Murine cervicaal aorta transplantatie model met behulp van een gemodificeerde niet-hecht manchet techniek
2 november 2019
Hier presenteren we een protocol van heterotopische aorta transplantatie in muizen met behulp van de niet-hecht manchet techniek in een cervicale Murine model. Dit model kan worden gebruikt om de onderliggende pathologie van chronische transplantaat vasculopathie (CAV) te bestuderen en kan helpen bij het evalueren van nieuwe therapeutische middelen om de vorming ervan te voorkomen.
Ik ben Martin Ryll van de onderzoekslaboratoria van het departement Viscerale en transplantatiechirurgie van de LMU in München. Vandaag gaan we u een murine heterotopische aortatransplantatie model met behulp van een gemodificeerde niet-hechting manchet techniek. Verdoven het ontvangende dier eerst met een intraperitoneale injectie van midazolam, medetomidine en fentanyl.
Knip alle haren van het cervicale laterale gebied met een elektrische haarknipper voor kleine dieren en breng oogheelkundige zalf aan met wattenstaafjes om te voorkomen dat de ogen tijdens de procedure uitdrogen. Plaats het dier in de supine positie op een verwarmingskussen onder de microscoop en plak zachtjes zijn benen aan de operatietafel met huidgevoelige gipsstrips. Kantel zijn hoofd naar achteren en schrob het operatieve veld meerdere malen met alcohol.
Maak een huidincisie van de halsslagader incisie naar de rechter onderkaak met kleine schaar. Verwijder de rechter onderste kwab van de submandibulaire klier via bipolaire cautery van de vaatpedicula en de daaropvolgende excisie met microschaar. Verwijder de rechter sternocleidomastoïde spier via bipolaire cautery van het bovenste en onderste gedeelte en de daaropvolgende excisie met micro schaar om toegang te krijgen tot de gemeenschappelijke halsslagader.
Mobiliseer de gemeenschappelijke halsslagader zo ver mogelijk distally en proximally door het omringende bindweefsel uit elkaar te trekken met fijne tangen. Bind twee 7-0 zijden ligaturen met minimale afstand tussen elkaar rond het midden van de gemeenschappelijke halsslagader en transect de gemeenschappelijke halsslagader met fijne micro schaar tussen de ligaturen. Passeer het proximale ligated einde door de manchet en bevestig het met een kleine slagaderklem.
Verwijder de ligatuur met fijne microschaar zo dicht mogelijk bij de ligatuur en spoel het lumen met gehepariniseerde zoutoplossing met een 30-meter naald terwijl u ervoor zorgt dat de vaatwanden niet worden beschadigd. Distend het open lumen met behulp van fijne vasculaire dilatators en omkeren de halsslagader stomp over de manchet door te trekken zachtjes over de polyamide buis. Bevestig onmiddellijk de omgekeerde halsslagader met een losjes voorgekeerde 7-0 zijden lus.
Voer dezelfde procedure uit aan de andere kant van de halsslagader met de andere manchet. Passeer het distale gevleende uiteinde door de manchet en bevestig het met een kleine slagaderklem. Verwijder de ligatuur met fijne microschaar zo dicht mogelijk bij de ligatuur en spoel het lumen met gehepariniseerde zoutoplossing met een 30-meter naald terwijl u ervoor zorgt dat de vaatwanden niet worden beschadigd.
Distend het open lumen met behulp van fijne vasculaire dilatators en omkeren de halsslagader stomp over de manchet door te trekken zachtjes over de polyamide buis. Bevestig onmiddellijk de omgekeerde halsslagader met een losjes voorgekeerde 7-0 zijden lus. Zet het ontvangende dier opzij en hydrateer de bovenste twee derde met zout tot het aortasegment is uitbeplant.
Verdoven de donormuis op dezelfde manier als het ontvangende dier. Klem alle haren van de buik- en borststreek met een elektrische haarknipper voor kleine dieren en breng oogheelkundige zalf aan met wattenstaafjes om te voorkomen dat de ogen tijdens de procedure uitdrogen. Plaats het dier in de supine positie op een verwarmingskussen onder de microscoop en plak zachtjes zijn benen aan de operatietafel met huidgevoelige gipsstrips.
Schrob het operatieve veld meerdere malen met alcohol. Voer een midline abdominale laparotomie met kleine schaar en duw de darmen iets omhoog om de inferieure vena cava bloot. Injecteer het IVC met een cc gehepariniseerde zoutoplossing met behulp van een 30-meter naald.
Snijd de abdominale aorta en IVC onder de nierslagaders met een kleine schaar om het donordier uit te exsanguineren. Plaats los een kompres in de buik om het bloed te absorberen. Voer een thoracotomie uit via bilaterale afleiding van de ribben met een schaar en kantel de voorste borstwand cranially met een chirurgische klem om het mediastinum bloot te leggen.
Snijd de IVC en de slokdarm direct boven het middenrif met een microschaar. Verwijder het hart en de longen door ze naar boven te tittelen met tangen die de snij-IVC en slokdarm vasthouden en ze vervolgens met een microschaar van de basis uitsnijden om toegang te krijgen tot de thoracale aorta en het rugmediastinum. Mobiliseer de thoracale aorta uit het omliggende weefsel door het omringende bindweefsel en vet uit elkaar te trekken met fijne tangen terwijl ze voorzichtig zijn om geen intercollete slagaders te beschadigen.
Cauterize alle takken van de thoracale aorta met bipolaire cautery tangen en accijns het aorta segment tussen het middenrif en de aortaboog met behulp van micro schaar. Spoel het aortasegment met gehepariniseerde zoutoplossing met een naald van 30 meter terwijl u ervoor zorgt dat de vaatwanden niet worden beschadigd om het resterende bloed of stolsels te verwijderen en de graft over te brengen naar het ontvangende dier. Trek het proximale uiteinde van het donoraortasegment over de proximale manchet bovenop de omgekeerde halsslagader met fijne tangen en bevestig het onmiddellijk met een losjes voorgekeerde 7-0 zijden lus.
Snijd het distale vrije uiteinde van de aortagraft met een microschaar, zodat de graftlengte past in de afstand tussen de twee manchetten. Trek het distale uiteinde van het donoraortasegment over de distale manchet bovenop de omgekeerde halsslagader met fijne tangen en bevestig het onmiddellijk met een losjes vooraf gebonden 7-0 zijden lus. Verwijder eerst de distale klem om retrograde perfusie mogelijk te maken.
Na het bereiken van hemostase, verwijder de proximale klem om de anastomose te voltooien. Sluit ten slotte de wond met 6-0 continue hechting. Na 28 dagen worden de dieren geofferd en de grafts bewaard voor histologische vlekken.
Zoals blijkt uit deze Van-Gieson's vlekken van aortasecties, volledig MHC mismatched allografted aorta's van Balb / c donoren aan zwarte zes ontvangers ontwikkelde een aanzienlijke neointimale hyperplasie resulterend in luminale vernauwing. Aan de andere kant, synogene aortatransplantaties van zwarte zes donoren tot zwarte zes ontvangers ontwikkelden slechts weinig neointimale hyperplasie. Immunofluorescentie kleuring tegen SM22, een marker voor vasculaire gladde spiercellen, zoals te zien is op deze foto in groene fluorescentie, toont aan dat de neointima voornamelijk bestaat uit vasculaire gladde spiercellen.
De murine aortatransplantatie dient als een model voor chronische transplantatie vasculopathie die de meest voorkomende oorzaak van late graft falen. In vergelijking met het orthotopische buikmodel is onze gemodificeerde manchettechniek minder microchirurgisch veeleisend, wat leidt tot een hoog slagingspercentage. Bovendien kunnen variaties van de vasculaire anastomose, gezien in andere microchirurgische transplantatiemodellen, als gevolg van de constante diameter van de manchet worden verwaarloosd.
Bovendien wordt de warme ischemische tijd constant gehouden in de experimentele groepen, omdat het ontvangende dier eerst wordt voorbereid voordat het aortasegment wordt uitbesteed. Ons gewijzigde model moet andere laboratoria helpen om murine aortatransplantatie vast te stellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor heterotope aortatransplantatie bij muizen met behulp van een non-suture cuff-techniek. Dit cervicale muismodel is ontworpen om chronische allograft vasculopathie (CAV) te bestuderen en nieuwe therapeutische middelen te evalueren om de vorming ervan te voorkomen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Transplantatiebiologie
- Vasculair biologie
- Experimentele chirurgie
Achtergrond
- Chronische allograft vasculopathie (CAV) is een belangrijke complicatie bij transplantaties.
- Beter begrip van CAV kan leiden tot betere therapeutische strategieën.
- Diermodellen zijn essentieel voor het bestuderen van transplantatiegerelateerde pathologieën.
- De non-suture cuff-techniek biedt een nieuwe aanpak voor aortatransplantatie.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar muismodel te presenteren voor het bestuderen van CAV.
- Om de werkzaamheid van nieuwe therapeutische middelen in het voorkomen van CAV te evalueren.
- Om chirurgische technieken in transplantatieonderzoek te verfijnen.
Gebruikte methoden
- Anesthesie van ontvangende muizen met midazolam, medetomidine en fentanyl.
- Voorbereiding van de operatieplaats door het knippen van haar en het aanbrengen van oftalmische zalf.
- Positionering van het dier op een verwarmingskussen voor optimale chirurgische omstandigheden.
- Gebruik van een non-suture cuff-techniek voor aortatransplantatie.
Belangrijkste resultaten
- De non-suture cuff-techniek vergemakkelijkt met succes aortatransplantatie.
- Dit model maakt de beoordeling van de ontwikkeling van CAV mogelijk.
- Potentiële therapeutische middelen kunnen met behulp van dit model worden geëvalueerd.
- Verbeterd begrip van de pathofysiologie van CAV is haalbaar met deze aanpak.
Conclusies
- Het gepresenteerde model is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van CAV.
- Het kan leiden tot verbeteringen in therapeutische strategieën voor transplantatiepatiënten.
- Verder onderzoek met behulp van dit model kan ons begrip van transplantatiebiologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Chronic allograft vasculopathy (CAV) remains a leading cause of long-term graft failure in solid organ transplantation, with limited therapeutic options due to incomplete understanding of its pathophysiology. This murine cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique provides a reproducible, minimally microsurgical platform to study CAV mechanisms and evaluate potential interventions. By enabling consistent vascular anastomosis and controlled warm ischemic time, the model supports preclinical de-risking of therapeutic strategies targeting vascular remodeling in transplantation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in vascular pathology by modeling human-relevant neointimal hyperplasia and luminal narrowing in allografted aortas.
- Operational Value: Offers a standardized, suture-free anastomosis that reduces technical variability and supports high success rates across experimental groups.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking of targets involved in smooth muscle cell-mediated vascular remodeling, as demonstrated by SM22-positive neointima formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable output—neointimal hyperplasia and luminal stenosis—enabling dose-response assessment of candidate compounds in a disease-relevant system.
- Operational Value: Ensures assay readiness through constant cuff diameter and standardized surgical timing, minimizing anastomosis-related confounding variables.
- Translational Value: Supports screening readiness by using fully MHC-mismatched allografts to mimic human alloimmune responses in vascular graft failure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models chronic allograft vasculopathy as a progressive pathology, allowing longitudinal assessment of graft changes up to 28 days post-transplant.
- Operational Value: Enables histological and immunofluorescence analysis (e.g., Van-Gieson’s staining, SM22 detection) to validate target engagement and mechanism of action.
- Predictive Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by distinguishing between syngeneic (minimal hyperplasia) and allogeneic (significant hyperplasia) graft responses.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for therapies aimed at inhibiting vascular smooth muscle proliferation or modulating immune-mediated vascular injury in transplantation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathways driving neointima formation, enabling mechanistic de-risking before lead optimization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative vascular outcomes suitable for compound library screening in a standardized surgical model.
- Analytics: Generates measurable endpoints—luminal area, neointimal thickness, smooth muscle marker expression—enabling comparative analysis across treatment groups.
- Translational Research: Mirrors human CAV pathophysiology, supporting continuity from discovery to preclinical validation of vascular-protective agents.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical platform for multiple therapeutic modalities (small molecules, biologics, gene therapies) targeting vascular remodeling in transplant settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by modeling a clinically relevant cause of late graft loss with defined histological and functional readouts.
- Operational Value: Improves reproducibility and reduces inter-animal variability through standardized non-suture cuff technique and controlled operative conditions.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing early evidence of efficacy in preventing pathological vascular remodeling, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of vascular-targeted candidates based on their ability to suppress neointimal hyperplasia in an immunocompetent allograft model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques, including vessel isolation, ligation, and inversion using fine forceps and micro scissors.
- Depends on specialized instrumentation such as vascular dilatators, heparinized saline flush systems, and stereomicroscopes for precise anastomosis.
- Necessitates standardized postoperative care and timed sacrifice (e.g., 28 days) to ensure consistent assessment of chronic vasculopathy development.
- Involves adaptation considerations when extending to different mouse strains or graft sizes, though cuff dimensions help maintain anastomotic consistency.
- Limited to modeling arterial vasculopathy; venous thrombosis or cardiac-specific pathologies require complementary models.
