Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

Het vermogen om veranderingen in de morfologie van weefsels en organellen te kwantificeren is belangrijk voor het begrijpen van de genfunctie en de impact van genetische mutaties. Onze protocollen leggen uit hoe vrij beschikbare software kan worden gebruikt voor niet-subjectief beoordelen van de morfologie van synapsen, spieren en mitochondriën in een nematode, C.elegans. Veel eerdere studies hebben vertrouwd op kwalitatieve methoden voor het vergelijken van morfologische veranderingen.

Echter, deze kunnen problematisch zijn als ze niet kunnen vangen subtiele fenotypische verschillen, kan over en onderschatten veranderingen, en worden subjectief beoordeeld. Onze kwantitatieve methoden bieden robuustere en minder bevooroordeelde middelen voor het beoordelen van morfologische veranderingen. Deze methoden kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor het bestuderen van morfologische veranderingen in andere cellulaire structuren of modelorganismen om de genfunctie en de gevolgen van ziektegerelateerde mutaties te definiëren.

Begin met het voorbereiden van dia's voor beeldvorming. Plaats een druppel een van gesmolten agarose op een microscoop dia en onmiddellijk druk op de druppel met een andere microscoop dia, zachtjes afvlakken van de agarose. Laat de agarose een minuut drogen en scheid vervolgens zorgvuldig de twee dia's en laat het gestolde pad op een van de glijbanen.

Plaats de glijbaan op de microscoop podium en voeg een vijf tot 10-milliliter druppel verdoving aan het midden van de agarose pad. Gebruik een warmte-gesteriliseerde pick om snel 10 tot 15 dieren van de voorraadplaat naar de verdovingsdruppel over te brengen voordat de oplossing uitdroogt. Breng vervolgens een coverslip door het te positioneren net boven de agarose pad en zachtjes laten vallen naar beneden.

Beeld de synaptische gebieden met een line-scanning confocale microscoop gekoppeld aan een 488 en 552 nanometer optisch gepompte halfgeleider diode laser en uitgerust met beeldopname software. Na het lokaliseren van de wormen, overschakelen naar een 40X vergroting en breng onderdompeling medium. Visual de synaptische regio door spannend de fluoroforen met een 552 nanometer laser, 1%macht voor de tagRFP fluorophore, en 488 nanometer, 2%vermogen voor de GFP fluorophore.

Leg beelden vast met behulp van een hybride fotodetector en stel de winsten in om overbelichting van de fluoroforen te voorkomen. Verzamel Z-stack afbeeldingen om de gehele synaps te bedekken met behulp van de optimale Z-stap grootte, afhankelijk van de doelstelling. Om het synaptische gebied te analyseren begin met het laden van de beelden in de CellProfiler 3.1.5 software.

Stel de NameAndType-module in en bepaal het synaptische gebied met de hand met behulp van de diffuse tagRFP uitgedrukt uit het UIS-115-transgene. Meet de grootte en fluorescentie van de met de hand gedefinieerde synaps door de modules MeasureObjectSizeShape en MeasureObjectIntensity aan de pijplijn toe te voegen. Bereken vervolgens de relatieve geïntegreerde fluorescentieintensiteit door de CalculateMath-module toe te voegen en de geïntegreerde intensiteitseenheden die uit JSIS37 zijn verkregen, te delen door die verkregen uit UIS-115.

Wanneer u klaar bent met exporteren alle metingen en berekeningen. Om spiercel gebied te meten open het beeld in Fiji software en gebruik polygoon selectie om zorgvuldig te traceren rond een enkele schuine spiercel. Pas de lijn van de veelhoek aan het einde aan door de ankerpunt te slepen om de tracering te verbeteren.

Navigeer naar het tabblad Analyseren boven aan de software en klik op Meten om het geselecteerde gebied te berekenen. Voor spiercellen met een gedegenereerd of ontbrekend gebied traceer het ontbrekende gebied met het polygoonselectiegereedschap en klik opnieuw op Opnieuw meten. Als er meerdere hiaten zijn, traceer ze elk afzonderlijk.

Bereken de verhouding van het tussenruimtegebied en het gebied van de hele cel. Een hoge verhouding duidt op een hogere mate van spierdegeneratie. En als er geen ontbrekende regio's zijn, wordt de verhouding berekend als nul.

Open Elastiek en kies Pixelclassificatie onder Nieuw project maken. Wijzig vervolgens de naam en sla het project op. Navigeer naar het tabblad invoergegevens en klik op Nieuw toevoegen en voeg vervolgens afzonderlijke afbeeldingen toe.

Richt het pop-upvenster naar de map met de TIF-bestanden en selecteer de gewenste afbeelding. Klik op het tabblad Functieselectie op Onderdelen selecteren om alle pixelfuncties te selecteren die worden aangegeven door de groene aangevinkte vakjes. De pixelselectie in deze stap wordt gebruikt om de verschillende klassen pixels in de volgende stap te onderscheiden.

Gebruik een trainingspaneel om onderscheid te maken tussen de individuele GFP-uitdrukkende myosinefilamenten en ongewenste achtergrond. Klik op Label toevoegen en krabbel ongewenste achtergronden en spaties tussen de filamenten om te beginnen met classificatietraining. Voeg een tweede label toe, hernoemen naar Filament en krabbel over een aantal filamenten.

Klik op Live Update om er zeker van te zijn dat de classificatie correct is uitgevoerd. Voeg indien nodig meer krabbels toe om de training te verfijnen. Zodra de trainingsclassificatie is uitgevoerd, gaat u naar het deelvenster Voorspelling exporteren en klikt u op Afbeeldingsinstellingen exporteren kiezen met waarschijnlijkheden als bron.

Zorg ervoor dat de cutout subregio's x en y zijn aangevinkt, en c is ontvinken. Selecteer nul en één als begin- en stopwaarden voor c en Gegevenstype converteren naar niet-ondertekende 8-bits. Tik opnieuw te standaardiseren en wijzig vervolgens de video van het uitvoerbestand in png, waarbij de naam van het bestand en de map naar wens wordt gewijzigd.

Sluit het venster Instellingen exporteren en exporteer de afbeelding die zojuist is gesegmenteerd. Open vervolgens het png-bestand in Fiji-software. Pas de drempelwaarde van de afbeelding aan met standaardinstellingen en pas de insteek voor skelettisatie toe, waardoor een aparte tabel met resultaten wordt gemaakt.

Dit protocol is gebruikt om de functie van alpha-tubuline acetyltransferase MEC-17 in synapse ontwikkeling te verkennen. Kwantitatieve analyse van beelden van de achterste / laterale microtubuli of PLM synapsen geeft aan dat overexpressie van MEC-17 verstoort de normale neuron functie. Vergeleken met het wilde type controle dieren overexpressing MEC-17 hebben aanzienlijk verminderd presynaptische regio's en synaptische integriteit.

Deze technieken zijn ook gebruikt om C.elegans modellen van Charcot-Marie-Tooth type 2 of CMT2 dragen mutaties in CMT2-geassocieerde genen te analyseren. Visuele beoordeling van lichaamswandspiermorfologie toonde een 2,5 tot 3,5-voudige toename van defecten bij de proefdieren in vergelijking met de wildtypecontrole. Dieren met mutaties in fzo-1 en unc-116 ervaren verlies van spierstrities, accumulatie van cellulair puin en spiervezeldegeneratie.

Terwijl dieren met mutaties in dyn-1 aanzienlijk minder defecten in spiermorfologie ondervonden. De fzo-1 en unc-116 mutanten vertoonden een vijf- tot zesvoudige toename van de verhouding tussen de kloof en het totale eencellige gebied en een aanzienlijk kortere gemiddelde vezellengte in vergelijking met wilde dierdieren. Voor vergelijkingen tussen monsters is het belangrijk om de meest optimale omstandigheden voor beeldverwerving te bepalen en ervoor te zorgen dat deze voorwaarden consistent worden gebruikt.

Deze technieken zullen onderzoekers in staat stellen om morfologische veranderingen over verschillende genetische achtergronden te vergelijken met kwantitatieve benaderingen. Dit vermindert de subjectiviteit en helpt daarom om de representabiliteit van de gegenereerde gegevens te verbeteren.