Hiërarchische en programmeerbare One-pot oligosaccharide synthese
6 september 2019
Dit protocol demonstreert het gebruik van de auto-CHO software voor hiërarchische en programmeerbare One-pot synthese van oligosacchariden. Het beschrijft ook de algemene procedure voor RRV-bepalings experimenten en eenpotglycosylatie van SSEA-4.
We laten zien hoe we onze nieuw ontwikkelde software, Auto-CHO, kunnen gebruiken voor hiërarchische en programmeerbare oligosaccharidesynthese met één pot. Auto-CHO bevat algoritmen op uitgebreide bouwstenen, met relatieve reactiviteitswaarden die worden voorspeld door middel van machine learning. De Auto-CHO software biedt een waardevolle richtlijn voor de bouwsteen selectie, en een hiërarchische blauwdruk voor de meervoudige one-pot synthese van meer complexe glycanen door middel van fragment samenstelling.
De implicaties van deze techniek uit te breiden tot therapie van kanker of infectieziekten door koolhydraat-gebaseerde therapeutische middelen. Voordat u Auto-CHO gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de Java Runtime-omgeving is geïnstalleerd op een pc of Mac. De visuele demonstratie van Auto-CHO software manipulatie en de bijbehorende reactiviteit waarde bepaling experiment zal chemici helpen volgen het protocol, en ga verder met het experiment snel.
Als u softwareinitialisatie van de Java Runtime-omgeving wilt uitvoeren, gaat u naar de Auto-CHO-website en downloadt u de software volgens het besturingssysteem. Momenteel ondersteunt Auto-CHO Windows, macOS en Ubuntu. De nieuwste PDF-gebruikershandleiding is te zien op de Auto-CHO website.
Voor Windows-gebruikers u de Auto-CHO Windows uitritsen. zip, en dubbelklik op Auto-CHO. pot in de map Auto-CHO Windows om het programma te starten.
Voer de gewenste glycan structuur in. Kies ervoor om een glycanstructuur te tekenen of een bestaand structuurbestand te lezen. Als u wilt invoeren door te tekenen, klikt u op het bewerken van glycan door GlycanBuilder of op het gebied van klik hier om het synthetische doel te bewerken om de querystructuur van GlycanBuilder te tekenen en te bewerken.
Koppeling en chiraliteitsinformatie mag niet worden genegeerd. Klik op de knoppen Globo-H, SSEA-4 of OligoLacNAc om de voorbeelden weer te geven. Sluit de GlycanBuilder-dialoog om de bewerking te voltooien.
Definieer de zoekparameters op het tabblad parameterinstellingen om redelijke zoekresultaten te krijgen. Klik op de knop Oke om nieuwe instellingen in te schakelen. De standaardinstelling is om alleen in de experimentele bibliotheek te zoeken.
Als het gewenst is om zowel de experimentele als virtuele bibliotheken te doorzoeken, selecteert u het tabblad virtuele bouwsteenbibliotheek. Selecteer experimentele en virtuele bibliotheken gebruiken en filtering toepassen om virtuele bouwstenen met bepaalde criteria weer te geven. Experimentele en virtuele bouwstenen kunnen samenwerken om het zoekvermogen van Auto-CHO te verbeteren.
Momenteel biedt Auto-CHO meer dan 50.000 virtuele bouwstenen, met voorspelde RRVs in de bibliotheek. Controleer een of meerdere gewenste virtuele bouwstenen die de gebruiker zou willen gebruiken voor het zoeken. Klik op de knop Virtuele bouwstenen weergeven om alleen de geselecteerde virtuele bouwstenen weer te geven.
Klik op de knop Virtuele bouwstenen weergeven om alleen virtuele bouwstenen weer te geven met bepaalde criteria die door de gebruiker zijn gedefinieerd. Klik op de knop Alle virtuele bouwstenen weergeven om alle beschikbare virtuele bouwstenen weer te geven en het filter opnieuw in te stellen. Selecteer het tabblad querystructuur en klik op de knop Bibliotheek voor de zoekbouwsteen om de synthetische oplossingen van één pot voor de querystructuur te vinden.
Bevestig vervolgens de parameterinstellingen. Zoek in de resultaatviewer. Het zoekresultaat wordt weergegeven op het tabblad resultaatvisualisatie.
De reducerende eind acceptoren van verschillende residunummers worden weergegeven in de kolom reducerende eind acceptor. Selecteer vervolgens een reducerende eind acceptor. Oplossingen worden weergegeven op de lijst met synthetische oplossingen.
Fragmenten worden weergegeven in de fragmentlijst om aan te wijzen hoeveel fragmenten in de synthese moeten worden gebruikt. Het systeem biedt gedetailleerde informatie van elk fragment, met inbegrip van de RRV van het fragment, de computationele opbrengst, evenals welke bescherming groep moet worden beschermd voor het gebruik van het fragment in de one-pot reactie. De bouwstenen die worden gebruikt om het geselecteerde fragment te monteren en de fragmentverbindingsinformatie worden ook weergegeven.
Voor experimentele bouwstenen, bekijken en controleren chemische structuren van de geselecteerde bouwstenen in de chemische structuur van de bouwsteen regio, en zie de gedetailleerde informatie bouwsteen browser. In een 10-milliliter ronde bodemkolf, combineren de twee thioglycoside donoren, absolute methanol, en droogriet in DCM. Roer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende een uur.
Neem een 30-microliter aliquot van dit mengsel en injecteer het mengsel in high-performance vloeibare chromatografie in drie afzonderlijke injecties. Meet de coëfficiënt tussen de absorptie en concentratie van het donormolecuul onder de basiseparatievoorwaarden. Voeg een oplossing van 0,5 molar N-Iodosuccinimide in acetonitril toe aan het reactiemengsel, gevolgd door toevoeging van een 0,1 molaire trifluoromethanesulfonic zuuroplossing.
Roer het mengsel op kamertemperatuur gedurende twee uur. Verdun vervolgens het reactiemengsel met vier milliliter DCM. Filter en was de reactie met verzadigd waterig natriumthiosulfaat, dat 10% natriumwaterstofcarbonaat bevat.
Haal nu de waterige laag drie keer met vijf milliliter DCM. Combineer alle organische lagen, en was met vijf milliliter pekel. Droog vervolgens de gecombineerde lagen met ongeveer 200 milligram waterwater magnesiumsulfaat.
Schud het mengsel 30 seconden licht en filtreer het door een trechter met een geribbeld filterpapier om het magnesiumsulfaat te verwijderen. Verzamel vervolgens het filtraat in een ronde bodemkolf van 25 milliliter. Verwijder het oplosmiddel met behulp van een roterende verdamper.
Los het residu op in één milliliter DCM. Neem een 30-microliter aliquot van dit mengsel, en injecteer het in high-performance vloeibare chromatografie in drie afzonderlijke injecties. Meet de concentraties van de resterende donoren door HPLC, onder dezelfde scheidingsomstandigheden.
Meet de relatieve reactiviteit. Op basis van de relatieve reactiviteitswaarde van DR4 is de relatieve reactiviteitswaarde van DX1 drie. Het automatische cho-zoekresultaat op basis van standaardparameterinstellingen geeft aan dat SSEA-4 kan worden gesynthetiseerd door een twee plus één plus drie eenpotreactie.
Wanneer een trisaccharide-reducerende eindacceptor is geselecteerd, toont het programma vier potentiële oplossingen voor de query. De eerste oplossing heeft een fragment, en de berekende opbrengst is ongeveer 94%Het fragment kan worden gesynthetiseerd door twee bouwstenen. De RRV van de eerste disaccharide bouwsteen is 1462, en de RRV van de tweede monosaccharide is 32.0.
De chemische structuur van de eerste voorgestelde bouwsteen die in de één-potreactie wordt gebruikt wordt ook getoond. De one-pot experiment toont aan dat SSEA-4 met succes kan worden gesynthetiseerd in 43%rendement door deze suggestie. SSEA-4 kan worden gesynthetiseerd door drie eenheden voorgesteld door Auto-CHO.
Deze eenheden omvatten silele disaccharide bouwsteen een, monosaccharide bouwsteen twee, en het verminderen van eind acceptor drie. Voor parameterinstellingen raden we aan om parameters in te stellen met strengere criteria aan het begin. Voor de selectie van de bouwsteenbibliotheek raden we aan om de experimentele bibliotheek alleen in eerste instantie te doorzoeken.
Door deze demonstratie hopen we dat belangrijkere glycanen, zoals tumorgeassocieerde koolhydraatantigenen, gesynthetiseerd kunnen worden door de one-pot aanpak voor verdere studies. Na deze procedure kan synthese van al deze antigenen worden uitgevoerd om op koolhydraten gebaseerde kankervaccins te ontwerpen. We hopen ook dat kunstmatige intelligentie en computeralgoritmen geautomatiseerde glycansynthese kunnen faciliteren ten behoeve van de behandeling en preventie van ziekten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert het gebruik van Auto-CHO-software voor de hiërarchische en programmeerbare one-pot synthese van oligosachariden. Het bevat een visuele demonstratie van de softwarebediening en experimenten ter bepaling van de RRV.
Belangrijkste Onderdelen van het Onderzoek
Wetenschappelijk vakgebied
- Oligosacharide-synthese
- Softwareontwikkeling
- Toepassingen van machine learning
Achtergrond
- Auto-CHO-software ondersteunt de synthese van oligosachariden.
- Algoritmen voorspellen relatieve reactiviteitswaarden met behulp van machine learning.
- Er worden richtlijnen gegeven voor de selectie van bouwstenen.
- Implicaties voor therapeutische toepassingen bij kanker en infectieziekten.
Doel van de studie
- Om de functionaliteit van de Auto-CHO software aan te tonen.
- Om een protocol te bieden voor one-pot glycosylering.
- Om de synthese van complexe glycanen via fragmentcompositie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Hiërarchische synthese van oligosachariden.
- Machine learning-algoritmen voor het voorspellen van reactiviteitswaarden.
- Visuele demonstraties van het softwaregebruik.
- Experimenten voor de bepaling van de RRV.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle demonstratie van one-pot oligosacharidesynthese.
- Effectieve richtlijnen voor de selectie van bouwstenen.
- Duidelijke visuele instructies voor chemici.
- Potentiële therapeutische toepassingen worden belicht.
Conclusies
- Auto-CHO-software is een waardevolle tool voor oligosacharidesynthese.
- Machine learning optimaliseert het syntheseproces.
- Het protocol ondersteunt een snelle uitvoering van experimenten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Programmeerbare one-pot oligosacharide-synthese maakt een snelle assemblage van complexe glycanen mogelijk voor de validatie van therapeutische targets, waardoor de ontwikkelingstermijnen voor koolhydraatgebaseerde drugkandidaten worden verkort. Auto-CHO-software biedt voorspellende selectie van bouwstenen en hiërarchische syntheseplanning, wat mechanische risicoreductie ondersteunt in de vroege ontdekkingsfase. Deze aanpak verbetert de triage van het portfolio door het vertrouwen in de structuur-activiteitsrelaties van glycanen te vergroten voorafgaand aan preklinische investeringen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door snelle synthese van gedefinieerde glycaanstructuren, zoals SSEA-4, voor validatie van stamcelmarkers.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het genereren van homogene oligosacharide-batches voor functionele target-validatie-assays.
- Voorspellende waarde: Faciliteert het in kaart brengen van structuur-activiteitsrelaties om glycaanepitopen met therapeutisch potentieel bij kanker- en infectieziektetargets te prioriteren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gestandaardiseerde glycaanpreparaten die geschikt zijn voor koolhydraat-microarrays en de ontwikkeling van bindingsassays.
- Kwantitatieve resultaten: Levert meetbare opbrengsten en zuiverheidsprofielen die betrouwbare screening van verbindingen tegen glycaanbindende eiwitten mogelijk maken.
- Hergebruik van het platform: Maakt iteratieve verfijning van bouwsteenbibliotheken mogelijk via gebruikersfeedback op virtuele blokken, wat de schaalbaarheid van screening op de lange termijn verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: De aangetoonde synthese van SSEA-4, een marker voor pluripotente stamcellen, ondersteunt de afstemming van biomarkers in de regeneratieve geneeskunde en bij het targeten van kankerstamcellen.
- Translationele continuïteit: Biedt een traject van synthese op ontdekkingsschaal naar preklinische evaluatie van tumorgeassocieerde koolhydraatantigenen voor vaccinontwikkeling.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt de productie van structureel gedefinieerde glycanen mogelijk om ambiguïteit in de immunologische werkzaamheid en veiligheidsprofielen te verminderen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door hypothese-gestuurde glycaansynthese mogelijk te maken, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-verbindingen via gedefinieerde antigenische structuren, en preklinische validatie ondersteunt via reproduceerbare glycaanproductie.
- Discovery Biology: Ondersteunt het mechanistisch verminderen van risico's door biosynthetische paden te verduidelijken en glycaandoelen te valideren via gedefinieerde chemische synthese.
- Screening: Genereert assay-klare glycaanpanels met gekwantificeerde opbrengsten voor high-throughput screening van glycaan-eiwitinteracties.
- Analytics: Levert relatieve reactiviteitswaarden en computationele opbrengsten als kwantitatieve resultaten om de efficiëntie van synthetische routes te vergelijken en het succes te voorspellen.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk door de synthese van tumor-geassocieerde koolhydraatantigenen mogelijk te maken voor de evaluatie van vaccinkandidaten.
- Enterprise-hergebruik: Fungeert als een herbruikbare capaciteit via de feedbackgestuurde virtuele bibliotheekuitbreiding van Auto-CHO, waardoor redundante syntheseplanning over verschillende projecten wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie door mechanische ambiguïteit in glycaanfuncties te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van oligosacharideproductie door gestandaardiseerde one-pot-protocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door snelle exploratie van structuur-activiteitsrelaties mogelijk te maken, waardoor het risico op biologisch falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van glycaangebaseerde kandidaten via gedefinieerde synthetische toegankelijkheid en opbrengstvoorspellingen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in koolhydraatchemie en de interpretatie van glycaanstructuren voor een effectieve selectie van bouwstenen.
- Toegang tot HPLC en een standaardinfrastructuur voor organische synthese is noodzakelijk voor de bepaling van RRV en reactiemonitoring.
- Vereist cross-team standaardisatie van de glycaannomenclatuur en structurele invoerformaten voor consistente Auto-CHO-query's.
- Omvat aanpassingen bij uitbreiding naar niet-thioglycoside bouwstenen of alternatieve strategieën voor beschermgroepen.
- Beperkt door de nauwkeurigheid van door machine learning voorspelde RRV's voor nieuwe bouwstenen, waardoor experimentele validatie nodig is voor voorspellingen met een hoge betrouwbaarheid.
