Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

Onze methode is een van de eersten die in staat zijn om de genetische grondslagen van trait verschillen te ontleden op een genoom-brede schaal tussen soorten in plaats van binnen soorten. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge doorvoer, hoge resolutie, en op grote schaal toepasbaar. Om te beginnen met deze procedure, haal de JR507 vriezer voorraad stam uit de opslag op min 80 graden Celsius, en streep het uit naar enkele kolonies op een YPD agar plaat.

Broed op 26 graden Celsius gedurende twee dagen of tot er kolonies verschijnen. Dan inenting 100 milliliter vloeibare YPD in een 250 milliliter glazen kolf met een enkele kolonie van JR507, en incubeer bij 28 graden Celsius tijdens het schudden op 200 RPM gedurende 24 uur of tot stationaire fase is bereikt. De volgende dag, meet de od600 van de nachtelijke cultuur.

Terug verdunnen een deel van de nachtelijke cultuur met verse vloeibare YPD in een nieuwe een liter kolf om een nieuwe cultuur te creëren met een od600 van nul punt twee en een volume van 500 milliliter. Herhaal dit proces nog drie keer om een totaal van vier culturen te creëren met een od600 van nul punt twee, met dezelfde nachtcultuur voor alle nieuwe culturen. Incubeer alle culturen op 28 graden Celsius gedurende zes uur tijdens het schudden op 200 RPM.

Combineer hierna twee van de 500 milliliter culturen om een een liter cultuur te creëren. Combineer de resterende twee 500 milliliter culturen om een tweede een liter cultuur te creëren. Splits elk van de een liter culturen in 20 50 milliliter aliquots elk in een plastic conische buis voor een totaal van 40 buizen.

Zet 20 buizen opzij. Centrifugeren de resterende 20 buizen op 1000 keer G gedurende drie minuten om de gistcellen pellet. Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet met 25 milliliter steriel water door vortexing.

Centrifuge op 1000 keer G gedurende drie minuten. Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet met vijf milliliter 1X Tris-EDTA nul punt een Molar lithiumacetaat buffer door vortexing. Centrifuge op 1000 keer G gedurende drie minuten.

Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet opnieuw met vijf milliliter 1X Tris-EDTA nul punt een Molar lithiumacetaat buffer door vortexing. Centrifuge op 1000 keer G gedurende drie minuten. Terwijl de cellen centrifugeren, bereid ten minste 120 milliliter van een oplossing met polyethyleenglycol, lithiumacetaat en Tris-EDTA buffer.

Bewaar deze oplossing op ijs. Om het plasma-DNA voor te bereiden op transformatie, kook eerst vier milliliter zalm sperma DNA op 100 graden Celsius gedurende vijf minuten. Daarna koel je het onmiddellijk vijf minuten af op het ijs.

Meng 20 milliliter pJR487 bij een concentratie van 538 nanogram per milliliter met vier milliliter van het koude zalmsperma DNA. Houd dit mengsel op ijs tot klaar voor gebruik. Voeg vervolgens 600 microliter van het plasma- en sperma-DNA-mengsel toe bovenop elke celpellet.

Voeg drie milliliter van het PEG lithium acetaat TE mengsel toe aan elke pellet. We hangen op door op en neer te pipetten en dan te wervelen. Broed de buizen 10 minuten op kamertemperatuur.

Vervolgens warmte schok elke buis in een waterbad op 39 graden Celsius gedurende 26 minuten, zorg ervoor dat elke buis om te keren om de paar minuten. Centrifugeren de buizen op 1000 keer G gedurende drie minuten. Gooi de supernatant, en resuspend elke pellet in 10 milliliter van YPD door vortexing.

Combineer hierna alle 20 buizen in een nieuwe glazen kolf. Voeg 433 punt vier milliliter vloeibare YPD in een nieuwe een liter glazen kolf. Breng vervolgens 66 punt zes milliliter cellen in de kolf.

Herhaal dit overdrachtsproces nog twee keer om het volledige volume van getransformeerde cellen te gebruiken. Meet dan de od600 van elke nieuwe 500 milliliter cultuur. Incubeer alle drie culturen op 28 graden Celsius gedurende twee uur tijdens het schudden op 200 RPM.

Voeg hierna nulpunt vijf milliliter van 300 milligram per microliter G418 toe aan elk van de kolven tot een uiteindelijke concentratie van 300 microgram per milliliter. Breng de kolven terug naar de schuddende couveuse bij 28 graden Celsius en 200 RPM. Herhaal dit hele proces met de resterende 20 conische buizen.

Op dit punt moeten er zes flessen van één liter zijn, elk met 500 milliliter cellen met G418 toegevoegd. Incubeer alle zes kolven bij 28 graden Celsius met schudden op 200 RPM gedurende ongeveer twee dagen of tot een od600 van ongeveer twee punt drie is bereikt in elke kolf. Combineer vervolgens alle zes de kolven samen om één cultuur te creëren.

Gebruik deze gecombineerde cultuur om twee nieuwe een liter kolven met 500 milliliter YPD en G418 inenten tot een od600 van nul punt twee. Broed deze nieuwe culturen 's nachts bij 28 graden Celsius met schudden op 200 RPM totdat het een od600 van ongeveer twee punt twee bereikt. Combineer hierna beide culturen tot één cultuur en meet de od600 van de gecombineerde cultuur.

Centrifuge 25 milliliter van deze cultuur op 1000 keer G gedurende drie minuten. Bereken het aantal totale od600-eenheden cellen in de 25 milliliter zoals beschreven in het tekstprotocol. Gooi de supernatant, en resuspend de cellen in genoeg water om een cel suspensie te creëren met een od600 van een punt acht vijf per milliliter.

Met behulp van glazen kralen, plaat een milliliter van geresuspended cellen op elk van 12 grote, vierkante complete synthetische agar platen met 5-FOA. Incubeer elke plaat op 28 graden Celsius gedurende een tot twee dagen, of totdat een gazon vormen op de plaat. Gebruik vervolgens kleine steriele squeegees om de cellen van de helft van de plaat af te schrapen, en in een buis, met 35 milliliter steriel water.

Herhaal dit proces voor de resterende zes platen, wat resulteert in twee buisjes cellen in water. Combineer de celsuspensies in een enkele kolf en meet de od600 van de suspensie, met behulp van water als een blanco. Gebruik water om de celconcentratie aan te passen tot de od600 44 punt vier per milliliter bereikt.

Bereid vervolgens de vriesvoorraden cellen voor en bewaar ze bij min 80 graden Celsius, zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie worden S.Cerevisiae en S.Paradoxus gekoppeld tot een steriele hybride, die wordt omgezet op mutagenesis. Elke gemutageniseerde kloon is een hemizygote, een diploïde hybride waarin een allel van één gen wordt verstoord.

De hemizygotes worden op hoge temperatuur geconcurreerd en het DNA is geïsoleerd van elke cultuur. Het DNA is shirred en ligated aan adapters, en de verbinding tussen de transposon en het genoom wordt versterkt met een transposon-specifieke primer en een adapter-specifieke primer. Het optellen van bulk sequencing lezen telt van de amplicon, verslag van de geschiktheid van een kloon in de bevolking.

Met de resultaten in de hand van deze volgorde, de hemizygote overvloeds voor een bepaald gen, kan worden vergeleken bij de twee temperaturen tussen twee klassen van hemizygotes. Klonen waar alleen de S.Cerevisiae allel was wild type en functioneel, en klonen alleen vertrouwen op de S.Paradoxus allel. Bij deze representatieve implementatie worden sterke signalen gedetecteerd bij acht huishoudgenen.

In elk geval, transposon inserties in de S.Cerevisiae allel in de hybride, gecompromitteerd groei bij hoge temperatuur. Deze low-si vertegenwoordigde kandidaat determinanten van de thermotolerance eigenschap die S.Cerevisiae onderscheidt van S.Paradoxus. Nu we dit experiment hebben voltooid, kunnen we andere eigenschappen ontleden die verschillen tussen deze soorten, zoals koude of zouttolerantie.