van de cytometrische analysesoftware flow. En gebruik het veelhoekgereedschap om de populatie van de cellen in het perceel van het voorwaartse versus zijverstrooiingsgebied te definiëren en om puin uit te sluiten van de analyse.Gebruik in de plot van de DAPI met versus DAPI-gebied het gereedschap rechthoek om de populatie van de afzonderlijke cellen te definiëren en om celditten of klonten uit te sluiten van de analyse. Gebruik in het DAPI-gebied histogram het bisectorgereedschap om enkele cellen met een normaal DNA-gehalte te onderscheiden van apoptotische cellen met afgebroken DNA. Selecteer gereedschapsbiologie en celcyclus om het gereedschap celcyclusmodellering te openen en selecteer Dean-Jett Fox om de frequentie van cellen in de twee M-fasen G en G te schatten.Maak G één S- en G-fasepoorten in de DAPI met versus DAPI-gebiedsperceel van de celcycluspopulatie om een celcyclusspecifieke gamma H twee A X-meting mogelijk te maken. Gebruik het bisectorengereedschap om fosfosssteen H drie positieve en negatieve cellen te onderscheiden in het Alexa 555-gebiedssenthogram van de celcycluspopulatie en om CAS-basis drie positieve en negatieve cellen te onderscheiden in het Alexa 647-gebiedsfitogram van de populatie van de enkele cellen. Druk op control T om de tabeleditor te openen en de tabel te configureren zoals aangegeven.Selecteer vervolgens Naar Bestand om de indeling en bestemming in te stellen in de uitvoersectie van het menulint en exporteer de gegevens naar een spreadblad. Koolstofionen veroorzaken hogere gamma H twee AX piekniveaus in glioblastoomcellen die langzamer dalen en aanzienlijk verhoogd blijven in 24 tot 48 uur in vergelijking met fotonstraling bij dezelfde fysieke dosis. Voor zowel koolstofionen als fotonstraling, de gamma H twee AX niveaus waren het hoogst in G een fase cellen waarschijnlijk omdat DNA dubbele streng breuk reparatie is beperkt tot het pad van niet-homologeuze einde toetreden in dit stadium in de celcyclus.In lijn met de hogere dubbele streng breuk inductie snelheid en langzamere reparatie kinetiek, koolstofionen induceren een sterkere en langduriger celcyclus arrestatie in G twee fase en een hoger percentage van apoptose dan doen fotonen. Afhankelijk van de sterkte van het behandelingseffect kan de resolutie van de verschillende celcyclusfasen uitdagend zijn. In sommige cellijnen heeft de DAPI-concentratie een grote invloed op de kwaliteit van het celcyclusprofiel en moet deze worden aangepast.Dia's kunnen worden voorbereid uit de resterende monsters na de stroom cytometrie om het aantal, de grootte en de vorm van gamma H twee AX foci te evalueren en onderscheid te maken tussen focal en parnuclear gamma H twee AX-kleuring. Met behulp van onze methode kunnen we aantonen dat mesenchymale stamcellen relatief resistent zijn tegen ioniserende straling en topoisomerase remming, maar gevoelig voor gliomyacine. Aangezien PFA-dampen giftig zijn, gebruikt u altijd een rookkap bij het voorbereiden van de fixatieoplossing en tijdens de fixatiestap.Vergeet ook niet om handschoenen te dragen bij het hanteren van DAPI.

cell-cycle-specific-measurement-h2ax-apoptosis-after-genotoxic-stress

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

In this video, we describe the immunofluorescence microscopy technique to detect specific DNA damage response proteins localized at the sites of DNA double-strand breaks in human mononuclear cells. The proteins are recognized by specific primary antibodies, which in turn bind to fluorophore-tagged secondary antibodies that fluoresce during microscopic visualization, enabling visualization of the proteins as distinct fluorescent foci within the cell nuclei.

Immunofluorescence Microscopy for the Analysis of DNA Double-Strand Breaks

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Een protocol om veranderingen in DNA-schadeniveaus en DNA-reparatievermogen te evalueren die kunnen worden geïnduceerd door chronische in vivo lage dosis bestraling in muis miltlymfocyten, door gemeten gefosforyleerd histon H2AX, een marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken, met behulp van flowcytometrie wordt gepresenteerd.

Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische<em&gt; In Vivo</em&gt; Blootstelling aan zeer lage doses van bèta en gamma-straling

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit protocol presenteert de diavoorbereiding en geautomatiseerde scoring van de γ-H2AX foci assay op perifere bloedlymfocyten. Om de methode en gevoeligheid van de test te illustreren, werden geïsoleerde lymfocyten in vitrobestraald . Deze geautomatiseerde methode van DNA DSB-detectie is nuttig voor snelle en high-throughput biologische dosimetrietoepassingen.

Een geautomatiseerde microscopische scoringsmethode voor de γ-H2AX foci assay in menselijke perifere bloedlymfocyten

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

Hier presenteren we een eenvoudig en snel protocol voor de detectie van eiwitinteractie op DNA-schadeplaatsen.

Nabijheidsligandtest om eiwitten te lokaliseren op plaatsen van DNA-schade

Leer celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptose na genotoxische stress door flowcytometrie. Deze methode combineert DNA-dubbelstrengsbreukanalyse met celcyclusdistributie voor onderzoek naar behandelingseffecten in radiobiologie en oncologie.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

Meer video's verkennen