Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Dit protocol is geschikt voor het produceren van gezuiverde diterpenoïden die kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-analyse en kan worden aangepast voor een reeks verschillende metabolietdoelen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is het is een eenvoudige en goedkope methode om milligram hoeveelheden gespecialiseerde metabolieten te produceren. Door het uitwisselen van de genen en enzymen die worden gebruikt voor co-expressie, kan deze methode worden gewijzigd om andere terpenoïden te produceren, waaronder monoterpenoïden en sesquiterpenoïden, evenals andere metaboliet klassen zoals flavonoïden.

Voor diterpenoïde metabolische productie en transformatie, beginnen met het opwarmen van chemisch bevoegde E.coli cellen op ijs. Wanneer de cultuur ontdooid is, voeg 25 microliter van bevoegde cellen per constructie toe aan een gekoelde 1,5 milliliter microbuis en voeg 1 microliter van een 100 nanogram per microliteroplossing toe van elke constructie die wordt gebruikt voor co-expressie. Incubeer de mengsels op ijs gedurende 30 minuten met zachte mengen om de 10 minuten door het schrapen van de buizen over een microtube rack.

Aan het einde van de incubatie schokt de warmte de celmengsels op 42 graden Celsius gedurende een minuut voordat de cellen nog minstens twee minuten in het ijs worden gezet. Voeg vervolgens 200 microliters van 37 graden Celsius SOC medium toe aan de buizen. En broeden de culturen voor een uur op 37 graden celsius en 200 rotaties per minuut.

Voeg aan het einde van de incubatie ongeveer 10 autoclaved glass kralen en 100 microliter cellen toe aan een 37 graden celsius opgewarmde lysogeny brijplaat met de juiste antibiotica. En schud de plaat horizontaal met het deksel op zijn plaats om de cellen gelijkmatig te verdelen. Tik vervolgens voorzichtig de glazen kralen in een afvalcontainer en broed de plaat 's nachts op 37 graden celsius, gecoate oppervlaktezijde naar beneden.

De volgende dag, verwijder de plaat uit de couveuse. Voeg 5 milliliter vers bereide lysogeny bouillonmedium met de juiste antibiotica toe aan een 15 milliliter steriele glazen buis met een plastic ademende dop per geplande 1 liter kweek, en gebruik een pipettip om individuele getransformeerde E.Coli kolonies uit de agarplaat te plukken. Voeg een geplukte kolonie toe aan elk van de bereide buizen van 15 milliliter en dop elke buis met de bijbehorende ademende plastic dop.

Plaats vervolgens de afgetopte E.coli kleine culturen in een 37 graden celsius schudden incubator voor 12 tot 24 uur. De volgende dag voeg 100 milliliter 10x PBS tot 900 milliliter geweldige bouillon in een 1 liter fles per kleine cultuur met de juiste antibiotica. En plaats de kolven op 37 graden celsius en 140 rotaties per minuut gedurende ongeveer 30 minuten.

Wanneer de geweldige bouillon warm is, voeg dan het volledige volume van 5 milliliter van elke inentingscultuur toe aan één 1 liter cultuurfles per cultuur. En plaats de kolven in de schuddende couveuse op 140 rotaties per minuut gedurende ongeveer 3 uur. Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,6 bereikt, verlaagt u de temperatuur van de couveuse tot 16 graden Celsius.

Zodra de couveuse is afgekoeld, voeg 1 milliliter van een molaire IPTG, 1 milliliter vers bereide 4 gram per liter riboflavine en 1 milliliter vers bereide 150 gram aminolevulinic zuur aan elke cultuur. Voor de productie van diterpenoïden, voeg 25 milliliter van een molaire natrium pyruvaat aan elke cultuur om een voldoende voorloper vorming te garanderen. Vervolgens, incubeer de culturen op 16 graden Celsius en 140 rotaties per minuut gedurende 72 uur, het toevoegen van 25 milliliter natrium pyruvaat dagelijks aan de juiste culturen.

Voor metabolietscheiding en zuivering, zet een separatory trechter op een ringstandaard in een rookkap. En plaats een afvalcontainer onder de trechter. Giet 500 milliliter van een 50/50 oplossing van ethylacetaat en hexanen in de separatory trechter.

En voeg 500 milliliter van de getransformeerde E.coli co-expressie cultuur van belang in de trechter. Plaats de glazen stop op de trechter en schud de trechter 5 tot 10 keer om de cultuur te mengen met het extractieoplosmiddel, vaak het openen van de spigot, terwijl de trechter ondersteboven is en richt het in de rookkap om de trechter te ontgassen. Na een tweede ronde van schudden en ontgassen zoals net aangetoond, plaats de trechter rechtop in de ring staan voor ongeveer een minuut.

Wanneer de bovenste oplosmiddellaag van de waterige cultuurlaag is gescheiden, verwijdert u de stop en giet u de E.coli-laag af in een afvalbeker, waarbij de oplosmiddellaag in de trechter behouden blijft. Herhaal vervolgens de extractie met de resterende 500 milliliter van de cultuur met dezelfde 500 milliliter oplosmiddel die voor de eerste extractie wordt gebruikt, voordat het oplosmiddel met de geëxtraheerde metabolieten in een schone kolf wordt afgevoerd. Hier wordt onze representatieve gaschromatografie-massaspectrometriechromatogram van typische geëxtraheerde enzymproducten getoond.

Algemeen waargenomen kleine bijproducten zijn chlooramfenicol en de indool derivaten oxindool en indool pivalaldehyde. Na diterpenoïde zuivering via silicakolomchromatografie kunnen drie dolabralexinverbindingen worden verkregen, zoals gekwantificeerd op basis van een standaardcurve met behulp van de diterpenoïde sclareol. Silica chromatografie is ideaal voor het bereiken van een hoge zuiverheid van de doelverbindingen.

Omdat het de eenvoudige voorbereiding van diterpene olefinen en zuurstofhoudende derivaten mogelijk maakt en gemakkelijk de belangrijkste besmette oxindool verwijdert, die op de silicamatrix wordt bewaard. Verder kan de co-expressie van de terpenoïde pathway genen worden gebruikt om diterpenoïden te produceren in N.Benthamiana, wat resulteert in de productie van dolabradiene en 15, 16 epoxydolabren. De oplosmiddelen die tijdens de extractie worden gebruikt, moeten worden geoptimaliseerd voor de fysische chemische eigenschappen van de metabolieten van belang en mogen niet met water kunnen worden gemengd om twee afzonderlijke lagen te behouden.

Na deze procedure kunnen gezuiverde metabolieten worden gebruikt voor downstream-analyse, inclusief structurele analyse en antibioticazuren. Deze techniek maakte het mogelijk om nieuwe diterpenoïden te ontdekken, inclusief die welke hier worden getoond, waardoor deze metabolieten konden worden geanalyseerd op hun chemische structuur en nieuwe biactivies. Neem voorzorgsmaatregelen bij het gebruik van organische oplosmiddelen in een separatory trechter.

Zorg er altijd voor dat u biologisch afval afvoert volgens de veiligheidsnormen van uw lab.