Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om de vroege dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van verankering-afhankelijke cellen te kwantificeren op de extracellulaire matrix eiwit fibronectin tijdens oxidatieve stress. Deze techniek is veelzijdig en kan worden aangepast om de cytoskeletale dynamiek onder een breed scala aan omstandigheden te onderzoeken. Bovendien worden gegevensverwerving en -analyse uitgevoerd met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en vrij beschikbare software.

Inzicht in de mechanismen voor hoe cellen hechten en verspreiden op de ECM tijdens veranderingen in redox status kan waardevol inzicht geven in normale en ziektetoestanden, zoals uitgezaaide kanker. Deze methode kan worden gebruikt om celverspreiding en hechting te onderzoeken onder verschillende celkweekomstandigheden, verankeringsafhankelijke cellijnen en/oxidanten om een breed scala aan biologische vragen te beantwoorden. Er zijn tal van reagentia nodig om deze techniek uit te voeren.

Daarom is het essentieel dat alle oplossingen van tevoren worden gemaakt voordat u begint. In een BSL-II gecertificeerde laminaire flow hood uiteengezet een weefsel cultuur-gecertificeerde 24-well plaat. Plaats een glazen coverslip in elke put.

Label de plaat volgens figuur 1B van het tekstprotocol. Vervolgens pipette 500 microliters van de fibronectin oplossing in elke put. Pipette de oplossing over elke coverslip een paar keer om een gelijkmatige coating en volledige onderdompeling te garanderen.

Bedek de plaat met het deksel. Broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Verwijder vervolgens de plaat uit de couveuse en haal de fibronectin-oplossing uit de putten.

Was de putten drie keer met 500 microliter van 1X PBS per wasbeurt. Aspirate de laatste wasbeurt van 1X PBS, en blok putten met 500 microliters van een 0,5% gedelipideerde BSA oplossing bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide voor een minimum van 15 minuten. Eerst, pre-warm de benodigde oplossingen in een waterbad op 37 graden Celsius.

In een BSL-II gecertificeerde laminaire stroomkap, beginnen met een confluent monolayer van REF52 cellen in een 10-vierkante centimeter schotel en was de cellen twee keer met zes milliliter warme 1X PBS. Serum verhongeren de cellen gedurende ten minste een uur in zes milliliter warme gedelipidde BSA-oplossing. Was vervolgens de cellen met zes milliliter opgewarmde 1X PBS.

Aspirate de PBS en voeg 1,5 milliliter warme 0,5% trypsin-EDTA oplossing. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende ongeveer twee minuten. Observeer de cellen onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat het onthechting compleet is.

Als de cellen nog steeds aanhangen na het tikken op de plaat op de bank top, terug te keren naar de couveuse voor een extra twee minuten. Pipette 1,5 milliliter warme trypsine neutraliserende oplossing, TNS, aan de schotel om trypsinization te stoppen en losstaande cellen te verzamelen. Pipette de oplossing op en neer over de bodem van de plaat vele malen om alle resterende aanhangende cellen te verwijderen.

Als de cellen verschijnen klonterig, verder triturate de cel suspensie door zachtjes pipetten op en neer over de achterkant van de schotel. Tel vervolgens de cellen met trypanblauwe uitsluiting in een geautomatiseerde celteller. Verwijder een geschikte hoeveelheid cellen om een celsuspensie te maken met de celdichtheid tussen 10.000 en 30.000 cellen per milliliter in delipidated BSA in een 15-milliliter conische buis.

Gebruik een rotor met vaste hoek in een tafelbladcentrifuge om de cellen gedurende vijf minuten op 300 keer g te centrifugeren. Aspirate de supernatant en opnieuw op te schorten de cel pellet in zeven milliliter van warme gedelipidde BSA oplossing. Dan gelijkmatig verdelen de cel schorsing in twee 15-milliliter conische buizen, een voor voertuig-alone controle, en een voor Ku55933.

Met behulp van een buis rotator, draaien de buizen voor 90 tot 120 minuten in een cel cultuur incubator op 37 graden Celsius. Voeg 30 minuten voor het beplating Ku55933 en DMSO aan elke buis toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar. Breng de celsuspensie voor de resterende tijd terug naar de rotator.

Haal onmiddellijk voor het plating van de cellen de plaat uit de couveuse en aspiraat de gedelipidde BSA-oplossing. Verwijder hierna 500 microliter van de celsuspensie uit elke behandelingsgroep en voeg ze elk een van de met fibronectin gecoate afdekkingslips in de 24-putplaat toe. Doorgaan met het uitbroeden van de plaat en de celsuspensie bij de vorige omstandigheden.

Laat de cellen vervolgens gedurende de gewenste tijd aan de coverlip kleven. Nadat de gewenste tijd voor hechting is verstreken, aspirate de celoplossing van elke coverslip in de plaat. Doe voorzichtig 500 microliters van 3,7% paraformaldehydeoplossing op elke coverslip door de zijkanten van de putten te pipetten en wacht 10 tot 15 minuten.

Verwijder vervolgens de paraformaldehydeoplossing en was elke coverlip twee maal met 1X PBS met behulp van 500 microliter PBS per wasbeurt. Aspirate de PBS en permeabilized cellen op elke coverslip met 500 microliters van 0,2% Triton X-100 en 1X PBS gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens elke coverslip drie keer met 1X PBS met behulp van 500 microliters pbs per wasbeurt.

Blokkeer de cellen op elke coverslip met 500 microliters van immunofluorescentie blokkeren buffer gedurende 30 tot 60 minuten. Verdun het primaire anti-paxillineantilichaam in de blokkeringsbuffer bij een verhouding van één tot 250. Meng goed en voeg 200 microliter van de antilichaamoplossing toe aan elke coverslip.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste een uur. Daarna de antilichaamoplossing aanzuigen en elke coverslip gedurende 10 minuten wassen met 500 microliters van 1X PBS. Bescherm de monsters vanaf dit punt tegen licht.

Verdun de phalloïden F-actin sonde geconjugeerd aan de rode fluorescerende Alexa 594 kleurstof en de geit anti-muis 488 fluorescerende secundaire antilichaam in dezelfde blokkeren buffer oplossing. Meng goed en voeg 200 microliter van de antilichaamoplossing gedurende 30 minuten toe aan elke coverslip. Spoel de antilichaamoplossing aan en was elke coverslip met 500 microliter 1X PBS gedurende 10 minuten.

Spoel de PBS aan en spoel de afdekking één keer af met 500 microliter gedeïsized water. Bevestig vervolgens de cover slips op microscoop dia's met behulp van anti-fade montage medium met DAPI. Na fixatie en kleuring met een anti-paxillin antilichaam worden fluorescerende 8-bits grijswaardenbeelden van de REF52-cellen verkregen.

Na voltooiing van alle stappen voor beeldverwerking moeten individuele focale verklevingen prominent, scherp en gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn. Grijswaardenfluorescentie beelden van anti-paxilline en phalloidin F-actin sonde gekleurde cellen worden vervolgens genomen na te zijn verguld op fibronectine. Prominente focale verklevingen en stressvezels moeten gemakkelijk zichtbaar zijn in REF52-cellen nadat ze 20 tot 30 minuten op fibronectine mogen blijven kleven.

F-actin verrijkte ruches aan de voorrand van celmembranen worden aangegeven met een pijl. Soortgelijke fluorescerende beelden van phalloïden F-actin sonde en anti-paxilline vlekken worden geanalyseerd voor het percentage stress vezels in cel verspreiding. Met name oxidant behandeling veroorzaakt een aanzienlijke toename van stress vezel vorming op alle adhesie tijdpunten onderzocht, en een afname van de cel verspreiding na 15 minuten van de celhechting fibronectine.

Plating op hogere celdichtheden leidt tot cellulaire verdringing die cellen verbiedt volledig te verspreiden als gevolg van overvloeiing. Merk op dat de celranden niet te onderscheiden zijn van aangrenzende cellen. Als gevolg hiervan wordt kwantificering van individuele cellen uitgesloten en kan de verspreiding van de omtrek niet nauwkeurig worden bepaald.

Een aparte cellijn van de muis embryonale fibroblasten worden gehouden in suspensie en vervolgens verguld op fibronectine gedurende 30 minuten. Cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met een anti-paxillin antilichaam. Let op de onscherpe cellen.

Bovendien zal de kruisreactiviteit van het anti-paxilline-antilichaam met cellulair puin de drempelwaarde veranderen tijdens kwantitatieve beeldanalyse en mag deze niet in de analyse worden opgenomen. Gebruik tijdens beeldverwerking het opzoekgereedschap in Fiji om het beeld histogram te onderzoeken terwijl u de helderheid/contrast aanpast om valkuilen in verband met signaalverzadiging te voorkomen. Veranderingen in hechting en verspreiding kunnen de celmigratie beïnvloeden.

Methoden om eencellige migratie, wondgenezing, of chemotaxis invasie tests kunnen bepalen of veranderingen in de migratie optreden. Rho familie GTPases reguleren celhechting dynamiek door middel van hun specifieke ruimtelijke temporele activering. Fenotypische veranderingen in hechting en verspreiding tijdens oxidatieve stress kunnen wijzen op downstream regulerende rollen voor deze eiwitten.

Deze methode vereist het gebruik van BSL-II-cellijnen en gevaarlijke chemische reagentia. Onderzoekers vereisen chemische en biologische veiligheidstraining, zoals bepaald door het milieu-gezondheids- en veiligheidsbureau van hun instelling.