Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Dit protocol stelt u in staat om een groot aantal functionele antigeen-specifieke T-cellen te genereren die een gewenste veilige benadering zijn bij de behandeling van auto-immuunziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het u voorziet van een zeer efficiënt transductieproces en een groot aantal functionele T-cellen. Deze techniek kan worden uitgebreid voor de behandeling van diabetes type 1 en andere auto-immuunziekten waarbij antigenen bekend zijn.

Bovendien kunnen CAR T-cellen een veelbelovende behandeling zijn voor bepaalde vormen van kanker. Deze methode kan worden gebruikt om immuuncellen te genereren die andere CARs uitdrukken. Het is belangrijk om een goede geaccepteerde techniek te hebben, het hele protocol te lezen en het hele experiment van tevoren te plannen.

Dit twee weken lange protocol bevat mini-stappen en succes is afhankelijk van de juiste prestaties van elke stap. Visuele demonstraties van deze methode is van cruciaal belang voor leerlingen om correct te volgen. Bereid Phoenix cellen voor op transfectie zoals beschreven in het manuscript.

Het is een goede gewoonte om de zijwand te markeren waar medium zal worden toegevoegd en verwijderd om het afblazen van cellen te minimaliseren. Op dag nul aspirate de supernatant uit de cellen en was ze met vijf milliliter PBS. Voeg voorzichtig zeven milliliter verlaagd serum medium dropwise toe aan de zijwand van de plaat en breng de cellen terug naar de couveuse.

Voeg 1,5 milliliter verlaagd serummedium toe aan twee 14 millimeter ronde polypropyleenbuizen. Voeg 40 micrometer transfectiereagens toe aan een van de buizen en 15 microgram antilichaam omgeleid CAR plasmid samen met vijf microgram verpakkingsplasmid aan de andere. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten en voeg vervolgens transfectie reagens aan de plasmid buis.

Meng door de oplossing drie keer voorzichtig op en neer te spuiten en deze minstens 20 minuten op kamertemperatuur uit te broeden. Voeg drie milliliter van het mengsel toe aan de Phoenix cellen en plaats ze in een weefselkweek incubator. Na vier tot vijf uur voeg een milliliter fcs aan de cellen en cultuur ze 's nachts op 37 graden Celsius.

Op de volgende dag, verwijder de supernatant uit de cellen en voeg vier milliliter van verse voorverwarmde cultuur medium. Oogst het virus op dag twee door het virus met medium uit de Phoenix-cellen te verzamelen en te filteren om restcelpuin te verwijderen. Voeg recombinant menselijke IL-2 voorraad aan het virus voor een definitieve concentratie van 200 internationale eenheden per milliliter en gebruik het onmiddellijk voor transductie.

Voeg vier milliliter vers medium toe aan de Phoenix cellen en plaats ze 's nachts in de couveuse. Herhaal het virus verzamelen op de volgende dag voor een tweede transductie en gooi de cellen. Een dag voorafgaand aan het zaaien murine CD8 T cellen, voeg een milliliter van een mengsel van anti-muis CD3 en CD28 antilichamen aan elke put van een 24 put plaat en broeden de plaat 's nachts op vier graden Celsius.

Op dag nul, oogst muis milt en zet ze op een cel zeef weken in 10 milliliter PBS in een cel cultuur schotel op ijs. In een cel cultuur kap, snijd elke milt in drie tot vijf stukken en gebruik een steriele zuiger van een spuit om het weefsel te persen door het gaas. Verwijder voorzichtig rode bloedcellen door splenocyten in één tot vier verdunde rode cellysebuffers voorzichtig te verwijderen en ze vijf minuten lang bij kamertemperatuur uit te broeden en vervolgens 10 microliter van de celsuspensie met Trypan Blue te verdunnen voor het tellen van cellen.

En pellet de rest van de cellen door centrifugeren op 350 keer g gedurende zeven minuten. Gebruik een muis CD8 T cel isolatie kit om CD8 T cellen te verrijken en de cel pellets op te schorten in 400 microliter buffer met 100 microliters van biotine antilichaam cocktail per een keer 10 tot de achtste cellen. Meng de cel suspensie goed en uitbroed het gedurende vijf minuten op vier graden Celsius om antilichaam binding mogelijk te maken.

Voeg vervolgens 300 microliter labelbuffer en 200 microliter anti-biotine microbeads per één keer 10 toe aan de achtste cellen. Meng goed en incubeer voor nog eens 10 minuten op vier graden Celsius. Zet ondertussen een scheidingskolom op de scheidingskosator en was deze met drie milliliter labelbuffer.

Leg een 40 micrometer celzeef op de bovenkant van een kolom en passeer een milliliter van de kraal en de cel mengsel door de zeef in de scheidingkolom. Verzamel de stroom door in een gepekwichte 15 milliliter buis en was de kolom volgens de aanwijzingen van de fabrikant, het verzamelen van afvalwater in dezelfde buis. Tel de cellen en verzamel ze door centrifugatie op 350 keer g gedurende vijf minuten.

Was ze met twee milliliter T-cel medium en centrifuge weer. Dan resuspend ze in voorverwarmde T-cel medium met een concentratie van 250, 000 tot 500.000 cellen per milliliter. Was de eerder bereide CD3- en CD28-gecoate platen met één milliliter steriele PBS drie keer en voeg twee milliliter van de celsuspensie toe aan elke put.

Gebruik een wervelende beweging om cellen gelijkmatig af te zien. Als een controle, plaat hetzelfde aantal CD8 T cellen in een enkele niet-gecoate put van de plaat en de cellen incubeerpen op 37 graden Celsius in een 10% kooldioxide gastank incubator voor 48 uur. Op dag één, bereid menselijke fibronectin fragment gecoate platen door het toevoegen van 0,5 milliliter fibronectin aan de putten van een 24-put plaat en uitbroeden het 's nachts op vier graden Celsius.

Op de volgende dag, verwijder de fibronectin oplossing en voeg een milliliter van 2%BSA en PBS per goed. Incubeer de plaat 30 minuten op kamertemperatuur en was de behandelde putten met één milliliter steriele PBS. De plaat is klaar voor gebruik na het verwijderen van wasoplossing.

Tel de geactiveerde CD8 T-cellen met Trypan Blue. Verzamel ze door centrifugatie. En resuspend ze op vijf miljoen levensvatbare cellen per milliliter voor transductie.

Voeg 100 microliter van de geactiveerde CD8 celsuspensie toe aan elke put van de fibronectin gecoate plaat. Voeg vervolgens 1,5 tot twee milliliter van het eerder voorbereide virus met medium toe en meng met behulp van een wervelende beweging om de cellen gelijkmatig af te geven. Sluit de plaat af in een Ziploc zak en verklein hem op 2.000 keer g gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius.

Haal de plaat uit de centrifuge en breng deze naar een biologische veiligheidskast. Verwijder de plastic zak voorzichtig en zorg ervoor dat de buitenkant van de plaat niet verontreinigd is met medium. Breng de plaat naar een 37 graden Celsius koolstofdioxide incubator.

Na vier uur, verwijder een milliliter medium uit elke put, vervang het door een milliliter van voorverwarmd compleet T-celmedium en zet de plaat terug in de couveuse. De kritieke aspecten van dit protocol zijn een hoog titervirus, gezonde geactiveerde T-cellen en de juiste transductiemethode. Cellen werden mede-gekleurd met PE maat zeven geconjugeerde anti-CD8, AF647 geconjugeerde anti-CD3, en BV 421 geconjugeerde anti-CD28 voor flow cytometrische analyse.

Ongeveer 70% van de CD8 T-cellen co-uitgedrukte GFP die CAR-expressie aangeeft. Ze hebben ook co-uitgedrukt CD28 en CD3. Belangrijk is dat alle van de test GFP positieve cellen ook mede-gekleurd met I-Ag7 insuline BR3 tetramers die expressie van CAR op het celoppervlak aangeeft, maar niet met de controle tetramer.

Bovendien, de gesorteerde test en controle CAR T cellen elk uitgescheiden hoge niveaus van interferon gamma pas na cocultuur met doelcellen uitdrukken van hun cognate liganden die bevestigt dat de getransduceerde cellen hebben een CD8 effector T cel fenotype gericht op het doel van de ouder antilichamen. Transductie van virusproducercellen, isolatie van primaire CD8 T-cellen en activering van deze T-cellen zijn de belangrijkste stappen van dit experiment. Het hebben van gezonde geactiveerde T-cellen en transductie van deze T-cellen met de juiste reagentia zorgt voor gunstige resultaten.

Deze methode kan worden gebruikt om andere T-cellen te transduceren, maar moet worden aangepast voor het specifieke T-celtype. Dit protocol maakt de weg vrij voor de preventie van diabetes type 1 met antigeenspecifieke chimerische antigeenreceptor T-celtherapie.