Geautomatiseerde rat single-pellet bereiken met 3-dimensionale reconstructie van paw en Digit trajecten
10 juli 2019
Knaagdier vaardige bereiken wordt vaak gebruikt om behendige vaardigheden te bestuderen, maar vereist veel tijd en moeite om de taak te implementeren en het gedrag te analyseren. We beschrijven een geautomatiseerde versie van bekwaam bereiken met bewegingsregistratie en driedimensionale reconstructie van REACH-trajecten.
Deze methode bouwt voort op gevestigde rat geschoolde bereiken protocollen om training en testen te automatiseren die een efficiënt middel om grote data sets relatief snel te verwerven. Het minimaliseert experimenter inspanning terwijl het toestaan van drie-dimensionale reconstructie van voorpoot kinematica. De kinematica kunnen worden gebruikt om de effecten van nauwkeurig getimede interventies te evalueren of gecorreleerd te zijn met fysiologische opnames.
Met enkele aanpassingen kan deze techniek ook worden toegepast bij muizen. Begin met het aanzetten van de lichten en plaats de rat in een bekwame bereiken kamer. Gebruik tangen om een pellet te houden door de bereikende sleuf aan de voorkant van de doos.
Laat de rat drie pellets van de tangen eten. Trek de pellet terug de volgende keer dat de rat probeert om de pellet te eten van de tangen en herhaal totdat de rat bereikt voor de pellet met een poot het meest uit 11 bereikt met vermelding van poot voorkeur. Vervolgens, lijn de pellet levering staaf met de zijkant van de bereiken slot contralaterale aan de voorkeur van de rat poot.
Plaats een pellet op de leveringsstang. Gebruik dan tangen om de rat aas met de pellet, maar direct de rat naar de leveringsstaaf, zodat de poot raakt de pellet op de staaf. Nadat de rat heeft geprobeerd 10 bereikt om de levering staaf zonder te worden aas, vooraf de rat naar de volgende fase.
Plaats vervolgens de pelletleedaaf op basis van de voorkeur van de rat en stel deze in op positie twee. Stel de hoogte van de pelletafvoerstaaf in met behulp van de afstandsbediening van de actuator. Zodra de leveringsstang op de juiste hoogte is, houdt u het gewenste getal ingedeeld totdat het lampje rood knippert om in te stellen.
Plaats vervolgens de rat in de kamer en aas de rat naar de achterkant met een pellet. Wanneer de rat beweegt ver genoeg naar de achterkant van de kamer dat het zou breken de infrarood balk als de geautomatiseerde versie liep, verplaats de pellet levering staaf naar positie drie. Tot slot, wacht tot de rat te bereiken voor de pellet en vervolgens verplaatsen van de pellet levering staaf terug naar positie twee.
Plaats een nieuwe pellet op de leveringsstang als uitgeschakeld. Herhaal deze stappen geleidelijk aas de rat minder en minder totdat de rat begint aan een, naar de achterkant om een pellet te vragen zonder te worden aas, en twee, onmiddellijk naar de voorkant na het aanvragen van een pellet in de rug. Nadat de rat dit 10 keer heeft gedaan, begin dan met trainen op de geautomatiseerde taak.
Als u het geautomatiseerde systeem wilt instellen, schakelt u de verlichting in de kamer in en vult u het pelletreservoir bij. Plaats de pelletleveringsstaaf volgens de voorkeur van de rat. Controleer of de actuatorposities correct zijn ingesteld.
Schakel vervolgens de computer in en open het programma voor het bereiken van geschoolde mensen. Voer het rat-ID-nummer onder onderwerp in en selecteer de voorkeur voor poot in het vervolgkeuzemenu hand. Geef het opspad voor de video's op.
Stel vervolgens de sessietijd en het aantal max-video's in. Stel de pelletlift duur ook en maak het mogelijk de vroege bereik straf. Vervolgens, om kalibratie beelden te nemen, plaats de helpende hand in de bereikende kamer en porren de alligator clip door de bereikende sleuf.
Houd de kubus voor de bereikende sleuf met de alligatorclip. Plaats vervolgens de kubus zo dat de rode kant verschijnt in de bovenste spiegel, de groene kant in de linkerspiegel, en de blauwe kant in de rechterspiegel. Zorg er in het gedragsprogramma voor dat de ROI-drempel is ingesteld op een zeer grote waarde.
Klik op de run-knop en zodra de camera geinitialiseerde knop groen wordt, druk je op start om video-acquisitie te beginnen. Klik op Cal-modus en maak een afbeelding door op Afbeelding nemen te klikken. Verplaats de kubus iets en maak een andere afbeelding.
Herhaal dit opnieuw voor in totaal drie afbeeldingen. Tot slot, stop het programma door te klikken op stop en klik vervolgens op de knop stopteken. Haal de helpende hand en de kubus uit de doos.
Wees voorzichtig om niets hobbel in de gedragskamer na kalibratie beelden zijn genomen die dag. Plaats eerst de rat in de bekwame bereikende kamer. Klik op de witte pijl om het programma uit te voeren.
Stel vervolgens de positie van de ROI voor pawdetectie in door x-offset-, y-offset-, ROI-breedte en ROI-hoogte aan te passen. Plaats de ROI in de zijspiegel die de dorsum van de poot direct voor de bereikende sleuf toont en klik op start om het programma te beginnen. Terwijl de rat niet bereikt, pas de lage ROI drempel waarde totdat de live ROI trigger waarde oscilleert tussen nul en een.
Stel vervolgens de ROI-drempel in om aanzienlijk groter te zijn dan de live ROI-triggerwaarde tijdens neusprikken en lager dan de live ROI-triggerwaarde wanneer de rat bereikt. Pas aan totdat video's consequent worden geactiveerd wanneer de rat bereikt, maar niet wanneer hij zijn neus door de sleuf steekt. Controleer de eerste paar proeven om ervoor te zorgen dat alles goed werkt.
Wanneer een rat bereikt voordat u een pellet aanvraagt, observeer dan de toename van het aantal vroege bereikten. Wanneer een rat bereikt na het aanvragen van een pellet, let op de video's aantal te verhogen, terwijl een kopie van de video wordt opgeslagen als een bin bestand. Tot slot drukt u na het bereiken van de sessie of het maximum aantal video's op de knop stopbord.
De resultaten geven aan dat na 20 dagen, ratten verwerven van de geschoolde bereiken taak. Hier worden de bereiktrajecten van één sessie getoond. Dit vertegenwoordigt slechts aanvankelijke pootvordering voor gemak van presentatie.
Verder, als de paw detectie trigger niet nauwkeurig is ingesteld, is er aanzienlijke variabiliteit in het frame waarbij de poot breekt de bereikende sleuf die kan leiden tot variabiliteit in wanneer interventies worden geactiveerd tijdens het bereiken van bewegingen. Afgezien van een zorgvuldige behandeling van de dieren, zullen er in dit protocol geen voorzorgsmaatregelen worden genomen. Het is vooral belangrijk om de ROI-drempel correct in te stellen, zodat video's of andere interventies op de juiste momenten worden geactiveerd.
Deze methode kan worden gecombineerd met verschillende andere technieken, zoals optogenetica, calcium beeldvorming, en genetische modellen die vragen kunnen behandelen, variërend van fundamentele motorische controle tot bewegingsstoornis pathophysiologie. Deze techniek maakt correlatie van gedetailleerd bereik en greep kinematica met fysiologische opnames of interventies waardoor onderzoekers niet alleen antwoord als, maar hoe bewegingen veranderen met neurale circuits veranderingen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geautomatiseerde methode voor behendig reiken bij knaagdieren, waardoor de efficiëntie van training en testen wordt verhoogd terwijl de inspanning van de experimentator wordt geminimaliseerd. De techniek maakt een driedimensionale reconstructie van de kinematica van de voorpoten mogelijk, wat de analyse van behendige vaardigheden faciliteert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Geautomatiseerde bewegingsregistratie
Achtergrond
- Het getrainde reikgedrag van knaagdieren is een gangbaar model voor het bestuderen van behendigheidsvaardigheden.
- Traditionele methoden vereisen aanzienlijke tijd en inspanning voor implementatie en analyse.
- Automatisering kan de processen van gegevensverzameling en -analyse stroomlijnen.
- De methode kan worden aangepast voor gebruik bij muizen.
Doel van de studie
- Om de vaardige reiktaken bij knaagdieren te automatiseren.
- Om de efficiënte acquisitie van grote datasets te faciliteren.
- Om driedimensionale analyse van voorpootbewegingen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Automatisering van trainings- en testprotocollen voor geschoolde reikbewegingen.
- Motion-tracking voor nauwkeurige gegevensverzameling.
- Driedimensionale reconstructie van reiktrajecten.
- Evaluatie van de kinematica in relatie tot fysiologische opnames.
Belangrijkste resultaten
- Efficiënte gegevensverwerving met minder betrokkenheid van de experimentator.
- Succesvolle driedimensionale reconstructie van de kinematica van de voorpoten.
- Vermogen om kinematische gegevens te correleren met fysiologische interventies.
- Aanpasbaarheid van de methode voor gebruik bij muizen.
Conclusies
- De geautomatiseerde methode verbetert de studie naar behendigheidsvaardigheden bij knaagdieren.
- Het biedt een robuust kader voor het analyseren van bewegingen van de voorpoten.
- Deze aanpak kan leiden tot efficiëntere experimentele ontwerpen in neurowetenschappelijk onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Geautomatiseerd doelgericht reiken met 3D-kinematische reconstructie maakt een high-throughput, kwantitatieve beoordeling van de motorische functie in knaagdiermodellen mogelijk, wat doelvalidatie bij het ontdekken van neurologische geneesmiddelen ondersteunt. Door de handmatige inspanning te verminderen en de reproduceerbaarheid van gegevens te vergroten, verbetert deze methode het voorspellend vertrouwen in vroeg stadium mechanistische studies naar bewegingsstoornissen. Het faciliteert de correlatie van gedragstypische fenotypes met manipulaties van neurale circuits, wat helpt bij de identificatie van lead-verbindingen en preklinische risicoreductie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van hypothesen over motorische circuits mogelijk via precieze, geautomatiseerde meting van de kinematica van reiken en grijpen.
- Operationele waarde: Vermindert variabiliteit en bias van de experimentator, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en tijdstippen verhoogt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de betrouwbaarheid van het doelwit door genetische of farmacologische manipulaties te koppelen aan kwantificeerbare resultaten van behendigheid.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaar voor analyse: Genereert gestandaardiseerde videogegevens met een hoge framerate, geschikt voor geautomatiseerde pose-estimatiepipelines zoals DeepLabCut.
- Kwantitatieve output: Levert 3D-trajectgegevens die objectieve, continue variabelen mogelijk maken voor het modelleren van het effect van verbindingen.
- <Schaalbaarheid: Geautomatiseerde pelletafgifte en triggering maken screening van grote cohorten mogelijk met minimale handmatige interventie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert een verminderde vaardige functie van de voorpoten bij Parkinson, Huntington en beroertes, wat afstemming van translationele biomarkers mogelijk maakt.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt correlatie van kinematische tekortkomingen met optogenetische, chemogenetische of elektrofysiologische interventies mogelijk om causale neurale mechanismen vast te stellen.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt longitudinale monitoring van motorisch herstel of degeneratie in modellen van ziekteprogressie.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit-hypothesen via lead-optimalisatie tot preklinische effectiviteit, in het bijzonder voor CNS-programma's gericht op motorische functies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te kwantificeren hoe verstoringen van neurale circuits de dynamiek van geschoolde bewegingen beïnvloeden.
- Screening: Maakt reproduceerbare, assay-klare gedragsmatige read-outs mogelijk voor de evaluatie van compound-bibliotheken in modellen van motorische beperkingen.
- Analytics: Levert 3D-kinematische trajecten en triggersynchroniseerde video voor multimodale correlatie met neurale opnames.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij klinische motorische beoordelingen (bijv. finger tapping, behendigheidstesten) om de predictieve validiteit te verhogen.
- Bedrijfsbrede herutilisatie: Vertegenwoordigt een schaalbaar, gestandaardiseerd platform voor motorische fenotypering over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vergroot het mechanistische inzicht door een nauwkeurige temporele afstemming van gedrag op neurale interventies mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert trainings- en testprotocollen, waardoor de variabiliteit tussen gebruikers afneemt en de doorvoer toeneemt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door objectieve, kwantificeerbare motorische eindpunten vroeg in de ontdekkingsfase te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van functionele motorische verbetering, waardoor laatstadium-mislukkingen in programma's voor bewegingsstoornissen worden verminderd.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van knaagdieren, gedragstraining en pose-estimatietools op basis van machine learning.
- Vereist hogesnelheidscamera's, gesynchroniseerde verlichting, actuator-gestuurde pelletafgifte en software voor real-time videotracking.
- Vraagt om cross-team standaardisatie van ROI-instellingen, drempelwaardekalibratie en triggerlogica voor reproduceerbare timing van interventies.
- Aanpassing voor verschillende soorten (bijv. van muizen naar ratten) vereist hervalidatie van de kinematica van het reikbereik en de parameters voor de positionering van de pellets.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van een correcte instelling van de ROI-drempelwaarde om valse triggers tijdens neussteekjes of gemiste reikacties te voorkomen.
