Name: Anti-RDL en Anti-mGlutR1 Receptoren Antibody Testen in Honingbij Hersensecties met behulp van CRISPR-Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer CRISPR-Cas9 genbewerking in volwassen honingbijhersenen om GABAA- en glutamaatreceptoren te bestuderen. Deze methode test antilichaamspecificiteit en onderzoekt de rol van eiwitten bij leren en geheugen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de volgende prijzen aan BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). Het peptide en de antilichamen voor DmGluRA werden ontworpen in het laboratorium Dr. Serge Birman (Marseille, Luminy, Frankrijk) toen IS werd ondersteund door Programme d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 van de Fondation pour la Recherche Medicale. We zijn Daniela Junqueira Marosi en Alex Hanter van Integrated DNA Technology (IDT) dankbaar voor de hulp bij het ontwerp van RDL-gidsen en qPCR drop-off tests.

<ol><li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Kouranova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRs+for+Optimal+Targeting%3A+Delivery+of+CRISPR+Components+as+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+Cultured+Cells+and+Single-Cell+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos.</a> Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).</li>
<li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+tracrRNA+provides+efficient+genome+editing+while+allowing+cellular+microscopy+and+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis.</a> Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).</li>
<li>Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+metabotropic+glutamate+receptor+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%3A+implications+for+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation.</a> Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).</li>
<li>Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+two+GABA+receptor-like+subunits+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS.</a> Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).</li>
<li>Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+cyclodiene+insecticide+resistance-associated+mutations+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects.</a> Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).</li>
<li>Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABA%28A%29+receptor+RDL+acts+in+peptidergic+PDF+neurons+to+promote+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila.</a> Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).</li>
<li>Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+expression+of+intracellular+loop+variants+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29+RDL+GABA+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor.</a> Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).</li>
<li>Jones, A. K., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+superfamily+of+the+honeybee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera.</a> Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).</li>
<li>Dupuis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homomeric+RDL+and+heteromeric+RDL%2FLCCH3+GABA+receptors+in+the+honeybee+antennal+lobes%3A+two+candidates+for+inhibitory+transmission+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing.</a> Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).</li>
<li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li>
<li>Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNAi+knockdown+effect+of+tyramine+receptor+1+induced+by+dsRNA+and+siRNA+in+brains+of+the+honeybee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera.</a> Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).</li>
<li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+switch+for+worker+nutrition-mediated+traits+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees.</a> PLOS Biology. 17 (3), e3000171(2019).</li>
<li>Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Knockout+Mutants+by+CRISPR%2FCas9+in+the+European+Honeybee%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science+%28BIOONE%29%22%5BJournal%5D)">Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L.</a> Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).</li>
<li>Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing+in+Honeybee+Apis+mellifera+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).</li>
<li>Smith, B. H., Burden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proboscis+Extension+Response+Protocol+for+Investigating+Behavioral+Plasticity+in+Insects%3A+Application+to+Basic%2C+Biomedical%2C+and+Agricultural+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51057(2014).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).</li>
<li>Rodriguez, J., Deinhardt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+semipermanent+mounting+medium+for+fluorescent+antibody+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies.</a> Virology. 12, 316-317 (1960).</li>
<li>Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).</li>
<li>Bonnafe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+thymol+application+on+olfactory+memory+and+gene+expression+levels+in+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollutant+Research+%28International%29%22%5BJournal%5D)">Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera.</a> Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honeybee+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Karakterisering van de anti-RDL en anti-mGlutR1 Ten eerste hebben we de anti-RDL en anti-mGlutR1 antilichamen gekarakteriseerd door immunoblot en pre-adsorptie op de plakjes vaste honingbijhersenen. Elk antilichaam werd gemaakt om al zijn bekende isoforms te herkennen, en westerse analyse laat zien dat ze banden herkennen die overeenkomen met hun voorspelde moleculaire gewichten. Vervolgens werden beide antilichamen geblokkeerd door het geconjugeerde peptide waartegen ze werden geproduceerd op honingbijenhersensecties.
Een van de eerste doelstellingen in onze studie was om vast te stellen dat de antilichamen geproduceerd tegen de specifieke geconjugeerde peptide zijn specifiek voor zijn eiwit in vaste hersenweefsel. Daarvoor maakten we gebruik van het CRISPR-Cas9 systeem. We ontwierpen specifieke gidsen voor honingbij RDL en mGlutR1 en gebruikten elk van hen om CRISPR-Cas9 gelabeld te maken met de fluorescerende sonde ATTO550. Voor elke receptor injecteerden we een mengsel van drie verschillende CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnen in de ocelli om de hoeveelheid van het beoogde eiwit in de volwassen honingbijhersenen te verminderen door het overeenkomstige gen te elimineren in cellen die ons ontworpen Cas9-systeem in namen. In onze studie hebben we deze stap volbracht.
Een van de eerste cruciale stappen voor het succes van deze experimenten is het ontwerpen van de juiste gids RNAs. We raden u aan maximaal vijf geleidings-RNA's te ontwerpen, gelegen aan het begin, midden en het einde van de gensequentie. In ons voorbereidende werk testten we ze in verschillende combinaties op drie tot vijf bijen. We hebben ook geprobeerd verschillende concentraties van injecties, evenals tijden na injectie, en verschillende mengsels van RNP in de injecties. We ontleedden hersenen en verwerkten ze met anti-RDL en anti-mGlutR1 antilichamen. In deze eerste tests hebben we de juiste combinatie, post-injectietijd, evenals de concentratie en hoeveelheid CRISPR-Cas9 voor injectie vastgesteld. Deze eerste tests waren de basis voor het opzetten van de experimenten die we hier in detail beschreven.
Het doel was tweeledig: 1) om in een bij aan te tonen dat onze antilichaamkleuring na behandeling met CRISPR-Cas9 en 2) werd verminderd om de beste experimentele omstandigheden voor gedragsstudies te doorlopen. Zo tonen we aan dat als veel celkernen CRISPR-Cas9 48 uur na injectie bevatten, de reductie van de anti-RDL en anti-mGlutR1 kleuring significant is. Bovendien, dat toont aan dat de geteste antilichamen specifiek herkennen de mGlut1 en RDL eiwit in de honingbij hersenen voorbereiding en dat ze kunnen worden gebruikt voor lokalisatie studies in de honingbij hersenen.
Experimentele setting CRISPR-Cas9 voor gedragsstudie Vervolgens hebben we de experimenten zo opgezet dat CRISPR-Cas9 gebruikt kon worden in gedragsstudies. Acht of negen honingbijen werden verzameld voor controle en experimentele behandelingen. Ze werden gedragsmatig getest voor en na de injectie, en vervolgens hun hersenen werden verwerkt voor ATTO550 en / of immunocytochemie om de hersenen regio's die vermindering van het doeleiwit toonde te bepalen. Hier is het van essentieel belang op te merken dat het aantal bijen dat voor één reeks experimenten wordt genomen, beperkt was tot niet meer dan 8-9 bijen voor de controle- en experimentele omstandigheden. Op deze manier kunnen beide omstandigheden op dezelfde dag worden getest. Ook, zodra we de CRISPR-Cas9 mengsels voorbereid voor injectie, we nooit bevroor ze. Het CRISPR-Cas9 mengsel veranderde niet in potentie bij gebruik 3 dagen op rij en bleef bij 4-8 °C. Echter, we hebben het niet testen na 3 dagen.
Zoals we beschreven in de sectie Resultaten voor beide sets van experimentele injecties en voor beide antilichamen, slechts drie bijen van 16 getest toonde een grote verdeling ATTO550 in de paddestoel lichaam, protocerebrum, en antennekwabben. Bij alle andere bijen was de verdeling van CRISPR-Cas9 beperkt tot het champignonlichaam, het centrale complex en/of de achterste protocerebrum. Het is essentieel om te begrijpen voor alle gedragsstudies dat het gebruik van deze injectiemethode de vermindering van doeleiwit alleen beperkt zal zijn tot het paddestoellichaam bij de meeste bijen. Het zal niet uitbreiden tot de antennekwab of sub-oesofageale ganglion. Zo is de injectietechniek die we gebruiken geschikt om het effect van de vermindering van receptoren in het paddestoellichaam en het centrale complex in gedragsexperimenten te bestuderen, terwijl een andere methode voor de invoering van CRISPR-Cas9 meer geschikt zal zijn voor het bestuderen van andere hersengebieden.
Tot slot toonde onze studie de succesvolle toepassing van CRISPR-Cas9 aan als een controle voor antilichaamvlekken in de hersenen. Voor zowel antilichamen (anti-RDL als anti-mGlutR1), toen de opname van mGlutR1-CRISPR-Cas9 of RDL-CRISPR-Cas9 succesvol was, werd ook het niveau van overeenkomstige vlekken van antilichamen aanzienlijk verminderd. Ook is het essentieel op te merken dat injectie in de ocelli leidde tot een verdeling van CRISPR-Cas9 in de hersenen die niet homogeen was. De verdeling varieerde van een minimaal gebied rond de ocelli en paddestoel lichaam om vele cellen in de hele hersenen. De variabiliteit van de opname van de mGlutR1-of RDL-CRISPR-Cas9 door de cellen was waarschijnlijk te wijten aan variatie in de injecties. Uit onze gegevens blijkt dat het CRISPR-Cas9-systeem werkt bij honingbijen, maar dat de injectiemethode moet worden verbeterd om de variabiliteit van crispr-cas9-opname in individuele bijenhersenen te verminderen. Binnen deze beperkingen is het nu mogelijk om deze techniek te gebruiken om genen bij volwassen bijen te manipuleren voor gedragsexperimenten.

Het recent ontdekte CRISPR/Cas9 systeem is een krachtig instrument dat is gebruikt om genomic DNA te veranderen in verschillende modelsystemen en organismen. Het heeft het biomedische onderzoek en belangrijke technologische doorbraken versneld door genoommodificatie efficiënter en robuuster te maken dan eerdere methoden1. Inheems in S. pyogenes bacteriën, het systeem is gebaseerd op een Cas9 endonuclease, waarvan de activiteit leidt tot dubbel-gestrande pauzes (DSBs) in DNA, en een gids RNA (gRNA) dat de Cas9 eiwit stuurt naar een specifieke, sequentie-afhankelijke locatie2. Dubbelgestrande onderbrekingen gegenereerd door CRISPR/Cas9 kunnen worden gerepareerd via niet-homologe eindtoetreding (NHEJ), een foutgevoelig proces dat kan leiden tot frameverschuivingen of directe reparatie van homologie wanneer een donorsjabloon aanwezig is. Het gRNA zelf bestaat uit een doelspecifiek CRISPR RNA (crRNA) en een universeel transactiverend crRNA (tracrRNA) dat chemisch kan worden gesynthetiseerd en geleverd met gezuiverde Cas9 nuclease als ribonucleoprotein complex (RNP)2,3. Fluorescerende etikettering van de gRNA of Cas9 nuclease kan de detectie en intracellulaire visualisatie van moleculaire componenten mogelijk maken via fluorescerende microscopie4.
In ons huidige werk maken we gebruik van het CRISPR-Cas9 systeem om het eiwitgehalte in volwassen honingbijhersenen te verminderen. We bestudeerden de metabotropische glutamaatreceptor (mGluR) en anti-mGlutR1 receptorantilichamen en de GABAA receptor subunit RDL en anti-RDL antilichamen. We ontwikkelden een eenvoudige methode om de hoeveelheid eiwit in de hersenen van de volwassen honingbij te verminderen en gebruikten het om extra tests van de antilichamen ontwikkeld tegen de overeenkomstige eiwitten te stimuleren. Door de fluorescentie van CRISPR-Cas9 te monitoren, konden we de gebieden en cellen die betrokken zijn bij de reductie van het eiwit inschatten.
Met behulp van deze methode hebben we ook de anti-mGlutR1-antilichamen gekarakteriseerd die bij konijnen werden gemaakt tegen het geconjugeerde peptide. Het honingbijgenoom codeert een sterk geconserveerde AmGluRA (mGlutR1 volgens NCBI-nomenclatuur) metabotropische glutamaatreceptor5. Het honeybee mGlutR1-gen heeft vier voorspelde splicevarianten volgens de NCBI-database. Er is gemeld dat het wordt uitgedrukt in het centrale zenuwstelsel (CNS) van zowel de pop- als de volwassen bijenstadia en het is betrokken bij langdurige geheugenvorming5. Antilichamen ontwikkeld tegen mGlutR1 kan een essentieel instrument voor het bestuderen van de glutamatergic systeem in het leer-en geheugenproces bij honingbijen.
In onze studies hebben we ook anti-RDL-antilichamen gekarakteriseerd die werden ontwikkeld bij konijnen die zijn geïmmuniseerd met geconjugeerde peptiden uit de Apis mellifera RDL receptor subunit. Het honeybee Rdl-gen, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI-database), heeft 14 voorspelde splicevarianten. Een gedeeltelijk gekloond fragment is gemeld in de NCBI-database AF094822.1. De RDL-receptorfunctie en de fysiologie ervan worden goed bestudeerd bij insecten6,7,8, inclusief honingbijen9,10,11. Antilichamen ontwikkeld tegen anti-RDL kan een essentieel instrument voor het bestuderen van de GABAergic systeem in het leer-en geheugenproces bij honingbijen.
Een eerdere studie over de rol van octopamine en tyramine receptoren gebruikt RNAi geïnjecteerd in de hersenen met een latere test van de hoeveelheid eiwit door westerse vlek12,13. RnAi heeft echter een aantal belangrijke beperkingen. Er is slechts een korte tijd venster na RNAi injectie waarbinnen een vermindering van eiwit optreedt13. CRISPR-Cas9 werd zeer recent gebruikt in honingbijembryo's om genen in het hele dier te verwijderen of te wijzigen14,15,16. We rapporteerden het gebruik van CRISPR-Cas9 om de hoeveelheid eiwit in de volwassen honingbij te verminderen. We ontwikkelden deze aanpak voor honingbijen vanwege de mogelijkheid om het te koppelen aan gedragsstudies van leren en geheugen onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden17.
In het huidige werk ontwikkelden we antilichamen tegen twee receptoren en testten ze op de volwassen honingbijhersensecties nadat het eiwit werd verminderd door CRISPR-Cas9-injectie. Tegelijkertijd hebben we een experimenteel ontwerp opgesteld dat het gebruik van de methode voor gedragsexperimenten mogelijk maakt.

```html
<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Acrylamid-bis Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>gebruikt met gedistilleerd water om honingbijenhersenen in blokken te fixeren</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>secundaire antilichaam om de primaire antilichamen van konijn te onthullen</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>met ontworpen guide RNA, het creëert gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>enzym gebruikt om ribonucleoproteïne voor CRISPR-systeem te maken</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Anti-mGlutR1 antilichamen</td><td>Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical</td><td>gekarakteriseerd door auteurs in het huidige artikel</td><td>Gebruikt voor primaire incubatie van mGlut 1 in honingbijen</td></tr><tr><td>Anti-RDL antilichamen</td><td>21st Century Biochemical</td><td>gekarakteriseerd door auteurs in het huidige artikel</td><td>Gebruikt voor primaire incubatie van RDL in honingbijen</td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>gebruikt voor het disseceren van honingbijenhersenen</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>Mes (breekbaar) voor meshouder</td><td>Fine Science Tool</td><td>10050-00</td><td>dissectie voor western blotting</td></tr><tr><td>Meshouder en breker</td><td>Fine Science Tool</td><td>15309</td><td>dissectie voor western blotting</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>voor injectieprocedure</td></tr><tr><td>Chemiluminescerend western blot detectie substraat</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>RNA isolatie</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>DNA easy kit</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>DNA extractie</td></tr><tr><td>DNA-free kit</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>Gebruikt om DNA te verwijderen</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 3-pack</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Multiwell</td></tr><tr><td>Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70021</td><td>mand voor hersensecties</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5 (paar)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11254-20</td><td>voor het disseceren van het honingbijenhersenen uit het hoofd</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5S (paar)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11252-00</td><td>om de hersenen te reinigen van trachea voor dissectie</td></tr><tr><td>Gene Expression Master Mix</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1055770</td><td>qPCR drop off assay</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>gebruikt voor de bereiding van peptideconjugaten voor controle peabsorptie</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>western blotting, inbeddingsmedium</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Hydrofobe gefilterde nylonmesh</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>voor de bodem van de mand voor hersensecties</td></tr><tr><td>Isopropylalcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>RNA isolatie</td></tr><tr><td>Keyhole limpet hemocyanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>gebruikt voor de bereiding van conjugaten voor controle</td></tr><tr><td>LSM800 cofocal microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>ontworpen guide RNA voor CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genoomsequenties</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td><td>IDT</td><td></td><td>ontworpen guide RNA voor CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genoomsequenties</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 3</td><td>IDT</td><td></td><td>ontworpen guide RNA voor CRISPR. Target mGlutR1 genoomsequenties</td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>96-well PCR microplate</td><td>Applied biosystem</td><td>4346907</td><td>qPCR drop off assay en qRT-PCR</td></tr><tr><td>384-well PCR microplate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td><td>voor injectieprocedure</td></tr><tr><td>Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Capillaire voorbereiding</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>voor inbeddingsoplossing</td></tr><tr><td>Nanoliter 2000</td><td>World Precision Instruments Nanoliter</td><td></td><td>Injectie Apparatuur</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Research Laboratories</td><td>AB_2337258</td><td>blokkagens voor immunocytochemie</td></tr><tr><td>Non-immune Goat Serum</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>blokkagens voor immunoblotting</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij buffer</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>Nuclease-vrije buffer die wordt gebruikt bij de bereiding van CRISPR-Cas9 injectie</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>IDT</td><td>AM9337</td><td>nuclease-vrij water dat wordt gebruikt bij de bereiding van CRISPR-Cas 9 systeem</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>gebruikt met PBS om fixatief voor bijenhersenen te maken</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>proteaseremmer</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Gebruikt met Paraformaldehyde als fixatief; buffer voor antilichamen</td></tr></tbody></table>
```

anti-rdl en anti-mglutr1 receptoren antibody testen in honingbij hersensecties met behulp van crispr-cas9

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regelmatig interspaced Short Palindrmic Repeats (CRISPR)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) is een genbewerkingstechniek die veel wordt gebruikt in studies van genfunctie. We gebruiken deze methode in deze studie om te controleren op de specificiteit van antilichamen ontwikkeld tegen het insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) en een metabotropic glutamaat receptor mGlutR1 (mGluRA). De antilichamen werden gegenereerd bij konijnen tegen de geconjugeerde peptiden die specifiek zijn voor fruitvliegjes(Drosophila melanogaster) en bij honingbijen (Apis mellifera). We gebruikten deze antilichamen in honingbijhersensecties om de verdeling van de receptoren in honingbijhersenen te bestuderen. De antilichamen werden tegen het peptide gezuiverd en getest met immunoblotting en de klassieke methode van preadsorptie met peptideconjugaten om aan te tonen dat de antilichamen specifiek zijn voor de overeenkomstige peptide conjugaten waartegen ze werden opgevoed. Hier ontwikkelden we de CRISPR-Cas9 techniek om te testen op de vermindering van eiwitdoelen in de hersenen 48 uur na CRISPR-Cas9 injectie met gids RNAs ontworpen voor de overeenkomstige receptor. De CRISPR-Cas9 methode kan ook worden gebruikt in gedragsanalyses bij de volwassen bijen wanneer een of meerdere genen moeten worden gewijzigd.

Anti-RDL antilichaamtests De antilichamen werden geproduceerd tegen de RDL peptide conjugaten zoals weergegeven in figuur 1A. De eerste stap in het karakteriseren van de anti-RDL-antilichamen is het homogenaat van het eiwit dat uit de bijenhersenen wordt gewonnen met behulp van een westerse vlek met anti-RDL-antilichamen en een hrp-gelabelde geitantikonijnigig antilichaam(figuur 1A, insert). Beide anti-RDL antilichamen herkenden de band op ~ 50-60 kD (pijl), wat overeenkomt met het geschatte gewicht van de RDL subunit isoform eiwitten. Om aan te tonen dat anti-RDL-antilichamen het peptide in de hersenschijf herkenden, gebruikten we een preadsorptiecontrole (figuur 1B,C). Wanneer antilichamen werden voorbebroed met geconjugeerde peptiden, was de kleuring op de sectie afwezig. Hieruit bleek dat de anti-RDL-antilichamen het geconjugeerde peptide erkenden waartegen ze werden opgevoed. Om aan te tonen dat de anti-RDL-antilichamen het eiwit in het vaste hersenweefsel herkennen, gebruikten we CRISPR-Cas9 om het RDL-gen dat het RDL-eiwit in de cellen produceert uit te schakelen. Figuur 1D1-3, toont controle frontale bijen hersensecties die werden gelabeld met anti-RDL antilichamen. Deze bij werd niet geïnjecteerd met RDL-CRISPR-Cas9 RNP. In figuur 1D1labelt anti-RDL neuropils in het frontale gedeelte van de bijenhersenen. Dezelfde frontale sectie in figuur 1D2 toont de afwezigheid van fluorescentie van ATTO550, omdat het RDL-CRISPR-Cas9-complex niet werd geïnjecteerd.
Figuur 1E1-E3 toont een hersensectie van een bij geïnjecteerd met RDL-CRISPR-Cas 9 en vervolgens verwerkt met dezelfde hoeveelheid antilichamen als de controlehersenen in figuur 1D1-D3. De anti-RDL kleuring werd aanzienlijk verminderd in de hele hersenen 48 uur na de injectie, en de verdeling van de ATTO550 kleuring in de hersenen (figuur 1E2) toont het succes van de RDL-CRISPR-Cas 9 injecties in de bijen mediaan ocelli. De meerdere verspreide cellen van de hersenen vertonen ATTO550. De succesvolle injectie van RDL-CRISPR-Cas 9 verminderde de eiwitexpressie in vergelijking met de controle (figuur 1E1-3). Van acht immunocetained bee hersenen, slechts een hersenen had een hoog niveau van distributie van de RDL-CRISPR-Cas9 in de cellen van paddestoel lichaam, protocerebrum, en antennekwab, terwijl andere hersenen hadden cel vlekken met ATTO550 in de paddestoel lichaam kelk, centraal complex, maar niet antennekwab. Het is belangrijk op te merken dat bij deze bijen de reductie anti-RDL-immunovlekken niet zo dramatisch was als in de hersenen die in figuur 1E1worden vertoond.
Vervolgens hebben we na de RDL-CRISPR-Cas9-injectie een qPCR-drop-off test uitgevoerd om het niveau van het gewijzigde RDL-gDNA in de bijen 48 uur na de RDL-CRISPR-Cas9-injectie te schatten. In deze experimenten, in de bijenhersenen geïnjecteerd met RDL-CRISPR-Cas 9, kwam de relatieve vermindering van de fluorescentie overeen met het aantal gemodificeerde gDNA in de monsters. In onze tests was het gebied dat overeenkomt met deze gids in gDNA bij 12 bijen geïnjecteerd met RDL-CRISPR-Cas9 64 % ± (gemiddelde ± 30 %SD) vergeleken met gDNA bij niet-geïnjecteerde bijen (figuur 3A).
Vervolgens hebben we qRT-PCR uitgevoerd in een aparte groep bijen (figuur 3B). We vergeleken het niveau van RDL RNA van RDL-CRISPR-Cas 9 geïnjecteerde bijen (n = 19) met het niveau van RNA bij bijen die niet werden geïnjecteerd (n = 12). In deze experimenten was de relatieve reductie van de mRNA RDL 59% ± (gemiddelde ± 15% SE) vergeleken met het niveau van RNA bij niet-geïnjecteerde bijen. Toen we het niveau van RDL RNA in elke bij afzonderlijk onderzochten, vertoonden slechts 13 bijen van de 19 bijen een significante vermindering van het RNA. Deze gegevens geven aan dat injectie van RDL-CRISPR-Cas9 via de ocelli misschien niet altijd een groot aantal hersencellen bereikt, wat de gegevens bevestigt met RDL immuun-gekleurde RDL-CRISPR-Cas9 geïnjecteerde bijen. In deze preparaten had slechts één op de 8 RDL CRISP-Cas9 in veel hersencellen (champignonlichaam, protocerebrum en antennekwab) vergeleken met andere bijenhersenen, waarbij de verdeling van de RDL-CRISPR-Cas9 geconcentreerd was in cellen in de protocerebrum (champignonlichaamkkel en centraal complex) maar niet de antennelkwab (figuur 4A-D).
Anti-mGlutR1 antilichamen tests We gebruikten de anti-mGlutR1 antilichamen geproduceerd in konijn tegen geconjugeerde peptiden specifiek voor Drosophila melanogaster (Figuur 2A). De volgorde van dit peptide toont een 94% identiteit met de bijenpeptide (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figuur 2A. Eerst controleerden we de antilichamen tegen het bijenherseneiwit met behulp van immunoblotting. Het bijenbrein homogenaat werd gescheiden door 10% SDS-PAGE en elektroforretisch overgebracht van een nitrocellulosemembraan en bevlekt met anti-mGlutR1. De insert in figuur 2A toont twee banden met geschatte gewichten (103 en 83 kD) die overeenkomen met twee isovormen. Toen we dit antilichaam testten op honingbijhersenen, ontdekten we dat ze neuropilarprofielen en cellen in de bijenhersensecties labelen, zoals geïllustreerd in figuur 2B,D. Na preadsorptie van het anti-mGlutR1-antilichaam met geconjugeerd mGlutR1 peptide, verdween de specifieke kleuring in het bijenhersensegment (figuur 2C). Dit bevestigt dat anti-mGlutR1 antilichamen herkennen het peptide (Figuur 2C). Vervolgens injecteerden we een mix van mGlutR1-CRISPR-Cas9 in de mediaan ocelli en gebruikten we de control noguideRNA. Bij controlebijen (n = 7) was de fluorescentie van ATTO550 niet geconcentreerd in de cellen. Sommige hersenen hadden verspreid fluorescentie ATTO550 etikettering. Zo toont het controlepreparaat in figuur 2D1-3 anti-mGlutR1-vlekken in de hersenen, maar niet de FLUORESCENTie van atto550. Toen mGlutR1-CRISPR-Cas9 in de ocelli werd geïnjecteerd en door veel cellen werd opgenomen, werd het fluorescentieniveau van de secundaire antilichamen aanzienlijk verminderd in het gebied dat de functionele mGlutR1RNP(figuur 2E1-3) inneemt. De bijen werden gecontroleerd voor 48 uur, en een bij uit elke experimentele toestand werd dood gevonden. Zo hebben we in dit experiment zeven controlebijen en acht CRISPR-Cas9-bijen gecontroleerd. Alle bijen geïnjecteerd met CRISPR-Cas9 hadden cellen die mGlutR1-CRISPR-Cas9 in zich opnamen. De meeste van deze cellen waren in de paddestoel lichaam kelk, centraal complex, en achterste protocerebrum. Slechts twee van de zeven bijen toonden ATTO550 labeling in vele cellen in het paddestoellichaam, centraal complex, en de antennekwab. Een voorbeeld van een van deze bijen is te zien in figuur 2E. De vermindering van het niveau van mGlutR1 kleuring in deze preparaten was significant. De andere vijf bijen hebben ATTO550 labeling die overeenkomt met de succesvolle levering van de mGlutR1 CRISPR-Cas9 in de paddestoel lichaam en achterste protocerebrum, maar niet in de antennel kwabben.
Vervolgens hebben we na injectie het niveau van de gemodificeerde mGlutR1 gDNA in de bijen 48 uur na injectie geschat, een qPCR-gebaseerde drop-off test uitgevoerd, waarbij de drop-off sonde is ontworpen om zich in het gebied in de buurt van de mGlutR1-gids te bevinden. In deze experimenten, in de bijenhersenen geïnjecteerd met mGlutR1-CRISPR-Cas 9, was de relatieve modificatie van gDNA bij 12 bijen 59% ± (gemiddelde ± 33 %SD) vergeleken met gDNA bij niet-geïnjecteerde bijen (figuur 3A).
Deze resultaten werden ook bevestigd door qRT-PCR-tests in een andere groep bijen, waarbij we de mGlutR1 RNA-niveaus met qRT-PCR bij de bijen 48 uur na injecties met RNPmGlutR1mix(figuur 3B )schatten. We vergeleken het niveau van mGlutR1 RNA van de mGlutR1-CRISPR-Cas9 geïnjecteerde bijen (n = 6) met de RNA-niveaus bij bijen die niet werden geïnjecteerd (n = 6). In deze experimenten was de relatieve reductie van het mRNA mGlutR1 bij geïnjecteerde bijen 53% ± (gemiddelde ± 18% SE) in vergelijking met niet-geïnjecteerde bijen (figuur 3B).
De sectie van vier verschillende bijen die de RNP RDL-CRISPR-Cas9 in Kenyon cel van paddestoel lichaam uitgedrukt is weergegeven in figuur 4A-D. Het voorbeeld bij met ATTO550 fluorescentie in het paddestoellichaam en de antennekwab wordt weergegeven in figuur 4E,F.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gidsen</td>
			<td>Sequenties</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>RNP (RNP)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[guideRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 Nuclease]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGACCCCCGCT ACCGTAA</td>
			<td>GRDL1 GRDL1</td>
			<td>RRDL1 RRDL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2 GRDL2</td>
			<td>RRDL2 RRDL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAACACGTGCCC</td>
			<td>GRDL3 GRDL3</td>
			<td>RRDL3 RRDL3</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTATCTGACGGTGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2 RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3 GMGL3</td>
			<td>RMGL3 RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Nucleotidesequenties van hulplijnen ontworpen voor RDL en mGlutR1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> Figuur 1: Karakterisering van anti-RDL-antilichamen. (A) Schematisch van de RDL subunit, waarbij de roze cirkels wijzen op de lokalisatie van peptide 2 (extracellulaire CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amide) in de N-terminus en peptide 1 (intracellulaire CVRFKVKVPKAHSKGGTL-amide) in de C-terminus. De insert in A toont de banden in de westerse vlek van honingbij hersenextracten verwerkt met overeenkomstige anti-RDL antilichamen (een met anti-RDL pep1 en anti-RDL pep2). Elke immunoblot toont de schijnbare grootte van het eiwit ~ 50-60 kD, wat overeenkomt met de geschatte gewichten van de verschillende isoform van de RDL subeenheden. (B,C) Preadsorptie van de anti-RDL antilichamen met geconjugeerde peptide 1. Het beeld in C toont een vermindering van kleuring in de sectie toen de antilichamen werden voorbebroed met geconjugeerd peptide 1. Het ventilatorvormige lichaam (Fb) en Ellipsoïde lichaam (eb) zijn centrale complexe structuren in de hersenen. M = mediale kwab van paddestoellichaam. (D1-3) Anti-RDL kleuring van een controle, niet-geïnjecteerde bijenhersensectie na 48 uur. Groen geeft het anti-RDL positieve profiel in de hersenen aan. (D2) Deze bij is niet geïnjecteerd en bevat geen ATTO550 fluorescentie. (D3) Samengevoegde afbeeldingen van D1 en D3. (E1-3) De injectie van RDL-CRISPR-Cas9 verminderde anti-RDL-vlekken na 48 uur (E2) ATTO550 fluorescentie in de celkernen wees op een succesvolle RDL-CRISPR-Cas9 levering. (E3) Het samengevoegde beeld van anti-RDL (groen) en ATTO550 (rood). Schaalbalk = 100 μm (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> Figuur 2: Karakterisering van anti-mGlutR1 antilichamen. (A) Schematisch van GCPR mGluR dat de Drosophila melanogaster peptide gebruikt voor immunisatie toont. Ter vergelijking, de Apis mellifera peptide wordt hieronder weergegeven. De cirkel geeft de lokalisatie van het peptide in het N-terminus van de mGlutR1 receptor extracellulair domein. De insert in A toont aan dat de anti-mGlutR1 antilichamen herkende twee banden in de westerse vlek van bijenhersenen ~ 103 kD en ~ 83 kD die overeenkomen met de geschatte gewichten van bekende isovormen. (B,C) Preadsorptie regeling van het anti-mGlutR1 antilichaam in twee opeenvolgende delen van de antennekwab glomeruli. Afbeelding van anti-mGlutR1 in de antenneglomeruli sectie in C toont de vermindering van de kleuring als gevolg van preincubatie van het anti-mGlutR1 peptide met het anti-mGlutR1 antilichaam. Deze procedure zorgt ervoor dat het antilichaam uit de oplossing neerslaat, waardoor vlekken in vergelijking met B (controle, afwezigheid van het peptide in de preincubatie) worden afgeschaft. (D1) toont vlekken van anti-mGlutR1 in een bijenhersenschijf na een controle-injectie in de mediaan ocellus. Deze injectie miste de mGlutR1 gRNA die het mogelijk maakt het neerhalen van mGlutR1 receptoren door CRISPR-Cas9, en dus de kleuring van de anti-mGlutR1 antilichaam werd niet verminderd (groen). (D2) De afwezigheid van ATTO550 fluorescentie duidt op de afwezigheid van functionele CRISPR-Cas9 in de hersenen. (D3) Samengevoegde beelden van anti-mGlutR1 en ATTO550. (E1-E3) tonen de kleuring van anti-mGlutR1 in een hersensectie waar mGlutR1 permanent is neergehaald 48 uur na injectie met mGlutR1-CRISPR-Cas 9 in de mediaan ocellus. Dus, de kleuring in deze hersenen is sterk verminderd als gevolg van de succesvolle knock-out van de mGlutR1 in veel cellen. (E2) ATTO550 kleuring in vele celkernen in de bijenhersenen geeft aan dat injectie van mGlut1-CRISPR-Cas 9 succesvol was. (E3) Samengevoegd beeld van ATTO550 (rood) en anti-mGlutR1 (groen). Schaalbalk = 10 μm (B,C); 100 μm (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> Figuur 3: Evaluatie van gemodificeerde gDNA en expressie van mRNA van RDL en mGlutR1 mRNA in bijenhersenen 48 uur na injectie met 345 nL van overeenkomstige RPN CRISPR-Cas9. (A) De qPCR-gebaseerde drop-off test om de hoeveelheid gDNA met een wijzigingsgebied te evalueren, werd berekend met behulp van de2-ΔΔCt-methode en genormaliseerd tegen controle, niet-geïnjecteerde hersenen. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde + SD. (B) TheqRT-PCR test werd gebruikt om de hoeveelheid mRNA in CRISPR-Cas9 geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde bijen te evalueren. AmActin werd gebruikt als referentiegen. De relatieve genexpressie werd berekend met behulp van 2-ΔΔCt methoden en genormaliseerd tegen controle, niet-geïnjecteerde hersenen. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde + SE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> Figuur 4: Voorbeeld van de verdeling van RNP CRISPR-Cas9 in bijenhersenen via ATTO550 fluorescentie. (A-D) De hersendelen van vier verschillende bijen die de RNP RDL-CRISPR-Cas9 uitdrukten in de Kenyon cel van het paddenstoelenlichaam. (E,F) Voorbeeld van twee hersenen 48 uur na injectie met RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Schaalbalk = 150 μm (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Hier gepresenteerd is een protocol om de CRISPR-Cas9 systeem te gebruiken voor het verminderen van de productie van een eiwit in de volwassen honingbij hersenen om antilichaam specificiteit te testen.

Anti-RDL en Anti-mGlutR1 Receptoren Antibody Testen in Honingbij Hersensecties met behulp van CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Voor het eerst hebben we een wijziging vastgesteld van de genen gecodeerd voor ionotropische GABAA en metabotropische glutamaatreceptoren in subsets van neuronen in de volwassen honingbijenhersenen. CRISPR-Cas9 genbewerking kan worden gebruikt om een of meerdere genen in volwassen bijenhersenen te wijzigen om hun rol in leren en geheugen onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden te verkennen. Deze methode kan worden gebruikt om de functie van specifieke eiwitten bij volwassen bijen te bestuderen en om de specificiteit van antilichamen te testen tegen de bijbehorende eiwitten.Het aantonen van de procedure met Irina Sinakevitch zal Lev Kurtzman en Hyun Choi, voormalige studenten van mijn laboratorium. Om de expressie van RDL en mGlutR1 te testen door immunocytochemische analyse na CRISPR-Cas9-injectie, gebruikt u eerst een online CRISPR-Cas9-tool om de geleidegeleiders te ontwerpen met behulp van de geleide-DNA-sequentie van apis mellifera, RDL en mGlutR1. Om gids RNA complexe formaties voor te bereiden voor elke gids RNA, label een reageerbuis voor elke gids met de naam van de gids RNA, en voeg 92 microliters van nucleotide-vrije buffer, vier microliters van 100 micromolar fluorofoforeren, gelabeld transactiverende CRISPRRNA, en vier microliters van de juiste gids RNA oplossing aan elke buis.Wanneer alle materialen zijn toegevoegd, meng de oplossingen voorzichtig en draai de buisinhoud vijf seconden in een bench-top centrifuge om de oplossing te bespeuren. Houd vervolgens vijf minuten lang de oplossingen op 95 graden Celsius om een gidsRNA-complex te maken, gevolgd door 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur. Ter voorbereiding van de ribonucleoprotein complexe formaties voeg zes microliters van elke gids RNA-oplossing en zes microliters van 0,5 microgram per microliter SP-Cas9 nuclease V3 aan de juiste gelabelde buizen.Na het zachte mengen, incubeer de oplossingen op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten Om RNP ribonucleoprotein mengsels voor injectie te maken, voeg aan het einde van de incubatie vier microliters van elke ribonucleoprotein toe aan de juiste RDL. Om een controle te maken, no-guide RNA oplossing mix vier microliters van tracer RNA met 92 microliter buffer en vier microliters van water. Na toevoeging van water, houd de oplossing gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius en laat het mengsel afkoelen totdat het kamertemperatuur bereikt.Meng vervolgens zes microliters van de no-guide RNA-oplossing met zes microliters van 0,5 microgram per microliter Cas9 nuclease V3. Voor ribonucleoprotein mengsel injectie, na het vastleggen van individuele bijen in flesjes met een klein gaatje in de doppen, immobiliseren de bijen voor niet meer dan drie minuten op ijs en zet elke bij in eerder voorbereide metalen houders met duct tape. Met de rug thorax, vleugels en hoofd blootgesteld. Gebruik een spuit van vijf milliliter om de bijen te voeden met een een molaire sacharoseoplossing totdat ze geen honger meer hebben, en plaats de beveiligde bijen in een doos met een natte papieren handdoek voor vochtigheid.Plaats vervolgens wax op de binnenkant van de deksels van twee petrischaaltjes van 35 milliliter en leg de bodems van de gerechten op de was. Injecteer een molaire sacharose tussen de cover en onderkant van elk gerecht, en plaats een voeden petrischaal in witte doos met een glazen glijbaan en plaats de andere in zwarte doos met een glazen glijbaan. Plaats vervolgens een kleine kam in elke doos en laad een microinjectiesysteem met het RDL CRISPR-Cas9 mengsel.Voor RDL CRISPR-Cas9 injectie, injecteer de mediane ocelli van acht bijen met 345 nanoliters van ribonucleoprotein RDL mix gevolgd door voeding met een molaire sacharose voordat het vrijgeven van de bijen in de zwarte experimentele doos. Voer een tweede set van acht bijen als controles zonder injecties en laat ze los in de witte controlekast. Plaats vervolgens beide dozen in een polystyreencontainer met nat papier, waarbij de bijen twee keer per dag worden waargenomen om ervoor te zorgen dat ze voldoende voedsel en een goede luchtvochtigheid hebben.48 uur na de injectie, immobiliseer de bijen op ijs gedurende 30 seconden en gebruik een schaar om elk insect te onthoofden. Plaats de koppen in 4%paraformaldehyde IN PBS onder een ontledende microscoop in een rookkap en gebruik een staafschaar van barraquer om de antennes, samengestelde ogen en het bovenste exoskelet voorzichtig maar snel te verwijderen. Laat de hoofden 10 minuten in de fixatieve oplossing zitten voordat u de rest van het exoskelet uit het hoofd en alle resterende luchtpijp verwijdert.Plaats vervolgens elke hersenen in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met ten minste één milliliter van 4% paraformaldehyde 's nachts bij vier tot acht graden Celsius. De volgende ochtend, voeg 3,8 gram argrose tot 50 milliliter gedestilleerd water in een erlenmeyer fles en magnetron de oplossing tot dergrose liquifies. Breng drie tot vier vaste honingbijenhersenen in een nieuwe 35 millimeter petrischaal en gebruik tissuepapier om het overtollige fixatiemiddel te verwijderen.Giet de vloeistof die zich over de hersenen overdurmt en oriënteer de monsters in dergrose, zodat de antennelobben naar boven gericht zijn. Nadat dergrose is gestold, gebruik dan een scalpel uit te snijden individuele blokken van argrose met een enkele hersenen en vul elke put van een 24-goed plaat geladen met een mand met een hydrofobe mesh bodem en 600 microliters van PBS per goed. Gebruik vervolgens een vibratome om een verwerven 70 micrometer dwarsdoorsnedes van het hersenweefsel van elkrgrose blok.Het plaatsen van de secties van een enkele hersenen op het gaas van dezelfde mand als ze worden verworven. Na het labelen van de secties met fluorofofoër geconjugeerde antilichamen, volgens standaardprotocollen, insluiten elke dia met secties van een enkele hersenen met behulp van een druppel montagemedium en visualiseren de monsters door fluorescentie microscopie. Anti-RDL labels neuropils in de frontale sectie van wild-type, maar niet CRISPR-Cas9 RDL knock-out bijenhersenen.Een soortgelijke specificiteit werd waargenomen voor anti-mGlutR1 antilichamen. In deze representatieve, kwantitatieve PCR drop-off tests in bijen hersenen geïnjecteerd met RDL CRIPSR-Cas9, de relatieve vermindering van de fluoresence kwam overeen met het aantal van de gewijzigde gids DNA in het monster. Na mGlutR1 CRISPR-Cas9 injectie, de relatieve wijziging van de gids DNA was ongeveer 59% in de hersenen van geïnjecteerde bijen in vergelijking met de gids DNA waargenomen in de hersenen van niet-geïnjecteerde bijen.In deze kwantitatieve RT-PCR ina aparte groep bijen was de relatieve vermindering van de boodschapper RNA RDL ongeveer 59% in vergelijking met het niveau van RNA in niet-geïnjecteerde bijen, en de relatieve vermindering van de boodschapper mGlutR1 RNA in geïnjecteerde bijen was ongeveer 53%Met name de injectie van RDL CRISPR-Cas9 door de ocelli zou niet altijd een groot aantal hersencellen kunnen bereiken. Bijvoorbeeld, in deze preparaten slechts een van de acht had RDL CRISPR-Cas9 in grote aantallen hersencellen in vergelijking met andere bijenhersenen. Met de RDL CRISPR-Cas9 geconcentreerd in de cellen van het protocerebrum, maar niet de antennekwab.Zorg ervoor dat bevroren en opnieuw bevroren RNA wordt vermeden. Zorg ervoor dat je de bijen niet overkoelt. Gebruik ze onmiddellijk zodra de stop in de flacon beweegt.Deze techniek kan worden gebruikt om de effecten van de vermindering van remmende ionotropische en metabotropische receptoren in het paddenstoellichaam te bestuderen en centraal complex op honingbijgedrag.

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit protocol beschrijven we twee strategieën die tegelijkertijd in honingbijen te onderdrukken twee genen (dubbel gen knockdown). Dan presenteren we hoe de proboscis extensie respons (PER) test om het effect van de dubbele gen knockdown op honingbij smaak perceptie bestuderen gebruiken.

RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

Dit manuscript beschrijft meerdere protocollen voor het toedienen van farmacologische middelen aan de bijen, waaronder eenvoudige niet-invasieve methoden voor vrij vliegende bijen, evenals meer invasieve varianten die precies gelokaliseerde behandeling van ingehouden bijen mogelijk.

Neurofarmacologische Manipulatie van ingetogen en vrij vliegende Honingbijen,<em&gt; Apis mellifera</em

Dit document beschrijft een gedetailleerd en zeer effectief RNA in situ hybridisatie protocol, in het bijzonder voor lage-uitgedrukte Geurstof Receptor (OR) genen, evenals andere genen, in insectenantennen met behulp van digoxigenine (DIG) gelabeld of biotine gelabelde probes.

Lokalisatie van Receptorgenen van Reukstof in Locustantenne door RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Om te testen de remmende effecten van farmacologische agenten op phospholipase C (PLC) in verschillende gebieden van de hersenen van de honingbij, presenteren we een biochemische assay voor het meten van de PLC activiteit in die regio's. Deze bepaling zou kunnen zijn handig voor het vergelijken van PLC activiteit onder weefsels, alsook tussen de bijen verschillende gedragingen vertonen.

Detectie van Phospholipase C activiteit in de hersenen homogenaat van de honingbij

Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo's via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.

Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

We hebben een Duplex in situ hybridisatietest opgezet om insulinereceptorisovormen IR-A en IR-B in de plexus choroid muizen in kaart te brengen, waardoor de beperkingen van traditionele methoden worden overwonnen. Deze benadering met hoge resolutie onthult isovormspecifieke expressie en biedt nieuwe inzichten in insulinesignalering in de hersenen en mogelijke isovormgerichte therapieën voor neurologische aandoeningen.

Nauwkeurige visualisatie van insulinereceptoren A en B in de hersenen van muizen met een RNA in situ hybridisatietest

Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle procedure voor het detecteren van DNA van bijenpathogenen, zoals Lotmaria passim en Nosema ceranae, met behulp van een amplificatie-ready cellysis, recombinasepolymeraseamplificatie en CRISPR/Cas12a-assays.

On-site DNA-detectie van trypanosomatide parasieten en Nosema ceranae door middel van alkalische lysis gekoppeld aan RPA/CRISPR/Cas12a-systeem

Leer CRISPR-Cas9 genbewerking in volwassen honingbijhersenen om GABAA- en glutamaatreceptoren te bestuderen. Deze methode test antilichaamspecificiteit en onderzoekt de rol van eiwitten bij leren en geheugen.

Anti-RDL en Anti-mGlutR1 Receptoren Antibody Testen in Honingbij Hersensecties met behulp van CRISPR-Cas9

Meer video's verkennen