Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing
15 oktober 2019
Hier beschreven is een vereenvoudigde standaard werkings procedure voor microbiome profilering met behulp van 16S rRNA metagenomic sequencing en analyse met behulp van vrij beschikbare instrumenten. Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het microbiome veld en degenen die updates vereisen over methoden om bacteriële profilering bij een hogere resolutie te bereiken helpen.
Profilering van microbioom is de eerste stap in de richting van het definiëren van de rol van microbioom in gezondheid en ziekte. Hier beschrijven we een eenvoudige procedure voor het isoleren van hoogwaardig bacterieel DNA uit fecale monstervoorbereiding bibliotheek, het uitvoeren van 16SR RNA en een meta genomic sequencing en microbioom data-analyse. Dit protocol zal onderzoekers helpen nieuw op het gebied van microbioom, evenals onderzoekers die werkzaam zijn in microbioom veld bij de oprichting van de microbioom pijpleiding in hun lab. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het profileren van microbioom van andere biomonsters zoals nasale, orale of huidmonsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Kraal plukken is de belangrijkste stappen als alle downstream stappen zijn afhankelijk van hoge kwaliteit DNA. Een goede afdichting van bewaarplaat is belangrijk omdat onvolledige afdichting kan leiden tot het onderdrukken van versterkt product, wat resulteert in sequencinggegevens van lage kwaliteit. Om te beginnen steriliseren de scheidingsbakken met 70%ethanol. Plaats de muizen in gesteriliseerde scheidingswanden en laat ze normaal poepen voor maximaal een uur. Gebruik steriele tangen om de fecale pellets te verzamelen in een lege voorgelabelde 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Sluit de buis stevig in. Steriliseren de tangen met 70%ethanol, gevolgd door een kiemdodend wegwerpdoek, na het verzamelen van fecale van elke muis. Weeg 200 milligram fecale pellets af in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis, met 0,1 milliliter glazen kralen, en plaats de kraalbuis in een kraal die homogenisator slaat en homogenize de monsters gedurende 45 seconden bij kamertemperatuur, met een snelheid van 4,5 meter per seconde. Haal DNA volgens instructies van de kitfabrikant en elute DNA in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Na het isoleren van DNA kwantificeert u het geïsoleerde DNA door 1 microliter van het DNA op een fluorometer te laden. Setup 16S ribosomale RNA genversterking PCR1 in een 96-Well PCR plaat, met behulp van een 25 microliter reactievolume. Voeg met behulp van een multi-channel pipet 40 nano gram DNA, 13,5 micro liter 2x high-fidelity polymerase enzym mix, met buffer, plus DNTPs in voorwaartse en omgekeerde primer. Verzegel de PCR-plaat goed van boven naar beneden in alle vier de randen. En centrifuge op 1000 keer G op 20
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerde methodologie voor microbioomprofilering via 16S rRNA metagenomische sequencing. Het protocol is gericht op zowel beginnende als ervaren onderzoekers en biedt inzichten in het verkrijgen van nauwkeurige bacteriële profilering met behulp van toegankelijke instrumenten.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Microbioomanalyse
- Metagenomische sequencing
- Bacteriële profilering
Achtergrond
- De rol van het microbioom bij gezondheid en ziekte
- Het belang van hoogwaardige DNA-isolatie
- Toepassingen in diverse biologische monsters
Gebruikte methoden
- 16S rRNA-sequenceringsprotocol
- Voorbereiding van fecale monsters en DNA-extractie
- Gebruik van vrij beschikbare bio-informatica-instrumenten voor analyse
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogwaardig bacterieel DNA
- Robuuste bibliotheekpreparatie voor sequencing
- Gedetailleerde richtlijnen voor onderzoekers om microbiome-pipelines op te zetten
Conclusies
- De studie biedt een uitgebreid protocol voor microbioomprofilering.
- Het verbetert het begrip van microbioommethodieken die relevant zijn voor gezondheidsonderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het profileren van het microbioom is een fundamentele stap bij de validatie van targets voor inflammatoire en metabole ziekten, waardoor hypothesen kunnen worden gegenereerd over de bijdrage van microben aan de pathogenese. Dit protocol ondersteunt de ontwikkeling van preklinische modellen door taxonomische gegevens met een hoge resolutie uit complexe biospecimens te verschaffen, wat bijdraagt aan het mechanistische risicobeheer van interventies gericht op het microbioom. De gestandaardiseerde workflow verbetert de translationele continuïteit van de ontdekkingsfase tot de identificatie van lead-candidates in therapeutische programma's die het microbioom moduleren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door specifieke bacteriële taxa te koppelen aan ziektefenotypes in preklinische modellen.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare profilering van microbiële gemeenschappen ter ondersteuning van inspanningen voor de prioritering van targets en de verduidelijking van pathways.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, hoge-resolutie taxonomische resultaten die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en initiatieven voor biomarker-ontdekking.
- Operationele waarde: Vestigt een schaalbare, herbruikbare pijplijn voor het screenen van microbioomveranderingen in diverse monster-typen en behandelcondities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de karakterisering van ziekterelante systemen door het mogelijk maken van longitudinale monitoring van verschuivingen in het microbioom als reactie op therapeutische kandidaten.
- Operationele waarde: Faciliteert cross-functionele samenwerking via gestandaardiseerde dataformaten en analyse-instrumenten zoals DADA2 en Phyloseq.
Integratie van pipeline en workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door bruikbare microbioomgegevens te leveren die de selectie van targets en mechanistische studies informeren voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en pathway-verduidelijking door middel van nauwkeurige taxonomische toewijzing op genus- en soortniveau.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare microbiële profielen die een betrouwbare vergelijking van experimentele condities mogelijk maken.
- Analytics: Biedt kwantitatieve sequentievarianten en diversiteitsmetrieken die statistische vergelijking en biomarkercorrelatie ondersteunen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt discovery-bevindingen met preklinische validatie door consistente microbiome-monitoring over verschillende studiefasen mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde, afdelingsoverstijgende capaciteit voor microbiome-analyse die toepasbaar is op meerdere therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanistische ambiguïteit in gastheer-microbe-interacties te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde tweestaps-PCR en bio-informatische analyse.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van door het microbioom gemedieerde verstorende factoren in ziektemodellen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door datagedreven inzichten te bieden in de validiteit van mechanismen gericht op het microbioom.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie en bio-informatica voor de opzet van de PCR en DADA2-gebaseerde analyse.
- Is afhankelijk van toegang tot infrastructuur voor next-generation sequencing en computationele middelen voor metagenomische verwerking.
- Vereist cross-team standaardisatie van monsterbehandeling, DNA-extractie en de voorbereiding van sequencing-bibliotheken.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het uitbreiden van het protocol naar niet-fecale biospecimens, zoals mond- of huidmonsters.
- Omvat praktische beperkingen met betrekking tot PCR-bias en sequencing-diepte die de detectie van taxa met een lage abundantie beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:25
Extraction of DNA from Fecal Sample
2:29
16S rRNA Gene Amplification (PCR1) and DNA Library Construction (PCR2)
3:57
Clean-up of Indexed PCR (PCR2) and Quantification
6:03
Sequence Analysis
7:49
Results: Quality Profile and Statistical Analysis
9:29
Conclusion
