Name: Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer efficiënte CRISPR/Cas9-genoombewerking in muizenhematopoëtische stamcellen met lentivirale transductie. Deze methode versnelt het creëren van kosteneffectieve muismodellen voor hematopoëtisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. S. werd gesteund door een Amerikaanse hart vereniging Postdoctoral Fellowship 17POST33670076. K. W. werd ondersteund door NIH subsidies R01 HL138014, R01 HL141256, en R01 HL139819.

Alle procedures met betrekking tot dierproef personen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Virginia.
1. opwekking en zuivering van lentivirusdeeltjes
Opmerking: Lentivirusdeeltjes met de geoptimaliseerde handleiding RNA kunnen worden geproduceerd door de gedetailleerde protocollen die door Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. De geoptimaliseerde methoden voor de bereiding en opslag van hoogtiter lentivirus worden elders besproken17,18. In het kort, linvirussen worden geproduceerd door co-transfectie van een lentivirus vector plasmide, psPAX2, en pMD2. G in HEK 293T cellen. Cultuur supernatant wordt verzameld op 48 h post-transfectie en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Lentivirale titer wordt bepaald door een in de handel verkrijgbare test op basis van qPCR. Deze procedure moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid-klasse II-kast.
<ol><li>Bereid een 1:200-oplossing van collageen (0,0005%) in 1x PBS.</li>
	<li>Jas een 6 goed bord met collageen oplossing en incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor ~ 30 min.</li>
	<li>Zaad 293T cellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen per put en incuberen bij 37 °c, 5% Co2 voor ~ 2 h.</li>
	<li>Om het mengsel van drie transfectie plasmiden voor een put voor te bereiden, combineer 0,9 μg lentivirusvector, 0,6 μg psPAX2 en 0,3 μg pMD2. G, dan een totaal volume van 10 μL te bereiken door toevoeging van gedeïoniseerd water. Pas de bedragen dienovereenkomstig aan, afhankelijk van het aantal putten. De hoeveelheid en de ratio van elk plasmide moet mogelijk verder worden geoptimaliseerd om aan de behoeften van de onderzoekers te voldoen.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 50 μL van 1x PBS en 5 μL van de verdunde PEI MAX (1,0 mg/mL) toe aan het plasmide mengsel en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) (tabel 1).</li>
	<li>Voeg 1 mL DMEM toe aan het mengsel.</li>
	<li>Aspirate media uit de 6 goed plaat, voeg 1 mL plasmide mengsel, en incuberen bij 37 ° c, 5% CO2 voor ~ 3 h.</li>
	<li>Vervang de media door 2 ml verse DMEM en Incubeer bij 37 °c, 5% Co2 voor 24 uur.</li>
	<li>Voeg 1 mL verse DMEM toe en incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor een extra 24 uur (totale incubatietijd is 48 uur).</li>
	<li>Breng de kweek supernatant over naar een buis van 50 mL en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 15 minuten om vrije zwevende cellen te verwijderen.</li>
	<li>Filtreer de supernatant door een 0,45 μm filter.</li>
	<li>Breng het filtraat over in polypropyleen centrifugebuizen.</li>
	<li>Ultracentrifuge bij 4 °C en 72.100 x g bij rMax voor 3 uur.</li>
	<li>Zuig de supernatant voorzichtig op en laat de witte pellet achter.</li>
	<li>Respendeer de pellet met 100 μL serumvrij hematopoietische celuitbreidingsmedium zonder beluchting.</li>
	<li>Houd een aliquot van 10 μL om de virale titer te meten en bewaar alle overgebleven aliquots bij-80 °C tot dat nodig is.</li>
	<li>Titeer het virus met een qPCR-gebaseerde test volgens de instructies van de fabrikant met behulp van de 10 μL virale aliquot.</li>
</ol>2. isolatie en transductie van Lineage-negatieve cellen uit het beenmerg van de muis (Figuur 1a)
Opmerking: om voldoende cellen te isoleren, worden paren van tibias, femurs en humeri van elke muis geoogst. Bekken-en spinale botten kunnen ook worden geoogst als een bron van Lineage-negatieve cellen.
<ol><li>Isolatie van beenmergcellen<ol>
<li>Euthanize 8-10 week oude mannelijke crispr/Cas9 knock-in muizen door 5% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie, desinfecteren hun huid met 70% ethanol.</li>
		<li>Met behulp van ontleden schaar, maak een dwarse incisie in de huid net onder de ribbenkast en schil de huid in beide richtingen in een distale richting om de benen en armen bloot te leggen.</li>
		<li>Scheid de onderste ledematen voorzichtig van het heupbeen door het heupgewricht te ontlokaliseren. Snijd langs de dijbeen kop om het dijbeen volledig uit de heup te verwijderen. Ontwer de knie en snijd op het gewricht om het dijbeen en de Tibia te scheiden, terwijl het bot Epifyse intact blijft. Ontwer het enkelgewricht en Pel de voet en extra spieren weg.</li>
		<li>Met behulp van ontleden schaar, over de schouder te snijden om de bovenste ledematen los te maken. Ontwer de schouder en snijd vervolgens op het ellebooggewricht om het opperarmbeen-bot te oogsten.</li>
		<li>Gebruik cellulose-Fiber doekjes om de spieren van de femurs, tibias en humeri voorzichtig te verwijderen. Neem extra voorzorgsmaatregelen om ervoor te zorgen dat de botten niet breken tijdens dit proces.</li>
		<li>Plaats de geïsoleerde botten in een conische buis van 50 mL die RPMI bevat en plaats op ijs. Opmerking: de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid-klasse II-kast.</li>
		<li>Breng de botten over in een steriel, 100 mm kweekbakje.</li>
		<li>Pak het bot met stompe Tang en gebruik de ontleed schaar en snijd beide epifyses zorgvuldig. Opmerking: een ontoereikende snede zal leiden tot een onvolledige spoeling van beenmerg, terwijl overmatig agressief snijden zal resulteren in celverlies.</li>
		<li>Vul een injectiespuit van 10 mL met ijskoude RPMI en gebruik een naald van 22 G om het beenmerg van de as in een nieuw kweekbakje van 100 mm te spoelen. Opmerking: botten worden wit en doorschijnend als de botschacht goed is gespoeld. Zo niet, dan wordt het uiteinde van het bot opnieuw afgesneden en weer verzonken.</li>
		<li>Nadat al het beenmerg is verzameld, maak een eencellige suspensie door het beenmerg meerdere malen door te geven door middel van een 10 mL spuit met een 18 G naald. Herhaal 10x om een eencellige suspensie te garanderen.</li>
		<li>Filter celsuspensie door een 70 μm celzeef in een conische buis van 50 mL.</li>
		<li>Centrifugeer bij 310 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.</li>
		<li>Zuig de supernatant op en hervat de celpellets in een geschikt volume van geoptimaliseerde scheidings buffer voor het volgende celscheidings proces.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolatie en lentivirustransductie van Lineage-negatieve cellen Opmerking: muis Lineage-negatieve cellen worden geïsoleerd uit het beenmerg van Cas9 transgene muizen3, of andere stammen van muizen, met behulp van een lineage depletie-Kit volgens de instructies van de fabrikant. Typisch, lineage-negatieve cellen rekening voor 2%-5% van de gehele beenmerg nucleated cellen, en de zuiverheid is meestal groter dan 90% na isolatie. De geïsoleerde Lineage-negatieve cellen zijn gekweekt in serum-vrij hematopoietische celuitbreidingsmedium aangevuld met 20 ng/mL recombinant Murine TPO en 50 ng/mL recombinant Murine SCF, vervolgens getransduceerde met de lentivirus vector voor 16 h bij een veelheid van infectie (MOI) = 100.<ol>
<li>Om Lineage-negatieve cellen te isoleren, gebruikt u de Lineage Cell depletie Kit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Na isolatie respendeert de Lineage-negatieve cellen in 1 mL serumvrij hematopoietische celuitbreidingsmedium.</li>
		<li>Zaai de cellen in een 6-put plaat met een dichtheid van 1,5 x 106 cellen/ml (5 x 105 Lineage-negatieve cellen/muis.)</li>
		<li>Voeg recombinant Murine TPO en SCF toe aan putjes in de uiteindelijke concentraties van respectievelijk 20 ng/mL en 50 ng/mL.</li>
		<li>Pre-Incubate cellen bij 37 °C in 5% CO2 voor ~ 2 h.</li>
		<li>Voeg lentivirus toe aan MOI = 100, 4 μg/mL poly Brene, en penicillaire/streptomycine in de putjes en inincuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor 16-20 u (Figuur 1b).</li>
		<li>Verzamel de volgende dag de lentivirus getransduceerde cellen in een conische buis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 g.</li>
		<li>Zuig de supernatant voorzichtig op en breng de pellet in 200 μL RPMI per muis. Houd de cellen op RT tot transplantatie in muizen (rubriek 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. transplantatie van getransduceerde cellen in dodelijk bestraalde muizen
<ol><li>Plaats de ontvangende muizen op de dag van beenmergtransplantatie in een cirkel kooi met acht segmenten en stel ze bloot aan twee doses van hele lichaams bestraling (550 rad/dosis, totale dosis = 1100 RAD), met ongeveer 4 uur tussen elke bestraling.</li>
	<li>Injecteer na de tweede bestraling, met behulp van een insulinespuit (figuur 1c), de getransiteerde Lineage-negatieve cellen naar elke ontvanger van de verdoofd Mouse via de retroorbitale ader plexus (in totaal 200 μL).</li>
	<li>Na bestraling moeten muizen in gesteriliseerde kooien worden ondergebracht en voorzien van een zachte voeding en drinkwater, aangevuld met antibiotica voor 14 d.</li>
	<li>Bij 3-4 weken na beenmergtransplantatie, analyseren van perifeer bloed om te controleren op de engraftment van getransduceerde donor cellen (rubriek 4).</li>
</ol>4. evaluatie van het chimerisme van perifeer bloed
<ol><li>Anesthetiseer muizen met 5% Isofluraan en verkrijgen een bloedmonster uit een retro-orbitale ader met behulp van capillaire buizen, en verzamelen het in K2EDTA-buizen (het volume in één capillaire buis volstaat voor de volgende bepaling).</li>
	<li>Breng 20 μL bloed uit de K2EDTA buisjes in de ronde onderste polystyreen buisjes van 5 mL en zet op ijs.</li>
	<li>Voeg 1,5 mL RBC lysisbuffer toe aan lyse rode bloedcellen. Inbroed voor 5 min op ijs.</li>
	<li>Om de lysisbuffer te neutraliseren, moet u samples met FACS buffer (1,5 mL/sample) wassen.</li>
	<li>Centrifugeer op 609 x g bij rMax gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Incuberen de cellen met een cocktail van monoklonale antilichamen (verdund in 100 μL FACS buffer/sample) bij RT gedurende 20 minuten in het donker. Een volledige lijst van antilichamen wordt gegeven in de sectie materialen hierboven.</li>
	<li>Was de cellen eenmaal met FACS buffer (2 mL/sample). Centrifugeer op 609 x g bij rMax (1.800 rpm) gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant volledig weg.</li>
	<li>Fixeer de cellen met Paraformaldehyde bevattende fixatie buffer (100 μL/buis) gedurende 10 min bij 4 °C.</li>
	<li>Was de cellen eenmaal met een FACS buffer (3 mL/sample). Centrifugeer op 609 x g bij rMax (1.800 rpm) gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant volledig weg.</li>
	<li>Suspendeer de pellet in 400 μL FACS buffer.</li>
	<li>Houd de monsters bij 4 °C tot analyse doorstroming cytometrie.</li>
</ol>

<ol><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li>
<li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+vav%2C+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li>
<li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid%2C+Spontaneous%2C+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li>
<li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li>
<li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL%2F6+Cas9+transgenic+mouse+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li>
<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta%2FNLRP3+Inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li>
<li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Journal%22%5BJournal%5D)">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875(2015).</li>
<li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98(2013).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168(2014).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888(2018).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li>
<li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li>
<li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li>
<li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis%3A+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li>
<li>Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKahn%2C+JD+%22Blood%22">Blood</a>. , (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het voordeel van dit protocol is de creatie van diermodellen die specifieke mutaties in hematopoietische cellen in een snelle en zeer kosteneffectieve manier verteren in vergelijking met conventionele muis transgene benaderingen. Bleek dat deze methodologie maakt het genereren van muizen met hematopoietische cel gen-manipulaties binnen 1 maand. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die verder moeten worden overwogen.
Screening van de gRNA-sequentie
<p clas...

Veel studies in hematologie en immunologie vertrouwen op de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen, met inbegrip van conventionele en voorwaardelijke transgene/knock-out muizen die gebruik maken van hematopoietische systeemspecifieke CRE drivers zoals Mxcre, vav-CRE, en anderen 1,2,3,4,5. Deze strategieën vereisen de oprichting van nieuwe muis stammen, die tijdrovend en financieel belastend kunnen zijn. Terwijl revolutionaire ontwikkelingen in de genoom Editing technologie het genereren van nieuwe muis stammen in slechts 3-4 maanden mogelijk hebben gemaakt met de juiste technische expertise6,7,8,9 , veel meer tijd is nodig om de muis kolonie te versterken voordat experimenten worden nagestreefd. Bovendien zijn deze procedures kostbaar. Bijvoorbeeld, Jackson laboratorium vermeldt de huidige prijs van knock-out mice generatie diensten op $16.845 per stam (vanaf december 2018). Daarom zijn methodes die zuiniger en efficiënter zijn dan conventionele Murine transgene benaderingen voordeliger.
Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9) technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe tools voor snelle en efficiënte RNA-gebaseerde, sequentie-specifieke genoom bewerking. Oorspronkelijk ontdekt als een bacteriële adaptieve immuun mechanisme om het binnenvallende pathogeen DNA te vernietigen, is het CRISPR/Cas9 systeem gebruikt als een instrument om de effectiviteit van genoom bewerking in eukaryote cellen en diermodellen te verhogen. Er zijn een aantal benaderingen toegepast om CRISPR/Cas9-machines te verzenden naar hematopoietische stamcellen (d.w.z. elektroporatie, nucleofectie, lipofectie, virale levering en andere).
Hier wordt een lentivirussysteem gebruikt om cellen te leiden als gevolg van zijn vermogen om de Cas9-uitzinnige muriene hematopoietische stamcellen effectief te infecteren en samen de RNA-expressie constructie, promoters, regelgevings sequenties en genen die coderen fluorescerende reporter eiwitten (d.w.z. GFP, RFP). Met behulp van deze methode is ex vivo genbewerking van hematopoietische stamcellen van de muis bereikt, gevolgd door een succesvolle reconstitutie van het beenmerg in dodelijk bestraalde muizen10. De lentivirus vector die voor deze studie wordt gebruikt, toont de Cas9 en GFP reporter genen van de common core EF1a Promoter met een interne ribosomale intrede site stroomopwaarts van het reporter gen. De gids RNA-sequentie wordt uitgedrukt uit een afzonderlijke U6-promotor. Dit systeem wordt vervolgens gebruikt voor het maken van inbrengen en verwijderen mutaties in de kandidaat klonale Hematopoiesis bestuurder genen Tet2 en Dnmt3a10. Echter, de transductie-efficiëntie door deze methode is relatief laag (~ 5%-10%) door het grote formaat van de vector insert (13 KBP) die de transductie-efficiëntie beperkt en de virus titer vermindert tijdens de productie.
In andere studies, het is aangetoond dat grotere virale RNA grootte negatief beïnvloedt zowel de virus productie en transductie efficiëntie. Bijvoorbeeld, een toename van 1 KB in wisselplaatgrootte wordt gerapporteerd aan de virus productie te verlagen door ~ 50%, en transductie-efficiëntie zal afnemen tot meer dan 50% in de muis hematopoietische stamcellen11. Het is dus voordelig om de grootte van de virale insert zoveel mogelijk te verminderen om de efficiëntie van het systeem te verbeteren.
Deze tekortkoming kan worden overwonnen door het gebruik van Cas9 transgene muizen, waarbij het Cas9-eiwit wordt uitgedrukt in een constitutieve of niet-industriële manier12. De constitutieve CRISPR/Cas9 knock-in muizen drukt Cas9 endonuclease en EGFP uit van de CAG-promotor op de Rosa26 locus op een alomtegenwoordige manier. Zo kan een constructie met sgRNA onder controle van de promotor en RFP reporter gene onder de controle van de core EF1a promotor worden geleverd met behulp van de lentivirus vector om genoom bewerking te bereiken. Met dit systeem, de genen van hematopoietische stamcellen zijn met succes bewerkt, tonen een ~ 90% transductie efficiëntie. Dit protocol biedt dus een snelle en effectieve methode om muizen te creëren waarin gerichte genmutaties in het hematopoietische systeem worden geïntroduceerd. Terwijl ons lab is voornamelijk met behulp van dit soort technologie te bestuderen van de rol van van klonen Hematopoiesis bij cardiovasculaire ziekteprocessen13,14,15, het is ook van toepassing op studies van hematologische maligniteiten16. Bovendien kan dit protocol worden uitgebreid tot de analyse van de invloed van DNA-mutaties in HSPC op andere ziekte-of ontwikkelingsprocessen in het hematopoietische systeem.
Om een robuust lentivirus vector systeem te vestigen, zijn hoge titer virale voorraden en geoptimaliseerde omstandigheden voor de transductie en transplantatie van hematopoietische cellen vereist. In het protocol worden instructies gegeven over de bereiding van een hoog titer-virale bestanddeel in rubriek 1, waarbij de cultuuromstandigheden van de erytrocyten hematopoietische stamcellen in rubriek 2, de methoden voor beenmergtransplantatie in rubriek 3, worden geëvalueerd en engraftment in rubriek 4.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216--</td><td>Cell line</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21)</td><td>BD Biosciences</td><td>560599</td><td>Antilichamen</td></tr><tr><td>APC-Cy7-anti-muis CD45R (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>552094</td><td>Antilichamen</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok wegwerpspuiten, 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>BD Microtainer bloedafnamebuisjes, K2EDTA toegevoegd</td><td>BD Bioscience</td><td>365974</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>BD Precisionglide naald, 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>BD Precisionglide naald, 22 G</td><td>BD</td><td>305155</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>BV510-anti-muis CD8a (Clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100752</td><td>Antilichamen</td></tr><tr><td>BV711-anti-muis CD3e (Clone 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100349</td><td>Antilichamen</td></tr><tr><td>Kalfshuidcollen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9007-34-5</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3471</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 knock-in muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>028555</td><td>muis</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium (DMEM) - hoge glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>Medium</td></tr><tr><td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-behandelde celkweker</td><td>Life Sciences</td><td>353003</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL ronde bodem polystyreen testbuis</td><td>Life Sciences</td><td>352054</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Kegelcentrifugebuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Falcon 6 Well Clear Flat Bodem TC-behandelde Multiwell Celkweker Plate</td><td>Life Science</td><td>353046</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Fisherbrand microhematocrit capillaire buisjes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Fisherbrand steriele celstrainers, 70 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>FITC-anti-muis CD4 (Clone RM4-5)</td><td>Invitrogen</td><td>11-0042-85</td><td>Antilichamen</td></tr><tr><td>Fixatie Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>Guide-it Compete sgRNA Screening Systems</td><td>Clontech</td><td>632636</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane) oplossing</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>Lenti-X qRT-PCR Titratie Kit</td><td>Takara</td><td>631235</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, muis</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Millex-HV Spuitfilter Unit, 0.45 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHV004SL</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>PE-Cy7-anti-muis CD115 (Clone AFS98)</td><td>eBioscience</td><td>25-1152-82</td><td>Antilichamen</td></tr><tr><td>PEI MAX</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixtuur</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-anti-muis Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td>Antilichamen</td></tr><tr><td>pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP</td><td>Addgene</td><td>57823</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pMG2D</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>Polybrene Infectie/Transfectiereagens</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>Polypropyleen Centrifugebuizen</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>326823</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; Muis Irradiator Disk</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>algemeen benodigd</td></tr><tr><td>Recombinant Muur SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>Recombinant Muur TPO</td><td>Peprotech</td><td>315-14</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>09600</td><td>Oplossing</td></tr><tr><td>TOPO TA cloning kit voor sequencing met One Shot TOP10 Chemisch Competente E.coli</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>K457501</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Oplossing</td></tr></tbody></table>

lentivirale crispr/cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Het manipuleren van genen in hematopoietische stamcellen met conventionele Transgenese benaderingen kan tijdrovend, duur en uitdagend zijn. Met het voordeel van de vooruitgang in de genoom Editing technologie en lentivirusgemedieerde transgen toedieningssystemen, wordt hier een efficiënte en economische methode beschreven die muizen vastlegt waarin genen specifiek worden gemanipuleerd in hematopoietische stamcellen. Lentivirussen worden gebruikt om Cas9-uitverkorende Lineage-negatieve beenmergcellen te leiden met een RNA-gelei (gRNA) gericht op specifieke genen en een rood fluorescentie reporter-gen (RFP), waarna deze cellen worden getransplanteerd in dodelijk bestraalde C57BL/6 muizen. Muizen die worden getransplanteerd met lentivirus die niet-gerichte gRNA uitdrukken, worden gebruikt als besturingselementen. Engraftment van getransduceerde hematopoietische stamcellen wordt geëvalueerd door flowcytometrische analyse van RFP-positieve leukocyten van perifeer bloed. Met behulp van deze methode, ~ 90% transductie van myeloïde cellen en ~ 70% van lymfoïde cellen na 4 weken na transplantatie kan worden bereikt. Genomisch DNA is geïsoleerd van RFP-positieve bloedcellen, en delen van het doelwit van het DNA van de site worden versterkt door PCR om de genoom bewerking te valideren. Dit protocol biedt een evaluatie van de hoge doorvoer van Hematopoiesis-regelgevende genen en kan worden uitgebreid naar een verscheidenheid van muis ziekte modellen met hematopoietische celbetrokkenheid.

Met behulp van het hierboven beschreven protocol zijn ongeveer 0,8-1,0 x 108 beenmergcellen per muis verkregen. Het aantal Lineage-negatieve cellen die we verkrijgen is ongeveer 3 x 106 cellen per muis. Typisch, de opbrengst van beenmerg Lineage-negatieve cellen is 4%-5% van die van totale beenmerg kern cellen.
Het chimerisme van getransduceerde cellen (RFP-positief) wordt geëvalueerd door Flowcytometrie va...

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

We hebben een efficiënte en economische methode ontwikkeld om muizen met genmanipulatie specifiek in hematopoietische stamcellen vast te stellen, met behulp van genoombewerkingstechnologie en lentivirus-gemedieerde transgene leveringssystemen. Het voordeel van dit protocol is dat we dierlijke modellen kunnen maken die specifieke mutaties in hematopoietische cellen op een snelle en kosteneffectieve manier herbergen in vergelijking met conventionele transgene benaderingen van muizen. Het aantonen van de procedure zal Ying Wang, een onderzoeker van mijn laboratorium.Om lentivirusdeeltjes te genereren, begin met het coderen van een zes putplaat met collageenoplossing en het gedurende 30 minuten uitbroeden bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Dan, zaad 293T cellen op de plaat en uitbroeden voor nog eens twee uur. Bereid ondertussen het mengsel van drie transfectieplasmiden door 0,9 microgram lentivirusvector, 0,6 microgram psPAX2 en 0,3 microgram pMD2 te combineren.G en gedeïniseerd tot 10 microliter per put. Voeg vervolgens voorzichtig 50 microliter 1X PBS en vijf microliter verdunde PEI MAX toe aan het plasmidemengsel en ontcubeer het mengsel 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie een milliliter DMEM toe.Aspirate de media van de zes put plaat en voeg een milliliter plasmid mengsel aan elke put. Incubbateren de plaat voor nog eens drie uur. Vervang de media door verse DMEM en incubeer voor 24 uur.Voeg een milliliter verse DMEM toe en incubbate nog eens 24 uur. Na een totale incubatie van 48 uur breng je de supernatant over naar een buis van 50 milliliter en vercentrifugeer je het op 3000 keer G gedurende 15 minuten om alle vrij zwevende cellen te verwijderen. Filtreer de supernatant door een 0,45 micrometer filter en ultracentrifuge het gedurende drie uur.Zorgvuldig aspirate de supernatant, waardoor achter de witte pellet. Stel de pellet opnieuw op met 100 microliters serumvrije hematopoietisch celexpansiemedium zonder beademing. Houd een 10 microliter aliquot om de virale titer te meten en bewaar de rest van de suspensie op min 80 Celsius tot klaar voor gebruik.Na het isoleren van de botten, plaats ze in een 50 milliliter conische buis met RPMI en plaats de buis op ijs. Breng de botten in een bioveiligheidskast over in een steriele kweekschaal van 100 millimeter. Pak dan een bot met stompe tangen, en gebruik dissectie schaar om zorgvuldig snijden beide epifysen.Vul een spuit van 10 milliliter met ijskoude RPMI en gebruik een 22-meterige naald om het beenmerg uit de schacht door te spoelen in een nieuwe 100 millimeter kweekschotel. Nadat al het beenmerg is verzameld, maak een enkele cel suspensie door het beenmerg door een 10 milliliter spuit met een 18-meter naald. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter.Centrifugeer de buis vervolgens volgens de handschriftaanwijzing en aspirate de supernatant. Stel de celpellets opnieuw op in een passend volume van geoptimaliseerde scheidingsbuffer. Om afstamming negatieve cellen te isoleren, gebruik maken van een lineage cel uitputting kit volgens de instructies van de fabrikant.Schort de geïsoleerde afstammingnegatieve cellen opnieuw op in serumvrije hematopoietisch celexpansiemedium. Pre-incubeer de cellen op 37 graden celsius in 5%kooldioxide gedurende twee uur. Voeg vervolgens lentivirus toe volgens de aanwijzingen van het manuscript en laat de cellen nog 16 tot 20 uur in de couveuse staan.De volgende dag, verzamel de lentivirus-getransduceerde cellen in een 15 milliliter conische buis en centrifugeren ze op 300 keer G gedurende 10 minuten. Volgens de NHA-richtlijnen is het belangrijk om lentivirusvectoren te hanteren op Reece Group niveau twee. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen op basis van facilitaire voorschriften.De supernatant voorzichtig aanzuigen en de pellet opnieuw ophangen in 200 microliter RPMI per muis. Houd de cellen op kamertemperatuur tot transplantatie in muizen. Na de tweede bestraling sessie, retro-orbitaal injecteren getransduceerde afbakenende negatieve cellen in elke verdoofde muis met behulp van een insulinespuit.Drie tot vier weken na beenmergtransplantatie, krijgen bloedmonsters van de retro-orbitale ader met behulp van capillaire buizen. Breng 20 microliter bloed over in polystyreen reageerbuizen met ronde bodem en plaats op ijs. Na RBC lysis, incubeer de cellen met een cocktail van monoklonale antilichamen in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Na incubatie, wassen, fixen en centrifugeren van de cellen en opnieuw opschorten de cel pellet in 400 microliters van FACS buffer. Bewaar de monsters op vier graden Celsius tot de analyse door de stroom cytometrie. Succes van afstamming negatieve cel transductie kan worden geëvalueerd met flow cytometrische detectie van RFP.Het is aangetoond dat na zeven dagen van in vitro cultuur, gemiddeld 75,7% van de cellen worden getransduceerd. Flow cytometrie is ook gebruikt om muis perifeer bloed te analyseren na reconstitutie met getransduceerde en niet-getransduceerde hematopoietische stamcellen. Gemiddeld 94,8% van de neutrofielen, 93,5% van de monocyten en 82,7% van de B-cellen drukken RFP uit.Genomic DNA van de RFP-positieve bloedcellen is PCR versterkt en sub-gekloond voor sequentie-analyse. Verschillende mutaties worden gedetecteerd en 69% van de klonen tonen out of frame of premature stop mutaties. Om met deze procedure te slagen, zijn de voorbereiding van hoge antivirusvoorraad en geoptimaliseerde voorwaarden voor transductie en transplantatie van hematopoietische cellen vereist.We hebben deze techniek toegepast om de wet van hart- en vaatziekten te bestuderen. Maar het is ook nuttig om hematologische maligniteit te bestuderen. Deze methode stelt ons in staat om de functies van nieuwe soorten genen in het hematopoietisch systeem op een hoge efficiënte en hoge manier te bestuderen.We verzamelen dit over de beschikbaarheid van transgene muizen.

lentiviral-crisprcas9-mediated-genome-editing-for-study-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Gerichte gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9, heeft het inzicht in de biologische functies van genen aanzienlijk vergemakkelijkt. Hier, gebruiken we de methode van de CRISPR/Cas9 voor model calreticulin mutaties in cytokine-afhankelijke hematopoietische cellen om hun oncogene activiteit te bestuderen.

Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) kweekprocedure voor de robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.

CRISPR/Cas9-genbewerking van hematopoietische stam- en voorlopercellen voor gentherapietoepassingen

Nieuwe strategieën om somatische mutaties in hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) getrouw te modelleren, zijn nodig om de hematopoëtische stamcelbiologie en hematologische maligniteiten beter te bestuderen. Hier wordt een protocol beschreven om heterozygote gain-of-function mutaties in HSPC's te modelleren door het gebruik van CRISPR/Cas9 en dual rAAV donortransductie te combineren.

Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

De THP-1-cellijn wordt veel gebruikt als model om de functies van menselijke monocyten/macrofagen in verschillende biologiegerelateerde onderzoeksgebieden te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering en isolatie van single-cell kloons, waardoor de productie van robuuste en reproduceerbare fenotypische gegevens mogelijk wordt.

Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

Hier presenteren we een protocol dat CRISPR/Cas9-technologie integreert met de Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-test om kandidaatgenen te identificeren die cruciaal zijn voor de abnormale proliferatieve capaciteit van hematopoëtische stam- en voorlopercellen.

Evaluatie van abnormale groeigerelateerde genen van hematopoëtische stam- en voorlopercellen door CRISPR/Cas9-technologie te combineren met celtelling

Leer efficiënte CRISPR/Cas9-genoombewerking in muizenhematopoëtische stamcellen met lentivirale transductie. Deze methode versnelt het creëren van kosteneffectieve muismodellen voor hematopoëtisch onderzoek.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Meer video's verkennen