Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

Dit protocol is het resultaat van de evaluatie van de belangrijkste aspecten van circRNA-bibliotheekvoorbereiding, zoals het type kit, RNase R-behandeling, invoerbedragen en hun impact op circRNA-detectie. Het maakt een optimale circRNA-detectie mogelijk en levert gegevens over aanpasbare parameters, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker. Het identificeren van circRNAs in verschillende monstertypen zal ons helpen om de verdeling van hun expressie beter te begrijpen en stelt de weg in voor het afbakenen van de functionele rol van deze moleculen.

Deze methode kan worden toegepast op elk totaal RNA-monster. Het is belangrijk om RNA-monsters op ijs te houden voordat het protocol wordt begin. Beoordeel de RIN- en DV200-waarden op de Agilent Bioanalyzer of TapeStation vóór de voorbereiding en volg de juiste procedures bij het werken met RNA.

Begin met het verdunnen van het totale RNA tot vier microgram in 39 microliter RNase-vrij water en pipetten het op en neer te mengen. Gebruik in een aparte buis 1x RNase R Buffer om de RNase R te verdunnen tot een werkconcentratie van twee eenheden per microliter. Pipette 39 microliters van totale RNA en vijf microliters van 10x RNase R Reaction Buffer in een 1,5-microliter reactiebuis, en meng.

Voeg zes microliter van de verdunde RNase R.Vervolgens de pipet aan te passen aan het volledige reactievolume en meng de oplossing door 10 keer op en neer te pipetten. Plaats de buis in een 37-graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten, zorg ervoor dat het volledige reactievolume wordt ondergedompeld in het waterbad. Plaats vervolgens de buis op ijs en ga onmiddellijk verder met RNA-opruimen en concentratie.

Bereid de RNA Wash Buffer voor voordat u begint met het mengen van het concentraat met 48 milliliter ethanol van 100% en plaats zuiveringskolommen in opvangbuizen. Voeg twee delen RNA Binding Buffer toe aan het RNase R-behandelde monster en meng goed. Voeg 150 microliter van 100% ethanol toe aan het mengsel voor een totaal van 300 microliter, breng het volledige volume over naar de kolom en vercentrifuge gedurende 30 seconden.

Verwijder de stroom door, en voeg 400 microliter van RNA Prep Buffer rechtstreeks aan de kolom. Centrifuge gedurende 30 seconden, en gooi de stroom door. Voeg vervolgens 700 microliter RNA Wash Buffer toe aan de kolom, centrifuge gedurende 30 seconden en gooi de stroom door.

Voeg nog eens 400 microliter van de Wasbuffer toe, centrifuge gedurende twee minuten en breng de kolom over naar een verse RNase-vrije buis van 1,5 milliliter. Voeg voorzichtig 11 microliter RNase-vrij water direct aan de kolom door de pipetpunt recht boven het kolomfilter te houden. Laat het monster een minuut op kamertemperatuur zitten en centrifuger het vervolgens gedurende één minuut.

Zorg ervoor dat er stroom door in de 1,5-milliliter buis, en gooi de kolom. Het gezuiverde RNA-monster kan worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius of onmiddellijk worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek. Breng 10 microliter van het gezuiverde totale RNA over naar een schone put in een 96-well PCR-plaat.

Voeg vijf microliters rRNA Binding Buffer toe, gevolgd door vijf microliters rRNA Removal Mix, enpipet vervolgens zachtjes op en neer om de reagentia te mengen. Verzegel de plaat en broed het vijf minuten uit bij 68 graden Celsius op een voorgeprogrammeerd en voorverwarmd thermocyclerblok. Laat de plaat na de incubatie een minuut op kamertemperatuur zitten.

Verwijder de afdichting van de plaat en voeg 35 microliter vortexed kamertemperatuur rRNA verwijdering kralen aan het monster. Pas de pipet aan op 45 microliters en pipet 10 tot 20 keer op en neer om grondig te mengen. Laat de plaat een minuut op kamertemperatuur zitten.

Breng de plaat naar een magnetische standaard en broed deze daar een minuut of totdat de oplossing is gewist. Breng de supernatant naar nieuwe goed op de plaat. Breng vervolgens de plaat van de magnetische standaard over naar de plaatstandaard.

Vortex RNA opruimen kralen totdat ze goed zijn verspreid, en voeg 99 microliter kralen aan het monster. Pipette op en neer om te mengen, en de plaat in tecuniseren bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng de plaat naar de magnetische standaard, en laat het daar voor vijf minuten of totdat de oplossing wist, verwijder en gooi alle supernatant uit de put.

Met de plaat nog steeds op de magnetische standaard, voeg 200 microliters van vers bereide 80% ethanol aan de put zonder verstoring van de kralen. Laat de ethanol in de put gedurende 30 seconden, verwijder en gooi het. Voeg 11 microliter elution buffer aan de put, en pipette het op en neer te mengen.

Broed de plaat twee minuten op kamertemperatuur, breng deze vervolgens terug naar de magnetische standaard en bewaar hem daar totdat de oplossing is opgelost. Breng 8,5 microliter van de supernatant naar een nieuwe put op dezelfde plaat, en voeg 8,5 microliter van Elute, Primer, Fragment High Mix aan elke put met een monster. Pipet op en neer 10 keer om grondig te mengen, verzegelen de plaat, en uitbroeden gedurende acht minuten in een thermocycler voorverwarmd tot 94 graden Celsius.

Koel het monster tot vier graden Celsius, verwijder de plaat uit de thermocycler en centrifuge het kort. Twee bibliotheekvoorbereidingskits, TruSeq en KAPA, werden voor dit protocol beoordeeld. Over het algemeen werd een hoger aantal cirkel-RNAs en een lager percentage ribosomale RNA gedetecteerd bij het gebruik van de TruSeq-kit, dus TruSeq werd geselecteerd voor verdere experimenten.

De betekenis van RNase R-voorbehandeling werd geëvalueerd door de gegevens te vergelijken die zijn gegenereerd uit voorbehandelde en niet-voorbehandelde bibliotheken. Zoals verwacht werd in de voorbehandelde bibliotheken consequent een groter aantal circulaire RNA's geïdentificeerd in vergelijking met niet-voorbehandelde bibliotheken. De hoeveelheid input RNA werd geoptimaliseerd voor het detecteren van een hogere diversiteit aan circulaire RNAs.

Bibliotheken werden bereid met behulp van een, twee en vier microgram van input RNA, en de hoogste diversiteit van circulaire RNA soorten werd waargenomen bij het gebruik van vier microgram van het totale RNA. Het geoptimaliseerde protocol werd gebruikt om circulaire RNA overvloeden te vergelijken in vijf hersengebieden van vier gezonde donoren en voor andere weefselsoorten van zes gezonde donoren. Over het algemeen werd een hogere overvloed aan circulaire RNase waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefseltypen.

Het is belangrijk om te onthouden om de juiste procedures te volgen bij het werken met RNA, met inbegrip van het dragen van handschoenen, het grondig reinigen van de bank en pipetten met RNase doekjes of spray voordat u het protocol, en het houden van RNA op ijs vooraf. Na deze procedure kan orthogonale validatie worden uitgevoerd, zoals Sanger sequencing van geïdentificeerde circRNA-knooppunten. De ontdekking van nieuwe circRNAs en verder bewijs van hun aanwezigheid kerft een nieuw onderzoeksgebied voor het verkennen van hun biologische functies.