Name: Identificatie van circulaire Rnas met RNA-sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer hoe je circulaire RNA's identificeert met RNA-sequencing door optimale bibliotheekvoorbereiding met RNase R-behandeling. Deze methode verbetert circRNA-detectie in totale RNA-monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de banner Sun Health Research Institute Brain and Body donatieprogramma (BBDP) van Sun City, Arizona voor de verstrekking van menselijke hersenweefsels. De BBDP is gesteund door het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte (U24 NS072026 nationale hersenen en weefsel resource voor de ziekte van Parkinson en verwante aandoeningen), het Nationaal Instituut voor veroudering (P30AG19610 Arizona Alzheimer Disease core Center), de Arizona Department of Health Services (contract 211002, Arizona Alzheimer Research Center), de Arizona Biomedical Research Commission (contracten 4001, 0011, 05-901 en 1001 aan het Arizona Parkinson disease Consortium) en de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson27. Deze studie werd ook gesteund door de DHS en de staat Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). We bedanken ook Andrea Schmitt (banner Research) en Cynthia lechuga (TGen) voor administratieve ondersteuning.

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het welzijn van de mens. Hersenen weefsels werden verkregen uit de banner Sun Health Research Institute hersenen en lichaam donatieprogramma in Sun City, AZ. De operaties van het brein-en lichaams donatieprogramma zijn goedgekeurd door de Western Institutional Review Board (WIRB protocol #20120821). Alle onderwerpen of hun wettelijke vertegenwoordigers ondertekenden de geïnformeerde toestemming. Commerciële (niet-hersen) biospecimens werden aangekocht bij Proteogenex.
1. behandeling met RNase R
Opmerking: In de volgende stappen wordt het reactievolume ingesteld op een totaal volume van 50 μL. Dit is het minimale monstervolume dat moet worden gebruikt in de RNA Cleanup & concentratorkit (Zie tabel met materialen). Bovendien is het hier beschreven geoptimaliseerde protocol voor een ingangs bedrag van 4 μg totaal RNA. Een langere incubatietijd voor de behandeling met RNase R wordt aanbevolen voor een ingangs bedrag > 4 μg.
<ol><li>Verdun totaal RNA tot 4 μg in 39 μL RNase-vrij water in een micro centrifugebuis en meng goed door pipetteren.</li>
	<li>Verdun de RNase R in een aparte buis tot een werkconcentratie van 2 U/μL met 1x RNase R-reactie buffer. Maak alleen genoeg voor direct gebruik.</li>
	<li>Pipetteer 39 μL totaal RNA en 5 μL 10x RNase R-reactie buffer in een reactie buis van 1,5 mL en meng goed door pipetteren (50 μL zal het totale reactievolume zijn). Voeg vervolgens 6 μL RNase R (2 U/μL) toe.</li>
	<li>Stel de pipet in op het volledige reactievolume (50 μL) en meng goed door 10 keer op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Plaats de buis gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C. Zorg ervoor dat het volledige reactievolume wordt ondergedompeld in het waterbad.</li>
	<li>Plaats de buis op ijs en ga onmiddellijk verder met RNA Cleanup & concentratie (rubriek 2).</li>
</ol>2. zuiverende RNA met behulp van een RNA Cleanup en concentrator Kit
Opmerking: Bij het gebruik van RNA van hoge kwaliteit (RIN > 8, DV200 > 80%), kan behandeling met RNase R leiden tot verlies van ongeveer 60% RNA. Met een input van 4 μg wordt geschat dat 2 – 2,5 μg behandeld RNA na sectie 1 overblijft.
<ol><li>Voordat u begint, bereidt u de RNA-reinigings buffer voor door 48 mL 100% ethanol toe te voegen aan het buffer concentraat en goed te mengen door pipetten. Plaats zuiverings kolommen in Verzamel buisjes (Zie tabel met materialen) en plaats in een buisrek. Opmerking: Gebruik de volgende Centrifugeer instellingen voor alle volgende stappen: 10000 – 16000 x g. Als DNase I behandeling al is uitgevoerd, Skip DNase I behandeling in dit stadium.</li>
	<li>Voeg 2 volumes RNA bindings buffer toe aan het met RNase R behandelde monster en meng goed door pipetteren (totaal volume: 150 μL).</li>
	<li>Voeg 1 volume 100% ethanol toe aan de RNA-bindings buffer en het RNase R-behandelde monster mengsel en meng goed door pipetteren (totaal volume: 300 μL).</li>
	<li>Breng het volledige volume over naar de kolom en centrifugeer de kolom voor 30 s. Gooi de stroom door.</li>
	<li>Voeg 400 μL RNA prep-buffer direct toe aan de kolom, centrifugeer de kolom voor 30 s en gooi de stroom door.</li>
	<li>Voeg 700 μL RNA-reinigings buffer direct toe aan de kolom, centrifugeer de kolom voor 30 s en gooi de stroom door.</li>
	<li>Voeg 400 μL RNA-reinigings buffer direct toe aan de kolom, centrifugeer de kolom 2 minuten en breng de kolom over naar een verse, RNase-vrije 1,5 mL-buis.</li>
	<li>Voeg 11 μL RNase-vrij water direct toe aan de kolom door de pipetpunt recht boven het kolom filter te houden en ervoor te zorgen dat het water alleen landt op het kolom filter.</li>
	<li>Incuberen de kolom gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en Centrifugeer gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Voordat u de kolom weggaat, controleert u of er doorheen stroomt in de RNase-vrije buis. Als de elutie succesvol was, winkel monster bij-80 °C of onmiddellijk doorgaan met de voorbereiding van de bibliotheek. Het uiteindelijke totale elutie volume van ongeveer 10 μL wordt gebruikt voor de opbouw van de wisselaar. Opmerking: Stoppunt: laat RNA bij-80 °C gedurende maximaal 7 dagen voordat u doorgaat met het voorbereiden van de bibliotheek.</li>
</ol>3. circRNA bibliotheek prep
Opmerking: Zie tabel met materialen voor Kit, die de meeste reagentia bevat die in deze sectie worden gebruikt.
<ol><li>rRNA uitputting en fragmentatie<ol>
<li>Breng 10 μL gezuiverd RNA over van stap 2,10 naar een schone put in een nieuwe 96-well 0,3 mL PCR-plaat. Voeg aan de put 5 μL rRNA-bindings buffer toe, gevolgd door 5 μL rRNA-verwijderings mengsel. Pipetteer 10 keer zachtjes omhoog en omlaag om te mengen.</li>
		<li>Afdicht plaat en inbroed gedurende 5 minuten bij 68 °C op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok. Na voltooiing van de incubatie van 5 minuten, plaats de plaat op de Bank en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Verwijder de afdichting van de plaat. Voeg toe 35 μL gevortext kamertemperatuur rRNA verwijderings kralen om te monster nemen. Stel de pipet in op 45 μL en Pipetteer op en neer 10 – 20x om grondig te mengen. Incuberen plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Breng de plaat aan op een magnetische standaard en inincuberen op de standaard gedurende 1 min of totdat de oplossing wordt gewist. Breng alle supernatant (~ 45 μL) over naar een nieuwe put op dezelfde plaat of een nieuwe plaat (afhankelijk van het aantal monsters waarmee u werkt).</li>
		<li>Vortex de RNA Cleanup kralen (Zie tabel van de materialen) tot goed gedispergeerd, en voeg 99 μL kralen aan elk monster. Pipetteer op en neer 10x om te mengen. Inbroed de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Breng de plaat over naar de magnetische standaard en inbroed een extra 5 min of totdat de oplossing wordt gewist. Verwijder alle supernatant van de put en gooi deze weg.</li>
		<li>Met de plaat nog steeds op de magnetische standaard, voeg 200 μL vers bereide 80% EtOH aan de put zonder verstoring van de kralen. Inbroed voor 30 sec., verwijder dan en gooi ethanol weg. Herhaal dit voor een totaal van 2 was's.</li>
		<li>Voeg aan elk goed 11 μL elutie buffer toe en Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om te mengen. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, en vervolgens overbrengen naar de magnetische stand totdat de oplossing wordt gewist (1 – 5 min).</li>
		<li>Breng 8,5 μL van het supernatant van de put over naar een nieuwe put op dezelfde plaat of naar een nieuwe plaat. Voeg 8,5 μL van de Elute, primer, fragment High mix toe aan elk goed dat monster bevat. Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om grondig te mengen.</li>
		<li>Voor 8 minuten bij 94 °C op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok. Verwijder van Thermocycler wanneer het 4 °C bereikt en centrifugeer kort. Opmerking: Ga onmiddellijk naar het synthetiseren van het eerste onderdeel cDNA-protocol.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthetiseren van cDNA<ol>
<li>Meng, voor elk monster dat wordt bereid, 9 μL eerste streng synthese mengsel met 1 μL reverse transcriptase (Zie tabel met materialen). Voeg 8 μL van het mengsel toe aan het monster. Pipetteer 6 keer omhoog en omlaag om te mengen.<ol>
<li>Afdichtings plaat en incuberen op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok met de volgende parameters: 25 °C gedurende 10 min, 42 °C gedurende 15 min, 70 °C gedurende 15 min, 4 °C vasthouden. Ga onmiddellijk naar de tweede streng synthese.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voeg 5 μL resuspensie buffer toe aan elk monster, gevolgd door 20 μL van de tweede streng Markeer Master Mix. Pipetteer het volledige volume 6 keer omhoog en omlaag.</li>
		<li>Afdichtings plaat en incuberen op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok dat is ingesteld op 16 °C gedurende 1 uur. Na incubatie verwijdert u de plaat van de thermocycler en laat u deze op kamertemperatuur komen.</li>
		<li>Vortex PCR-zuiverings kralen (Zie tabel met materialen) en voeg 90 μL kralen toe aan elk goed van monster. Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om grondig te mengen. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 min.</li>
		<li>Breng de kraal/monster mix over naar de magnetische standaard en inbroed gedurende 5 minuten of totdat de vloeistof wordt gewist. Verwijder en gooi supernatant weg.</li>
		<li>Voeg aan elk monster 200 μL van 80% EtOH toe. Inincuberen monsters op de magnetische standaard bij kamertemperatuur gedurende 30 s. Gooi de supernatant weg. 1x herhalen.</li>
		<li>Laat kralen drogen bij kamertemperatuur gedurende 6 minuten en haal ze vervolgens uit de magnetische standaard.</li>
		<li>Resuspensie-buffer met parels in 19,5 μL. Pipetteer 10 keer omhoog en omlaag om grondig te mengen. Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, vervolgens overbrengen naar de magnetische standaard en inbroed gedurende 1 minuut of totdat de vloeistof wordt gewist.</li>
		<li>Breng 17,5 μL supernatant over naar een nieuw goed/nieuw plaatje. Opmerking: Als u niet onmiddellijk doorgaat, kunnen de monsters tot 7 dagen bij-20 °C worden bewaard.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van de bibliotheek<ol>
<li>Voeg aan elke put met supernatant 12,5 μL A-een mengsel toe. Pipetteer het hele volume 10 keer omhoog en omlaag om te mengen.</li>
		<li>Inbroed de reactie op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok ingesteld op 37 °C met behulp van de volgende parameters: 37 °C gedurende 30 min, 70 °C gedurende 5 min, 4 °C vasthouden. Wanneer monsters 4 °C bereiken, ga dan onmiddellijk naar de ligatie van de adapter.</li>
		<li>Voeg aan elk monster 2,5 μL resuspensie buffer, 2,5 μL van een unieke RNA-adapter en 2,5 μL Ligatie mengsel toe. Pipetteer op en neer 10x om te mengen.</li>
		<li>Inbroed monsters op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok bij 30 °C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Voeg aan elk monster 5 μL stop Ligatie buffer toe en Pipetteer omhoog en omlaag om te mengen.</li>
		<li>Voeg aan elk monster 42 μL gemengde PCR-zuiverings kralen toe en meng grondig. Volg stappen 3.2.6 tot en met 3.2.10, maar verander het resuspensie volume naar 52 μL en het uiteindelijke elutie volume tot 50 μL.</li>
		<li>Herhaal het PCR-zuiverings kraal-protocol opnieuw met de 50 μL elutie uit stap 3.3.6, maar verander het resuspensie volume naar 22 μL en het uiteindelijke elutie volume tot 20 μL. Opmerking: Als u niet onmiddellijk doorgaat, kunnen de monsters tot 7 dagen bij-20 °C worden bewaard.</li>
		<li>Voeg aan elk monster 5 μL PCR-primer cocktail en 25 μL PCR-Master-Mix toe. Meng door 10 keer omhoog en omlaag te pipetteren. Incuberen de reactie op een voorgeprogrammeerd, voorverwarmd Thermocycler-blok met de volgende parameters: 98 °C gedurende 30 sec.; vervolgens 8 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 30 sec. en 72 °C gedurende 30 sec.; dan 72 °C gedurende 5 min, daarna 4 °C vasthouden. Opmerking: Optimalisatie van het totale aantal PCR-cycli kan nodig zijn voor het genereren van voldoende hoeveelheden bibliotheek voor sequentiëren.</li>
		<li>Volg het protocol voor PCR-kraal zuivering (stappen 3.2.4 tot en met 3.2.9), behalve Voeg 50 μL goed gemengde PCR-zuiverings parels toe en verander het resuspensie volume tot 32,5 μL met een eind elutie volume van 30 μL. Opmerking: De monsters moeten bij-20 °C worden bewaard.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantificering en kwaliteitscontrole met behulp van een nucleïnezuur analysator<ol>
<li>Laat tapes en reagentia gedurende 30 minuten op kamertemperatuur gaan.</li>
		<li>Meng 2 μL bibliotheek met 2 μL HS D1000 buffer, en voeg toe aan een compatibele goed plaat.</li>
		<li>Dicht strak met compatibele folie afdichting en Vortex gedurende 1 minuut bij 2.000 rpm.</li>
		<li>Spin down en laadplaat op de Analyzer na software prompts. Opmerking: Bibliotheken moeten ongeveer 260 BP groot zijn.</li>
	</ol></li>
</ol>4. workflow voor gegevensanalyse
<ol><li>Volgorde RNA-SEQ-bibliotheken (Zie tabel met materialen) voor het genereren van 82 BP gekoppelde-eind leesbewerkingen. Zet onbewerkte sequentiëren van gegevens in de vorm van basecall bestanden (. BCL) naar FASTQs met behulp van de bcl2fastq tool (v 0.2.19).</li>
	<li>Detecteer Circrna's. Opmerking: Op basis van eerder gerapporteerd bewijs dat een ensemble circrna detectie benadering beter presteert in vergelijking met het gebruik van een enkele detectie tool21,22, raden we aan om meerdere tools te gebruiken voor circrna detectie. Hier werden Circrna's geïdentificeerd met behulp van zes bestaande circRNA Voorspellings algoritmen: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE en DCC, waarbij de aanbevolen parameterinstellingen voor elk algoritme worden toegepast.<ol>
<li>Downloaden en installeren van elke circRNA detectie-algoritme op een Linux High Performance Computing-Cluster met behulp van de instructies die door de ontwikkel ontwikkelaars.</li>
		<li>Lijn RNA-SEQ-FASTQs uit tegen het referentie-genoom (GRCh37), waarbij de aligner wordt aanbevolen voor elk gereedschap.</li>
		<li>Na de uitlijning voert u circRNA-detectie algoritmen uit door de respectieve aanbevolen parameterinstellingen toe te passen.</li>
		<li>Elk hulpprogramma zal een bestand met resultaten met meerdere kolommen uitvoeren met de lijst van gedetecteerde Circrna's, de coördinaten van de circRNA en het aantal ondersteunende leesbewerkingen hiervan uitpakken om het aantal kandidaten te kwantificeren dat in elke monster/testvoorwaarde is gedetecteerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converteer de circRNA-coördinaten uitvoer door CIRI, Mapsplice en DCC naar 0-gebaseerde coördinaten om consistent te zijn met de andere drie algoritmen.</li>
	<li>Selecteer Circrna's met twee of meer ondersteunende Lees-of downstreamanalyses en vergelijkingen. Tabel 1 bevat een overzicht van alle parameters die in onze studie zijn geëvalueerd, samen met het totale aantal sequentiëren leesbewerkingen die voor elk voorbeeld worden gegenereerd.</li>
	<li>Tel voor elke sample/testvoorwaarde het aantal gedetecteerde Circrna's dat is genormaliseerd naar het aantal toegewezen leesbewerkingen dat voor die bibliotheek is gegenereerd, per miljoen. Vat de resultaten samen in de verschillende tools/samples in boxplots, zoals beschreven in de representatieve resultaten.</li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733(2012).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li>
<li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li>
<li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrambled+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).</li>
<li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li>
<li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li>
<li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p%2FmiR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919(2016).</li>
<li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIRI%3A+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MapSplice%3A+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).</li>
<li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).</li>
<li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant%2C+conserved%2C+and+dynamically+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li>
<li>Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).</li>
<li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).</li>
<li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACValidator%3A+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li>
<li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circular+RNAs%3A+bioinformatic+and+experimental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li>
<li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).</li>
<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie werden twee in de handel verkrijgbare bibliotheek voorbereidings kits, voorbehandelings opties en input RNA-bedragen getest om een circRNA-verrijkings protocol voor de bouw van circRNA-sequencing-bibliotheken te optimaliseren. Op basis van de beoordelingen van deze studie, zijn een aantal belangrijke aspecten en kritieke stappen bij het maken van circRNA-sequencing bibliotheken duidelijk. Onze evaluatie bevestigt het nut van RNase R voor behandeling, zoals weergegeven door het toegenomen aantal Circrna's g...

Circulaire rna's (circrna's) zijn endogene, niet-Codeer rna's die aandacht hebben gekregen gezien hun pervasieve expressie in de eukaryote transcriptome1,2,3. Ze worden gevormd wanneer exonen terug-Splice aan elkaar en dus werden aanvankelijk beschouwd als splicing artefacten4,5. Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat circrnas celtype, weefsel en ontwikkelingsfase specifieke expressie3,6 vertoont en evolutionair wordt bewaard op2,3. Bovendien zijn ze betrokken bij de bemiddeling van eiwit-eiwit interacties7, micro-RNA (Mirna) binding3,8,9,10, en regulering van ouderlijke genen transcriptie11.
In de klassieke RNA-sequencing (RNA-SEQ), kan circRNAs volledig verloren gaan tijdens de bibliotheek constructie als gevolg van poly-een selectie voor Mrna's of kan het moeilijk zijn om te isoleren gezien hun geringe overvloed. Recente circrna-karakterisering studies hebben echter een voorbehandelings stap opgenomen met behulp van RNase R om te verrijken voor circrnas2,12,13. RNase R is een exoribonuclease die lineaire Rna's verteerd, waardoor circulaire RNA-structuren achterblijven. CircRNA verrijking protocollen werden geoptimaliseerd door het genereren en vergelijken van gegevens van twee commercieel beschikbare hele transcriptome bibliotheek bouwkits, met en zonder een RNase R voor behandeling stap, en het gebruik van verschillende hoeveelheden totaal RNA input (1 tot 4 μg). Het geoptimaliseerde protocol werd vervolgens gebruikt om de overvloed aan Circrna's te evalueren in vijf verschillende hersengebieden (cerebellum [BC], inferieure Pariëtale kwab [IP], middelste temporele gyrus [MG], occipitale cortex [OC] en superieure frontale gyrus [SF]) en vier andere weefsel typen (lever [LV], Long [LU], lymfeklier [LN] en alvleesklier [PA]). RNA-SEQ-bibliotheken werden gekoppeld aan de eind geordend en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van zes verschillende circrna Voorspellings algoritmen: find_circ3, ciri14, mapsplice15, Knife16, DCC17en circexplorer18. Op basis van onze analyse werd het hoogste aantal unieke Circrna's gedetecteerd bij het gebruik van een gestrande totale RNA Library Preparation Kit met RNase R voor behandeling en 4 μg totaal input RNA. Het geoptimaliseerde protocol wordt hier beschreven. Zoals eerder gemeld19,20, de hoogste verrijking van circrnas werd waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefsel soorten.

<table><tbody><tr><td>1,000 &micro;L pipette tips</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;L pipette tips</td><td>Rainin</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L pipette tips</td><td>Rainin</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Accessoires (folieafdekkingen)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Accessoires (tips)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>Zelfklevende film voor microplaten</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads 450 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>PCR-zuivering</td></tr><tr><td>Eppendorf twin.tec 96-wells PCR-platen</td><td>VWR</td><td>951020401</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 reagentia</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycli)</td><td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycli)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Kapa Total RNA Kit</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol van moleculaire biologie kwaliteit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sense Assay Kit</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNA cleanup en concentrator - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>Bevat zuiveringskolommen, opvangbuisjes</td></tr><tr><td>RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td></td><td>RNA Cleanup beads</td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase 10.000 eenheden</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Nucleïnezuur analyzer</td></tr><tr><td>TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>20020596</td><td>Kit gebruikt in sectie 3</td></tr><tr><td>Twee-compartimenten verdeelde lade</td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Water</td><td>Supply Center by Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Universele controle RNA</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van circulaire rna's met rna-sequencing

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn een klasse van niet-Codeer Rna's die betrokken zijn bij functies zoals micro-RNA (miRNA)-regulering, bemiddeling van eiwit-eiwit interacties en regulering van de transcriptie van ouder genen. In de klassieke volgende generatie RNA sequencing (RNA-SEQ), Circrna's worden meestal over het hoofd gezien als gevolg van poly-een selectie tijdens de bouw van mRNA Bibliotheken, of zijn te vinden op zeer lage overvloed, en zijn daarom moeilijk te isoleren en op te sporen. Hier werd een circRNA Library Construction protocol geoptimaliseerd door het vergelijken van bibliotheek voorbereidings kits, pre-behandelingsopties en verschillende totaal RNA input bedragen. Twee in de handel verkrijgbare complete transcriptome bibliotheek voorbereidings kits, met en zonder RNase R voor behandeling, en het gebruik van variabele hoeveelheden RNA input (1 tot 4 μg), werden getest. Ten slotte, meerdere weefsel typen; waaronder lever, longen, lymfeklieren en pancreas; naast meerdere hersengebieden; met inbegrip van de cerebellum, inferieure Pariëtale kwab, middelste temporele gyrus, occipitale cortex, en superieure frontale gyrus; werden vergeleken om de overvloed van circRNA over weefsel typen te evalueren. Analyse van de gegenereerde RNA-SEQ-gegevens met behulp van zes verschillende circRNA-detectietools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC en CIRCexplorer) onthulde dat een gestrande Total RNA Library-Voorbereidingspakket met RNase R voor behandeling en 4 μg RNA-input de optimale methode voor het identificeren van het hoogste relatieve aantal Circrna's. In overeenstemming met eerdere bevindingen werd de hoogste verrijking van circRNAs waargenomen in hersenweefsels in vergelijking met andere weefsel typen.

Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van een in de handel verkrijgbare universele controle RNA (UC) en met behulp van twee bibliotheek voorbereidings kits, die beide een ribo-depletie-stap in hun protocollen bevatten, werden eerst beoordeeld. Met behulp van een analytische workflow (Data Analysis workflow, sectie 4), over het algemeen, werd een hoger aantal Circrna's gedetecteerd in de TruSeq datasets in vergelijking met de Kapa Ones (Figuur 1). Hoewel de ribosomale RNA (rRNA) percentage...

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn niet-Codeer Rna's die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Dit protocol is het resultaat van de evaluatie van de belangrijkste aspecten van circRNA-bibliotheekvoorbereiding, zoals het type kit, RNase R-behandeling, invoerbedragen en hun impact op circRNA-detectie. Het maakt een optimale circRNA-detectie mogelijk en levert gegevens over aanpasbare parameters, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker. Het identificeren van circRNAs in verschillende monstertypen zal ons helpen om de verdeling van hun expressie beter te begrijpen en stelt de weg in voor het afbakenen van de functionele rol van deze moleculen.Deze methode kan worden toegepast op elk totaal RNA-monster. Het is belangrijk om RNA-monsters op ijs te houden voordat het protocol wordt begin. Beoordeel de RIN- en DV200-waarden op de Agilent Bioanalyzer of TapeStation vóór de voorbereiding en volg de juiste procedures bij het werken met RNA.Begin met het verdunnen van het totale RNA tot vier microgram in 39 microliter RNase-vrij water en pipetten het op en neer te mengen. Gebruik in een aparte buis 1x RNase R Buffer om de RNase R te verdunnen tot een werkconcentratie van twee eenheden per microliter. Pipette 39 microliters van totale RNA en vijf microliters van 10x RNase R Reaction Buffer in een 1,5-microliter reactiebuis, en meng.Voeg zes microliter van de verdunde RNase R.Vervolgens de pipet aan te passen aan het volledige reactievolume en meng de oplossing door 10 keer op en neer te pipetten. Plaats de buis in een 37-graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten, zorg ervoor dat het volledige reactievolume wordt ondergedompeld in het waterbad. Plaats vervolgens de buis op ijs en ga onmiddellijk verder met RNA-opruimen en concentratie.Bereid de RNA Wash Buffer voor voordat u begint met het mengen van het concentraat met 48 milliliter ethanol van 100% en plaats zuiveringskolommen in opvangbuizen. Voeg twee delen RNA Binding Buffer toe aan het RNase R-behandelde monster en meng goed. Voeg 150 microliter van 100% ethanol toe aan het mengsel voor een totaal van 300 microliter, breng het volledige volume over naar de kolom en vercentrifuge gedurende 30 seconden.Verwijder de stroom door, en voeg 400 microliter van RNA Prep Buffer rechtstreeks aan de kolom. Centrifuge gedurende 30 seconden, en gooi de stroom door. Voeg vervolgens 700 microliter RNA Wash Buffer toe aan de kolom, centrifuge gedurende 30 seconden en gooi de stroom door.Voeg nog eens 400 microliter van de Wasbuffer toe, centrifuge gedurende twee minuten en breng de kolom over naar een verse RNase-vrije buis van 1,5 milliliter. Voeg voorzichtig 11 microliter RNase-vrij water direct aan de kolom door de pipetpunt recht boven het kolomfilter te houden. Laat het monster een minuut op kamertemperatuur zitten en centrifuger het vervolgens gedurende één minuut.Zorg ervoor dat er stroom door in de 1,5-milliliter buis, en gooi de kolom. Het gezuiverde RNA-monster kan worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius of onmiddellijk worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek. Breng 10 microliter van het gezuiverde totale RNA over naar een schone put in een 96-well PCR-plaat.Voeg vijf microliters rRNA Binding Buffer toe, gevolgd door vijf microliters rRNA Removal Mix, enpipet vervolgens zachtjes op en neer om de reagentia te mengen. Verzegel de plaat en broed het vijf minuten uit bij 68 graden Celsius op een voorgeprogrammeerd en voorverwarmd thermocyclerblok. Laat de plaat na de incubatie een minuut op kamertemperatuur zitten.Verwijder de afdichting van de plaat en voeg 35 microliter vortexed kamertemperatuur rRNA verwijdering kralen aan het monster. Pas de pipet aan op 45 microliters en pipet 10 tot 20 keer op en neer om grondig te mengen. Laat de plaat een minuut op kamertemperatuur zitten.Breng de plaat naar een magnetische standaard en broed deze daar een minuut of totdat de oplossing is gewist. Breng de supernatant naar nieuwe goed op de plaat. Breng vervolgens de plaat van de magnetische standaard over naar de plaatstandaard.Vortex RNA opruimen kralen totdat ze goed zijn verspreid, en voeg 99 microliter kralen aan het monster. Pipette op en neer om te mengen, en de plaat in tecuniseren bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng de plaat naar de magnetische standaard, en laat het daar voor vijf minuten of totdat de oplossing wist, verwijder en gooi alle supernatant uit de put.Met de plaat nog steeds op de magnetische standaard, voeg 200 microliters van vers bereide 80% ethanol aan de put zonder verstoring van de kralen. Laat de ethanol in de put gedurende 30 seconden, verwijder en gooi het. Voeg 11 microliter elution buffer aan de put, en pipette het op en neer te mengen.Broed de plaat twee minuten op kamertemperatuur, breng deze vervolgens terug naar de magnetische standaard en bewaar hem daar totdat de oplossing is opgelost. Breng 8,5 microliter van de supernatant naar een nieuwe put op dezelfde plaat, en voeg 8,5 microliter van Elute, Primer, Fragment High Mix aan elke put met een monster. Pipet op en neer 10 keer om grondig te mengen, verzegelen de plaat, en uitbroeden gedurende acht minuten in een thermocycler voorverwarmd tot 94 graden Celsius.Koel het monster tot vier graden Celsius, verwijder de plaat uit de thermocycler en centrifuge het kort. Twee bibliotheekvoorbereidingskits, TruSeq en KAPA, werden voor dit protocol beoordeeld. Over het algemeen werd een hoger aantal cirkel-RNAs en een lager percentage ribosomale RNA gedetecteerd bij het gebruik van de TruSeq-kit, dus TruSeq werd geselecteerd voor verdere experimenten.De betekenis van RNase R-voorbehandeling werd geëvalueerd door de gegevens te vergelijken die zijn gegenereerd uit voorbehandelde en niet-voorbehandelde bibliotheken. Zoals verwacht werd in de voorbehandelde bibliotheken consequent een groter aantal circulaire RNA's geïdentificeerd in vergelijking met niet-voorbehandelde bibliotheken. De hoeveelheid input RNA werd geoptimaliseerd voor het detecteren van een hogere diversiteit aan circulaire RNAs.Bibliotheken werden bereid met behulp van een, twee en vier microgram van input RNA, en de hoogste diversiteit van circulaire RNA soorten werd waargenomen bij het gebruik van vier microgram van het totale RNA. Het geoptimaliseerde protocol werd gebruikt om circulaire RNA overvloeden te vergelijken in vijf hersengebieden van vier gezonde donoren en voor andere weefselsoorten van zes gezonde donoren. Over het algemeen werd een hogere overvloed aan circulaire RNase waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefseltypen.Het is belangrijk om te onthouden om de juiste procedures te volgen bij het werken met RNA, met inbegrip van het dragen van handschoenen, het grondig reinigen van de bank en pipetten met RNase doekjes of spray voordat u het protocol, en het houden van RNA op ijs vooraf. Na deze procedure kan orthogonale validatie worden uitgevoerd, zoals Sanger sequencing van geïdentificeerde circRNA-knooppunten. De ontdekking van nieuwe circRNAs en verder bewijs van hun aanwezigheid kerft een nieuw onderzoeksgebied voor het verkennen van hun biologische functies.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We klonen en analyseren reporter genen die circulaire RNA's genereren. Deze reporter genen zijn groter dan constructies om lineaire splicing te analyseren en Alu-elementen bevatten. Om de cirkelvormige RNAs te onderzoeken, worden de constructies omgezet in cellen en wordt resulterend RNA geanalyseerd met behulp van RT-PCR na verwijdering van lineair RNA.

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

Hier presenteren we een protocol om endogene RNA binding sites of "Footprints" van RNA: proteïne (RNP) complexen uit zoogdiercellen te verrijken. Deze aanpak omvat twee immunoprecipitaties van RNP-subeenheden en wordt daarom nagesynchroniseerde RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT).

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

We presenteren een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie door het combineren van circulaire RT-PCR, kwantitatieve RT-PCR, RNA 5 ' poly hosphatase-Treatment, en Northern Blot. Dit protocol bevat een normalisatie stap om de invloed van onstabiel 5 ' trifosfaat te minimaliseren, en het is geschikt voor het discrimineren en in kaart brengen van de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn verzameld in maïs-mitochondrion.

Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

Het hier ingediende protocol verklaart de volledige in silico-pijplijn die nodig is om circRNA's te voorspellen en functioneel te karakteriseren uit RNA-sequencing transcriptoomgegevens die gastheer-pathogeeninteracties bestuderen.

In Silico Identificatie en karakterisering van circRNA's tijdens gastheer-pathogeen interacties

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Enkele cel sequencing is een steeds populairder en toegankelijk instrument voor de aanpak van genomische veranderingen op hoge resolutie. Wij bieden een protocol dat enkele cel sequencing gebruikt om het aantal kopieën veranderingen te identificeren in enkele cellen.

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Hier worden we gedetailleerd beschreven over de methode van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-wide mapping van intramoleculaire en intermoleculaire RNA-RNA interacties in vivo mogelijk maakt . SPLASH kan toegepast worden om RNA-interacties van organismen te bestuderen, waaronder gist, bacteriën en mensen.

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Galaxy en David hebben zich ontwikkeld tot populaire tools die het mogelijk maken de onderzoekers zonder bioinformatica training te analyseren en RNA-Seq gegevens te interpreteren. We beschrijven een protocol voor C. elegans onderzoekers RNA-Seq experimenten toegang voeren en verwerken dataset behulp Galaxy en zinvolle biologische informatie uit het gen lijsten met behulp DAVID verkrijgen.

Transcriptoom analyse<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project

We beschrijven een originele transfer-RNA analyse platform genaamd SPOt (gestroomlijnde Platform voor de waarneming van tRNA). Ter plaatse gelijktijdig maatregelen cellulaire niveaus van alle tRNAs in biologische monsters, in slechts drie stappen en in minder dan 24 uur.

Metabole Labeling en profilering van overdracht RNAs met behulp van Macroarrays

Leer hoe je circulaire RNA's identificeert met RNA-sequencing door optimale bibliotheekvoorbereiding met RNase R-behandeling. Deze methode verbetert circRNA-detectie in totale RNA-monsters.

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

Meer video's verkennen