Modulatie van Tau Subcellulaire lokalisatie als een instrument om de uitdrukking van ziektegerelateerde genen te onderzoeken

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de directe rol van tau in het nucleaire compartiment, terwijl eventuele cytoplasmatische tau-besmetting worden uitgesloten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in grote lijnen toepasbaar is op de studie over de nucleaire functie van tau in andere celtypen en onder verschillende cellulaire omstandigheden. Het aantonen van de procedure zal Giacomo Siano zijn, een post-doc van mijn laboratorium.

Begin met het plating vier keer 10 aan de vijf SH-SY5Y menselijke neuroblastoom cellijncellen die met de lege controlevector moeten worden transfected, vier keer 10 aan de vijf cellen die met ontstemd tau-NES moeten worden doorfecteerd, vier keer 10 aan de vijf cellen die met tau-NLS moeten worden doorfected, en vier keer 10 aan de vijf cellen die met tau-NES in individuele putten van een zes-goedplaat moeten worden doorkruist. De dag na het plating, afzonderlijk incubeer 400 nanogram DNA en de juiste hoeveelheid kationische lipiden in een buis van 250 microliters van verminderd serum per put. Na vijf minuten bij kamertemperatuur, combineer elke vector met een volume kationische lipide en incubeer de DNA lipide complexen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, vervang de supernatants in elke put met twee milliliter van verse volledige cultuur medium en transfect elk goed met de juiste DNA lipide complexe oplossing voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende dag, vervang de supernatants met verse differentiatie medium. Voor western blot analyse, was de transfected en gedifferentieerde cellen in elke put met PBS en incubeer de cellen met 500 microliters van 0,1%Trypsin per goed gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius.

Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met een gelijk volume van het volledige medium en breng de celsuspensie van elke put in afzonderlijke buizen voor centrifugatie. Na het zorgvuldig verwijderen van de supernatants, resuspend de pellets in een milliliter PBS per buis voor een tweede centrifugatie en verwijder de supernatants weer. Voor totale eiwitextracten, incubeer de pellets gedurende 30 minuten op ijs in 50 tot 100 microliters lysebuffer aangevuld met protease en fosforremmers.

Aan het einde van de incubatie, centrifugeren het extract op 16,000 keer g gedurende 15 minuten en kwantificeren van de eiwitconcentratie door een standaard kwantificering test. Meng vervolgens 20 microgram van elk eiwitmonster met vijf microliter 4x Laemmli-buffer tot een totaal volume van 20 microliter en kook de monsters gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius. Voor subcellulaire fractionering, resuspend de cellen in volledig medium voor het tellen en spin down een keer 10 tot de zes cellen per monster.

Om de cytosolische fractie te isoleren, de pellets in 100 microliter ijskoude cytoplasmatische extractiebuffer in te broeden, aangevuld met proteaseremmers bij vier graden Celsius met zachte menging gedurende 10 minuten. Verzamel aan het einde van de incubatie de monsters door centrifugatie en breng de supernatants in voorgekoelde buizen. Voeg 100 microliters van ijskoude membraan extractie buffer aangevuld met proteaseremmers aan de pellet voor een 10 minuten incubatie bij vier graden Celsius met zachte mengen.

Dan centrifugeren de pellets gedurende vijf minuten op vier graden Celsius en 3.000 keer g en het verzamelen van de supernatants in nieuwe buizen. Om de oplosbare kernfractie te verzamelen, voeg 50 microliters van kernextractiebuffer toe, aangevuld met proteaseremmers aan de pellets met vortexing voordat u de monsters gedurende 30 minuten uitbroedt bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de monsters en het verzamelen van de supernatants.

Om de onoplosbare kernfractie te verzamelen, voegt u 50 microliters van kernextractiebuffer toe aangevuld met proteaseremmers, calciumchloride en microkoccale nuclease aan de pellets met vortexing. Incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius voordat u draait en centrifugeert. Verzamel dan de supernatants.

Om de cytoskeletale fractie te verzamelen, voeg 50 microliter cytoskeletale extractiebuffer toe, aangevuld met proteaseremmers aan de pellets met vortexing. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeren de monsters en het verzamelen van de supernatants. Voor SDS-PAGE-analyse voegt u zeven microliters 4X Laemmli-buffer toe aan 20 microliter van elk van de verzamelde subcellulaire fractiemonsters en kook u de monsters gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius.

Laad aan het einde van de incubatie de monsters op een acrylamidegel en voer de elektroforese uit bij een constante spanning van 120 volt. Breng de eiwitten vervolgens gedurende 90 minuten over op een nitrocellulosemembraan met 250 milliampère. Incubeer het membraan gedurende vijf minuten in Ponceau kleuroplossing om te controleren op een goede eiwitgel elektroforese en een succesvolle blotting.

Aan het einde van de incubatie spoelt u het membraan in gedestilleerd water totdat de achtergrond schoon is en verwijder de vlek met continu wassen met Tris-gebufferde zoutoplossing aangevuld met Tween 20 gedurende 10 minuten op een shaker. Vervolgens, incubeer het membraan met blokkeeroplossing voor een uur bij kamertemperatuur met schudden voor het wassen drie keer met Tris-gebufferde zoutoplossing plus Tween 20 gedurende vijf minuten per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, hybridiseren het membraan met de primaire antilichaam van belang in het blokkeren van oplossing 's nachts op vier graden Celsius, gevolgd door drie wasbeurten met Tris-gebufferde zoutoplossing plus Tween 20 gedurende vijf minuten.

Na de laatste wasbeurt, hybridiseren het membraan met een geschikte mierikswortel peroxidase geconjugeerd secundair antilichaam in het blokkeren van oplossing voor een uur bij kamertemperatuur voor het wassen van het membraan met Tris-gebufferde zoutoplossing plus Tween 20 drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt. Detecteer na de laatste wasbeurt de eiwitband met behulp van chemiluminescentie en kwantificeer de intensiteit van westerse Blot-banden van ImageJ. Bij afwezigheid van retinoïnezuur en door de hersenen afgeleide neurotrofe factor, nemen ongedifferentieerde SH-SY5Y cellen een ronderemorfologie aan en vormen ze celklonen.

Zoals verwacht, na vijf dagen van behandeling met retinoïnezuur, de klonten ontspannen en de cellen verspreiden. Na drie extra dagen van behandeling met hersenen afgeleide neurotrofe factor, de cellen verschijnen gelijkmatig verdeeld en onderling verbonden via een netwerk van vertakte neurites. Na tau-NLS of tau-NES transfectie kan tau subcellulaire lokalisatie worden gedetecteerd door immunofluorescentie met anti-tau antilichamen.

Afhankelijk van de efficiëntie van de transfectie vertonen de cellen een sterke nucleaire kleuring die samensmelt met het DAPI-signaal na tau-NLS-transfectie of een cytoplasmische kleuring met de lege kernen na tau-NES. Western Blot analyse onthult de verrijking van actine binnen de cytoskeletale fractie, tubuline binnen de cytoplastische en cytoskeletale fracties, en H2B binnen de nucleaire fracties. Western Blot analyse bevestigt ook de uitdrukking van gelabelde en ongecodeerd tau in het nucleaire compartiment en vesiculaire glutamaat transporter een uitdrukking in het totale extract.

De verhouding van tau in de oplosbare nucleaire en cytoplasmische fracties benadrukt namelijk dat tau-NLS sterk verrijkt is in de oplosbare kernfractie, terwijl tau-NES is afgenomen. Bovendien wordt tau-NLS verrijkt in de chromatinegebonden fractie ten opzichte van de cytoplasmische fractie, terwijl tau-NES wordt verlaagd. Zorg ervoor dat u het aantal cellen dat wordt gebruikt voor de fractionering van elk monster zorgvuldig controleert en de verrijking van de huishoudgenen in de juiste fracties controleert.

Na het bekijken van deze video, moet je in staat zijn om cellulaire compartimenten te isoleren en de functionele rol van tau in de kern te evalueren.