Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Parasponia is een tropische boom uit de cannabisfamilie die in staat is om een stikstofbindende symbiose met rhizobium vast te stellen. Vergelijkende studies tussen Parasponia en peulvruchten kunnen inzicht geven in de kerngeneeskundige netwerken die ten grondslag liggen aan rhizobiumsympiose. Met dit protocol kunnen Parasponia andersonii stabiele transgene mutantlijnen worden gegenereerd in een periode van twee tot drie maanden.

Deze lijnen kunnen efficiënt worden gepropageerd door middel van in vitro propagatie. Dit protocol biedt een experimenteel platform om wortelmoïde symbiose te bestuderen, evenals andere aspecten van de biologie van deze tropische boom. Basisvaardigheden in weefselkweek en moleculair klonen zijn voldoende om dit protocol uit te voeren.

Hierdoor kan elk laboratorium Parasponia aanpassen als onderzoeksmodel. De promovendi Titis Wardhani en Yuda Roswanjaya demonstreren samen met Marijke Hartog, een technicus in ons lab. Om parasponia andersonii bomen te kweken, begin met het ontkiemen van de zaden.

Verwijder de zaden van Parasponia bessen door te wrijven tegen de binnenkant van een theezeef of pletten ze op een stuk tissue papier. Desinfecteren zaden met behulp van 4%hypochloriet bleekmiddel gedurende 15 tot 20 minuten, en dan was de zaden zes keer met gesteriliseerd water. Breng de zaden naar steriele 200 microliter PCR buizen, en vul de buizen met gesteriliseerd water om de zaden onder te dompelen.

Broed de buizen gedurende 10 dagen in een thermocycler volgens de hand van het manuscript. Na de 10-daagse incubatie, breng de zaden naar SH-0 platen, en sluit ze met twee lagen elastische afdichting folie om te voorkomen dat drogen. Broed op 28 graden Celsius met een 16-uur-dag, acht uur-nacht cyclus voor drie tot vier weken.

Zodra de zaailingen ontwikkelen hun eerste set van echte bladeren, breng ze naar potten gevuld met commerciële potgrond, en bedek ze met een doorschijnende plastic beker om uitdroging te voorkomen. Plaats de potten in een 28-graden Celsius, 85% relatieve vochtigheid klimaat kamer of kas onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime. Na een week, verwijder de plastic beker.

Regelmatig water de potten, en aan te vullen met kunstmest te ondersteunen boomgroei. Bereid je voor op transformatie door jonge takken van vijf tot acht centimeter uit de kasgegroeide bomen te oogsten, om ervoor te zorgen dat alleen gezonde, niet-geïnfecteerde takken worden gebruikt. Snijd de bladeren, waardoor een centimeter in het kwadraat van bladweefsel aan het einde van elke petiole.

Desinfecteer het weefsel gedurende 15 minuten met 2%hypochloriet bleekmiddel met een paar druppels polysorbaat 20 en spoel het vervolgens acht keer af met autoclaved water. Re-suspend Agrobacterium cellen in 25 milliliter van infiltratie medium tot een optische dichtheid van ongeveer vijf. Snijd de steel en het petioleweefsel in stukken van één centimeter in de celsuspensie.

Verwijder de bladweefsels en ontcubeer de stengel en petiole stukken in de cel suspensie gedurende 10 tot 30 minuten. Droog de weefsels stukken op een steriel stuk filter papier en leg ze op beworteling medium bereid volgens manuscript richtingen. Broed de platen in het donker op 21 graden Celsius voor twee dagen.

Inspecteer na de twee dagen de platen op schimmel- of bacteriële besmetting en gooi verontreinigde platen weg. Breng de weefselstukken over op 10 milliliter SH-10 medium bereid volgens de handschriftaanwijzing. Laat het weefsel in het medium voor ten minste 10 minuten, en zachtjes roeren om de twee tot drie minuten te wassen.

Bereid beworteling medium met cefotaxime en kanamycine volgens het manuscript richtingen, en giet platen. Droog de weefsels op steriele stukken filterpapier en breng ze over naar de platen. Zeven dagen lang incubeerplaten bij 28 graden Celsius onder een 16-uurs-dag, acht uur-nacht regime.

Controleer platen op schimmel of bacteriële besmetting om de twee dagen. Als er besmetting optreedt, breng de niet-geïnfecteerde weefselstukken over op een verse plaat. Na zeven dagen, breng de weefselstukken naar vermeerdering medium bereid volgens manuscript richtingen en uitbroeden op 28 graden Celsius onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime.

Verfris de platen eenmaal per week tot transgene scheuten zich ontwikkelen, zodat niet-geïnfecteerde weefselstukken alleen naar nieuwe platen worden overgebracht. Zodra de vermeende transgene scheuten zijn ten minste een centimeter lang, snijd de scheuten en cultuur ze onafhankelijk in vermeerdering medium met antibiotica. Om ervoor te zorgen dat de scheuten onafhankelijke transformanten vertegenwoordigen, neem slechts een enkele shoot van elke kant van een explant.

Propager het weefsel door het plaatsen van ongeveer 10 scheuten op een verse plaat van vermeerdering medium en het sluiten van de plaat met twee lagen elastische afdichting folie. Broed de platen op 28 graden Celsius onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime, en herhaal deze stap om de vier weken. Wanneer de scheuten bereiken een centimeter in lengte, snijd ze op hun basis en plaats ze op het beworteling medium.

Plaats de scheuten rechtop door het inbrengen van de basale punt van de shoot in het medium. Ongeveer 10 scheuten kunnen op één plaat worden geplaatst. Begin met het bereiden van rhizobium entmateriaal.

Inoculeren 10 milliliter vloeibaar YEM-medium uit een enkele kolonie Mesorhizobium plurifarium BOR2 en twee dagen lang incubeer bij 28 graden Celsius. Gebruik deze cultuur om een groter volume vloeibaar YEM-medium in te enten. Eenmaal gegroeid, centrifugeren de bacteriële cultuur gedurende 10 minuten op 3, 500 keer g om de cellen te oogsten.

Schort de bacteriële pellet opnieuw op in vloeibaar EKM-medium en bepaal de optische dichtheid. Bereid drie liter EKM medium, dat is genoeg voor ongeveer 20 potten, en inenten met de wortelvwinnende suspensie. Meng het medium met 1,25 kilogram perliet en voeg 210 gram van dit mengsel toe aan steriele doorschijnende polypropyleenpotten.

Plant een tot drie Parasponia andersonii plantenbakken aan elke pot, en bereiden verschillende potten met plantenvormen getransformeerd met de controle construeren. Weeg een aantal van de potten, en bedek de onderkant van elke pot om de wortels te beschermen tegen blootstelling aan licht. Broed de potten in een geklimatiseerde groeiruimte bij 28 graden Celsius onder een 16-uur-dag, acht uur-nacht regime voor vier tot zes weken.

Een keer per week, wegen verschillende potten om waterverlies te bepalen. Als het waterverlies meer dan 10 milliliter bedraagt, vul dan aan met ultrazuiver water om het verlies te compenseren. Na de incubatie, reinig de wortels van perliet, en bepalen knobbelnummers met behulp van een verrekijker.

Deze techniek is gebruikt om bloemblaadjes en segmenten van Parasponia andersonii stengels succesvol te transformeren met Agrobacterium stam AGL1. Ten eerste worden de weefselexplants gedurende twee dagen samen met Agrobacterium gecultiveerd. Langdurige co-teelt resulteert in bacteriële overkolonisatie en moet worden voorkomen.

Een paar weken later worden kleine groene micro-calli waargenomen langs het oorspronkelijke wondoppervlak. Deze calli blijven groeien en ontwikkelen een of meer putatief getransformeerde scheuten op zes tot acht weken na het begin van de transformatie. Transformatie-efficiëntie varieert van 10 tot 30% voor weefselexplants van volwassen takken tot 65 tot 75% voor weefselexplants uit jonge en snel groeiende takken.

Transgene scheuten kunnen worden vermenigvuldigd door middel van in vitro propagatie, die binnen een maand tot tientallen scheuten leidt. Deze scheuten kunnen worden geplaatst op beworteling medium dat wortelvorming zal induceren in ongeveer twee weken en opbrengst planten die kunnen worden gebruikt voor experimenten. Bij het starten van een stabiel transformatie-experiment is het belangrijk om gezonde takken als bronmateriaal te selecteren.

Parasponia T0 transgene lijnen worden in vitro gepropageerd. Daarom is het essentieel om grondig genotype Parasponia transgene lijnen. De oprichting van Parasponia als experimenteel model maakt vergelijkende analyse mogelijk tussen twee verre verwante nodulating lineages, Parasponia en peulvruchten.

Dit zou kunnen identificeren behouden genetische netwerken die ten grondslag liggen aan rhizobium symbiose. Parasponia kan ook een waardevol model zijn om andere onderzoeksonderwerpen te bestuderen, zoals houtvorming, de ontwikkeling van biseksuele bloemen of de biosynthese van Cannabaceae-specifieke secundaire metabolieten.