Name: Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Leer optische clearing en beeldvorming van immunolabeled nierweefsel voor driedimensionale analyse. Deze methode maakt visualisatie en kwantificering van grote structuren in transparante organen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T. S. wordt ondersteund door subsidies van de DFG German Research Foundation (332853055), else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), en de medische faculteit van de RWTH Aachen (RWTH returner programma). V. G. P. wordt ondersteund door onderzoeksbeurzen van de Deutsche Gesellschaft fur Nefrologie, de Alexander von Humboldt Foundation en de National Health and Medical Research Council van Australië. D. H. E wordt ondersteund door Fondation LeDucq. R. K. wordt ondersteund door subsidies van de DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de staat Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) en het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek aan de RWTH Aachen University (O3-11).

Opmerking: Alle hier beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, VS, en relevante lokale autoriteiten in Aken, Duitsland.
1. Retrograde abdominale aorta perfusie en fixatie van muis nieren
<ol><li>Bereid oplossingen op dezelfde dag of avond voor en bewaar in een koelkast 's nachts. Warme oplossingen voor het gebruik van kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>
Maak een nieuwe batch van 3% Paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Ongeveer 50-100 mL PFA is nodig per muis.
	<ol>
<li>Om 1 L van 3% PFA te maken: Weeg 30 g PFA af en voeg 800 mL gedistilleerd water toe aan de damp afzuigkap. Roer en verwarm tot 50-60 °C. Niet verwarmen boven 70 °C. Let op: PFA is giftig. Bereid PFA voor in de dampkap.</li>
		<li>Voeg langzaam enkele druppels 2N NaOH toe. Wacht een paar minuten tot PFA in de oplossing gaat of voeg nog een paar druppels toe. Sommige kleine stukjes zullen niet ontbinden.</li>
		<li>Verwijder de oplossing uit de hitte. Voeg 50 mL 20x PBS toe. Chill op ijs naar RT.</li>
		<li>Stel de pH in op 7,3-7.4 met HCl. Voeg gedistilleerd water toe aan 1 L.</li>
		<li>Verwijder alle niet opgeloste deeltjes door het filteren van 1x PBS en 3% PFA met 0,22 μm filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 1.000 eenheden heparin toe aan 1 L 1x PBS. Breng 1x PBS met heparine en 3% PFA in 1x PBS over in afzonderlijke 50 mL plastic spuiten. Opmerking: Indien beschikbaar, kan drukgestuurde pomp ingesteld op 80-100 mmHg of hydrostatische druk (druppel methode, de hoogte van de Perfusie oplossingen: 160-200 cm boven het dier) worden gebruikt voor nierperfusie.</li>
	<li>Verbind de PBS, PFA en een afgerond zijn 21 G vlindernaald op een drie-weg stopcock. Zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes in het hele systeem zitten.</li>
	<li>Label een conische buis van 15 mL en verdeel er 10 mL PFA in.</li>
	<li>Diep anesthetiseren een mannelijk of vrouwelijk C57BL/6 muis 12-24 weken oud met behulp van 120 mg/kg lichaamsgewicht ketamine en 16 mg/kg lichaamsgewicht xylazine. Het dier moet gecontroleerd worden op volledige afwezigheid van responsiviteit door de reflexen te knijpen voordat het doorgaat naar een operatie (bijv. teen pinch reflex).</li>
	<li>Zodra het dier een chirurgische vlak van anesthesie heeft bereikt, zet het op zijn rug onder de ontleed Microscoop. Open de buik chirurgisch met een middenlijn abdominale incisie met behulp van een operatie schaar en bloot de abdominale aorta.</li>
	<li>Klem de abdominale aorta recht boven het vertakken naar de darm slagader met een gebogen hemostat. Vervolgens klem de abdominale aorta direct onder de nierslagaders met een micro serverfijnen. Maak een kleine incisie (1 mm) op de abdominale aorta tussen de twee klemmen met vannas schaar. Steek de vlindernaald langzaam in de incisie en wees voorzichtig om de abdominale aorta open niet te scheuren.</li>
	<li>Ligate de juiste Nierslagader met een 5-0 zijde hecht en verwijder de rechter nier voor andere analyse als slechts één nier nodig is voor perfusie en fixatie.</li>
	<li>Verwijder de micro serverfijnen, transect de portaal ader met vannas-schaar, en parfumeer onmiddellijk met 50 mL PBS die heparin bevat, dan overschakelen en parfuseren met 50 mL 3% PFA. Opmerking: Hoge perfusiedruk door abdominale aorta is vereist om niertubuli te openen voor betere antilichaam diffusie via weefsel. Perfusie door het hart mag geen niertubuli openen.</li>
	<li>Verzamel de geperfundeerd nier zorgvuldig en Vermijd perforeren of knijpen van het weefsel.</li>
	<li>Verwijder de capsule en snijd de nier in 1 mm dikke coronale plakjes. Gebruik een slicermatrix (tabel met materialen) om de segment dikte te standaardiseren. Opmerking: U ook een vibratome gebruiken.</li>
	<li>Dompel de nierschijfjes onder in de geprepareerde PFA in het gelabelde 15 mL conische buisje.</li>
	<li>Breng 10 mL PFA aan op een ander label van 15 mL conische buis. Spoel de drie-weg kraantje en vlindernaald met PBS voordat u naar de volgende muis gaat.</li>
	<li>Voer de post-fixatie 's nachts op RT beschermd tegen licht uit.</li>
</ol>2. weefsel voorbereiding en-immunokleuring
<ol><li>Na de fixatie de nierslice tweemaal wassen met 1x wasbuffer (tafel van de materialen) voor 1 uur op een horizontale Rocker op rt.</li>
	<li>Antigeen-opvraging uitvoeren. Verwarm 300 mL 1x antigeen ontmaskerings oplossing (T instaat van materialen) in een bekerglas van 500 mL tot 92-98 °c. Plaats het segment in de insluitings cassette die doorverbonden is met de verwarmde buffer met roeren gedurende 1 uur bij 92-98 °C. Haal het bekerglas uit de hitte en laat het afkoelen tot RT. Opmerking: Sommige leveranciers testen hun antilichamen voor immunohistochemie toepassing en zullen een voorgestelde antigeen-Ophaalmethode in het gegevensblad opnemen. Daarom kan voor sommige epitopen een meer basale buffer nodig zijn (bijv. pH 9).</li>
	<li>Breng het segment over in 10 mL 1x wasbuffer met 0,1% Triton X-100 en Rock 's nachts op RT. was de sneetjes 2x met 10 mL verse 1x wasbuffer voor 1 uur de volgende dag.</li>
	<li>Verdun het primaire antilichaam in 500 μL van normaal antilichaam verdunningsmiddel (tabel met materialen). Begin met een concentratie van 1:50-1:100. Draai de nierslice voorzichtig in verdund primair antilichaam voor 4 d bij 37 °C. Opmerking: Aangezien elk antilichaam unieke eigenschappen heeft, moet de temperatuur tijdens antilichaamincubatie en verdunningen van antilichamen worden geoptimaliseerd voor individuele sondes. Voor secundaire antilichamen, incuberen nierweefsel in verdunningsmiddel zonder primair antilichaam. In plaats van commercieel antilichaam verdunent, kan 1x PBS met 0,1% Triton X-100 en 0,01% natrium natriumazide worden gebruikt.</li>
	<li>Was de nierslice in 10 mL 1x reinigings buffer 's nachts op RT met één verandering van de wasbuffer na 8 uur.</li>
	<li>Verdun de secundaire antilichamen (bijv. 1:100 voor Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen) in 500 μL van normaal antilichaam verdunningsmiddel. Incuberen de nierschijfjes in verdund secundair antilichaam gedurende 4 dagen bij 37 °C. Vanaf deze stap beschermt u de nierplakjes tegen licht.</li>
	<li>Was de nierschijfjes in 10 mL 1x wasbuffer 's nachts op RT met één verandering van de wasbuffer na 8 uur.</li>
</ol>3. weefsel clearing
<ol><li>Transfer nier Slice naar 5 mL hoogwaardige 100% ethanol (tabel van de materialen) voor 2 h op RT met zachte schommelen (met een verandering in verse ethanol na 1 h). Deze stap is voor weefsel uitdroging. Opmerking: Hoge kwaliteit ethanol is nodig om een hoge weefsel translucentie in de volgende stap te bereiken. Methanol of tetrahydrofuraan zijn alternatieve dehydratie reagentia met een hoog delipidatie potentiaal.</li>
	<li>Dompel het niersegment onder in 2 mL ECi (tabel met materialen) met zachte schommelen bij RT (met een verandering in Fresh ECI na 2 uur) 's nachts. Opmerking: Het Vries-/smelt punt van ECi is 6-8 °C. Bewaar de monsters daarom niet in de koelkast. Dompel je onder in een goed geventileerde rook afzuigkap en Vermijd direct contact met kleding en huid (ECi is een niet-toxisch voedsel-en geneesmiddelen administratie-goedgekeurde compound maar heeft een sterke geur). Gebruik reguliere Eppendorf-tubes of glazen vaten (geen polystyreen vaten).</li>
	<li>Weefsel translucentie kan worden bereikt na een EBI-onderdompeling en wanneer de nierschijfjes klaar zijn voorbeeld vorming.</li>
</ol>4. ConfocalImaging en beeldanalyse
Opmerking: Voorbeeld vorming kunnen andere microscopie technieken worden gebruikt, zolang de refractieve index matching-oplossing compatibel is met de objectief lens. Dit protocol maakt gebruik van een omgekeerde confocale Microscoop.
<ol><li>Voeg 600-1000 μL ECi toe aan de glazen bodem schotel (tabel met materialen). Opmerking: Vermijd het gebruik van reguliere celkweek gerechten, want ECi is een organisch oplosmiddel dat de plastic gerechten oplost. Evenzo zou ECi plastic onderdelen/isolatie ringen op objectieve lenzen kunnen aanvallen. Raadpleeg de juiste rapporten voor een overzicht van compatibele beeldvormings schalen30 en zelfgemaakte 3-D bedrukte kamers28.</li>
	<li>Breng de doorschijnende nierslice in de schaal. Plaats een ronde afdekplaat op de nierslice om licht druk toe te passen op de glazen bodem. Verzegel de schaal met paraffine folie (tabel met materialen) om lekkage van ECI te voorkomen. Opmerking: Hele organen of meerdere millimeter dikke weefsel sneden kunnen een rand vereisen (tand cement of siliconen elastomeer; Zie tabel met materialen) rond het weefsel om een EBI-pool voor het monster te maken.</li>
	<li>Plaats het schaaltje op het Microscoop beeldvormings platform.</li>
	<li>Neem verschillende z-stacks en voer stiksels uit. Begin met een z-Step grootte van 5 μm. Opmerking: Overweeg het gebruik van lange werkafstand (> 5 mm) en hoge numerieke diafragma (> 0.9) doelstellingen voorbeeld vorming van zeer dikke weefsel plakjes of organen. Na het beeld, breng het weefsel terug naar ethanol en bewaar in de wasbuffer of PBS met 0,02% natrium azide.</li>
	<li>Analyseer de afbeelding met 3D-rendering met software (tabel met materialen).</li>
</ol>

<ol><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+podocyte+depletion%3A+theoretical+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+can+see+clearly+now%3A+optical+clearing+and+kidney+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li>
<li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+%28in+press%29%22%5BJournal%5D)">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li>
<li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).</li>
<li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Optische clearing technieken hebben brede aandacht gekregen voor 3D-visualisatie en kwantificering van micro anatomie in verschillende organen. Hier werd solvent gebaseerde clearing Method (ECi) gecombineerd met immunolabeling voor 3D-beeldvorming van hele tubuli in nierschijfjes. Deze methode is eenvoudig, goedkoop en snel. Andere onderzoeksvragen kunnen echter het best worden beantwoord met andere clearing protocols5. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat op oplosmiddel gebaseerde ...

De groeiende belangstelling voor het bestuderen van hele organen of grote multicellulaire structuren hebben geleid tot de ontwikkeling van optische clearing methoden die betrekking hebben op Imaging van transparante weefsel in drie dimensies. Tot voor kort waren de beste methoden om het aantal cellen, de lengte of het volume van hele structuren te schatten stereologie of uitputtende seriële snede, die is gebaseerd op de systemische bemonstering van weefsel voor latere analyse in twee dimensies1, 2 , 3. deze methoden zijn echter tijdrovend en hebben behoefte aan een hoog niveau van opleiding en expertise4. Optische clearing methoden overwinnen deze problemen door het evenwicht van de brekingsindex in een monster te maken van weefsel doorschijnend voor 3D-beeldvorming5,6,7.
Er zijn verschillende optische clearing methoden ontwikkeld die in twee hoofdcategorieën vallen: op oplosmiddel gebaseerde en waterige methoden. Waterige methoden kunnen verder worden onderverdeeld in eenvoudige onderdompeling van8,9, hyperhydratatie10,11, en hydrogel insluiten12,13. Oplosmiddel gebaseerde methoden dehydraat het weefsel, verwijderen lipiden en normaliseren de brekingsindex tot een waarde rond 1,55. Beperkingen van de meeste op oplosmiddelen gebaseerde methoden zijn het afschrikken van endogene fluorescentie van veelgebruikte reporter eiwitten zoals GFP, oplosmiddel toxiciteit, capaciteit om lijm op te lossen die wordt gebruikt in sommige beeldvormings kamers of objectieve lenzen, en krimp van weefsel tijdens Dehydratie14,15,16,17,18,19,20,21. Oplosmiddel gebaseerde methoden zijn echter eenvoudig, tijdbesparend en kunnen in een aantal verschillende weefsel typen werken.
Waterige methoden zijn afhankelijk van de onderdompeling van het weefsel in waterige oplossingen die brekingsindices hebben in het bereik van 1,38-1.528,11,12,22,23,24 . Deze methoden werden ontwikkeld om endogene fluorescerende reporter eiwit emissie te behouden en uitdroging veroorzaakte krimp te voorkomen, maar beperkingen van de meeste waterige gebaseerde clearing methoden omvatten een langere duur van het Protocol, weefsel uitbreiding, en eiwit modificatie (d.w.z. partiële denaturatie van eiwitten door ureum in hyperhydrerende protocollen zoals SCALea2)7,11,23,25. SCALeS gericht weefsel uitbreiding door het combineren van ureum met sorbitol, die tegenwicht door uitdroging van de ureum-geïnduceerde weefsel expansie, en behouden van de weefsel ultrastructuur zoals geëvalueerd door elektronenmicroscopie10. Weefsel krimp of-expansie beïnvloedt de absolute afmetingen van structuren, afstanden tussen objecten of celdichtheid per volume; Zo kan de meting van de grootte veranderingen bij het opruimen van het weefsel helpen bij het interpreteren van de verkregen resultaten7,26.
In het algemeen bestaat een protocol voor optische clearing uit meerdere stappen, waaronder voor behandeling, permeisatie, immunolabeling (indien nodig), brekingsindex matching en beeldvorming met geavanceerde Lichtmicroscopie (bijv. twee-foon, confocale of fluorescentiemicroscopie van licht blad). De meeste van de clearing benaderingen zijn ontwikkeld om neuronale weefsel te visualiseren, en opkomende studies hebben hun toepassing in andere organen5gevalideerd. Deze uitgebreide tool is eerder aangetoond dat het mogelijk maakt betrouwbare en efficiënte analyse van nierstructuren, met inbegrip van glomeruli27,28, immuun infiltraten28, therapieën28, en tubulus segmenten 29, en het is een ideale benadering om beter begrip van glomerulaire functie en tubulus remodellering in gezondheid en ziekte.
Samengevat hier is een oplosmiddel gebaseerde methode die immunokleuring van niertubuli combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en gebruiksklaar chemisch ethyl CINNAMAAT (EBI); en confocale microscopie beeldvorming die volledige tubulus visualisatie en kwantificering mogelijk maakt. Deze methode is eenvoudig, combineert antigeen-opvraging van nierschijfjes met kleuring van commerciële antilichamen, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor het toegankelijk is voor de meeste laboratoria.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>21 G vlindernaald</td><td>Braun</td><td>Venofix</td><td></td></tr><tr><td>3-weg stopkraan</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>3D analysesoftware</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>3D analysesoftware</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>gratis open-source software</td></tr><tr><td>5-0 zijdedraad</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastic spuiten</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU monoklonaal antilichaam</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Antilichaamverdunning</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td>BioLegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>Citraat-gebaseerde antigeenretrievaloplossing</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen hemostaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Dako Wash Buffer</td><td>Agilent</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingscassettes</td><td>Carl Roth</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl cinnamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>Flexibele film/Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-AQP2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>Guinea pig anti-NKCC2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemostaat</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>Horizontale slinger</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvormingsschaal</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>Micro snelklem</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Operatie schaar</td><td>Merit</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-phoshoThr53-NCC</td><td>PhosphoSolutions</td><td>p1311-53</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen elastomeer</td><td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Weefselsnijder</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Lancer</td><td>Series 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>MWI Animal Health</td><td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td><td></td></tr></tbody></table>

optische clearing en beeldvorming van immunolabeled nierweefsel

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optische clearing technieken maken weefsel doorzichtig door de brekingsindex in een steekproef te equilibreren voor daaropvolgende driedimensionale (3-D) beeldvorming. Ze hebben veel aandacht gekregen in alle onderzoeksgebieden voor het potentieel om microscopische multicellulaire structuren te analyseren die zich uitstrekken over macroscopische afstanden. Gezien het feit dat nierbuisjes, vasculatuur, zenuwen en glomeruli zich in vele richtingen uitstrekken, die tot nu toe slechts gedeeltelijk zijn gevangen door traditionele tweedimensionale technieken, opende weefsel clearing ook veel nieuwe gebieden van nieronderzoek. De lijst van optische clearing methoden groeit snel, maar het blijft moeilijk voor beginners op dit gebied om de beste methode voor een bepaalde onderzoeksvraag te kiezen. Voorzien hier is een eenvoudige methode die antilichamen labelen van dikke muis nierschijfjes combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en kant-en-klare chemisch ethyl CINNAMAAT; en confocale beeldvorming. Dit protocol beschrijft hoe de nieren te parfuseren en een antigeen-ophaal stap te gebruiken om antilichaam binding te verhogen zonder gespecialiseerde apparatuur te vereisen. De toepassing wordt gepresenteerd in beeldvorming verschillende multicellulaire structuren binnen de nier, en hoe u problemen met slechte antilichamen penetratie in weefsel wordt aangepakt. We bespreken ook de potentiële moeilijkheden van het beeldvormende endogene fluor en het verwerven van zeer grote monsters en hoe ze te overwinnen. Dit eenvoudige protocol biedt een eenvoudig te installeren en uitgebreid hulpmiddel om weefsel in drie dimensies te bestuderen.

Nieren zijn complexe organen bestaat uit 43 verschillende celtypen31. De meeste van deze cellen vormen grote multicellulaire structuren zoals glomeruli en tubuli, en hun functie is sterk afhankelijk van interacties met elkaar. Klassieke 2-D histologische technieken vangen deze grote structuren gedeeltelijk op en kunnen de focale veranderingen binnen intacte structuren missen31. Dus, 3D-analyse met behulp van optische clearing technieken helpt om te begrijpen hoe ze function...

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Groeiende interesse in het bestuderen van grote, multicellulaire structuren leidde tot de ontwikkeling van deze optische clearing techniek die het mogelijk maakt voor een driedimensionale visualisatie en kwantificering van grote structuren binnen transparante organen. Dit protocol biedt een eenvoudige, goedkope, eenvoudig op te zetten en uitgebreide tool om weefsel in drie dimensies te onderzoeken. Meerlaagse aard van een ziekte kan niet altijd worden gesimuleerd door traditionele tweedimensionale technieken.Driedimensionale analyse van weefsel kan helpen om ziekte beter te diagnosticeren en te monitoren. Deze methode is niet beperkt tot nierweefsel en kan worden toegepast op een normaal en ziek weefsel. Dit eenvoudige protocol is gemakkelijk te volgen voor elke wetenschapper met enige ervaring in dierbehandeling.Het is belangrijk om verschillende antilichamen te testen in het geval van slechte antilichaam etikettering, en uitvoeren secundaire antilichaam alleen controles. Begin met het voorbereiden van heparine met PBS en 3,0% paraformaldehyde in 1X PBS volgens de handschriftaanwijzingen en het overbrengen van de oplossingen in afzonderlijke 50 mL plastic spuiten. Paraformaldehyde is giftig en moet worden voorbereid in de rookkap.Verzamel en overvloedig de nier volgens het manuscript aanwijzingen. Verwijder vervolgens de capsule en snijd de nier in een mm dikke coronale plakjes. Dompel de nierplakjes onder met de geprepareerde paraformaldehydeoplossing in een conische buis van 15 mL.Na fixatie, was de nier slice twee keer met 1X wasbuffer voor een uur op een horizontale tuimelschakelaar en ga dan verder met antigeen ophalen. Verwarm 300 mL 1X antigeen ontmaskeringsoplossing in een bekerglas van 500 mL. Sluit vervolgens een nierschijfje in een inbeddingscassette die doorlaat aan de verwarmde buffer en roer deze gedurende een uur op 92 tot 98 graden Celsius.Het is belangrijk om de temperatuur stabiel te houden tussen 92 en 98 graden Celsius voor deze antigeen retrieval stap. Breng het segment vervolgens over in 10 mL 1X wasbuffer met 0,1%Triton X-100 en rock het 's nachts. De volgende dag was je de schijf twee keer met 10 mL verse 1X wasbuffer gedurende een uur.Verdun het primaire antilichaam in 500 microliter van normaal antilichaamverdunningsmezzo. Wieg het niersegment zachtjes in verdund primair antilichaam gedurende vier dagen bij 37 graden Celsius. Na de incubatie was je de nierschijf 's nachts in 10 mL 1X wasbuffer bij kamertemperatuur en verander je de buffer eenmaal na acht uur.Verdun de secundaire antilichamen in 500 microliter van normaal antilichaamverdunningsmezzo en incubeer met de nierschijf gedurende vier dagen bij 37 graden Celsius. Houd er rekening mee dat vanaf deze stap naar voren, de nier slice moet worden beschermd tegen licht. Na incubatie met secundaire antilichamen, was de nierschijf in 10 mL 1X wasbuffer 's nachts bij kamertemperatuur.Om de nier schijf te dehydrateren, breng het naar vijf mL van hoge kwaliteit 100%ethanol en rock het voor twee uur bij kamertemperatuur, verfrissende de ethanol na een uur. Dompel de nierschijf onder in twee mL ethylcinnamaat en rock zachtjes 's nachts. Wanneer klaar om het weefsel beeld, voeg 600 tot 1000 microliter ethylcinnamaat in een glazen bodem schotel en breng de nier plak in de schotel.Plaats een ronde deksel slip op de nier slice en verzegel de schotel met paraffine film. Plaats de schotel op de microscoop beeldvorming platform en beeld het weefsel volgens het manuscript richtingen. Dit protocol is gebruikt om succesvol uit te voeren 3D-analyse op nierweefsel en celfuncties en interacties te evalueren.De methode kan leiden tot fluorescerende verslaggever blussen, maar andere sterke tl-eiwitten kunnen weerstaan signaal blussen. Abdominale aorta-overvloed kan de verspreiding van antilichamen verbeteren. In sommige gevallen resulteert een slechte penetratie van antilichamen in een oppervlakkig signaal.Dit kan worden gecorrigeerd met hogere concentraties of aanvulling van antilichaam. Intravasculaire levering moet worden overwogen als het antigeen van belang wordt uitgedrukt in niervaculatuur. Echter, antilichamen gericht op eiwitten in het apicale membraan van tubule epitheelcellen niet over de glomerulaire filtratie barrière en veroorzaken niet-specifieke signalen.Het weefsel kan worden gelabeld met de antilichamen om een specifieke celpopulatie te detecteren of om hele tubulesegmenten te visualiseren. Bovendien kan colocalisatie van eiwitten in 3D worden bereikt door meerdere antilichamen te combineren. Het is belangrijk om te onthouden dat de antilichaam etikettering kan worden verbeterd met een goede nier-profusie, het gebruik van antigeen retrieval stap, en een hoge concentratie van antilichamen.Sommige sterke reporter eiwitten kunnen weerstaan blussen van fluorescerend signaal volgens dit protocol. Om dit te testen, sla je de stappen voor het terughalen van antigeen en antilichamen over. Deze techniek respecteert het driedimensionale karakter van structuren en opent veel nieuwe onderzoeksgebieden.Het elimineert een vereiste veronderstellingen en interferenties in verband met traditionele tweedimensionale analyse.

optical-clearing-and-imaging-of-immunolabeled-kidney-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Source: Behera, R. K., et al. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a method for preparing infected mouse kidney tissue, staining DNA, and detecting bacterial gene expression using dual fluorescent reporters. Red marks all bacteria, and green highlights infection-responsive cells.

Fluorescence Imaging of Bacterial Colonization in Mouse Kidney Tissue

This video demonstrates an assay for the whole-mount staining of murine kidneys using a tissue-clearing method called CUBIC (clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis) and immunofluorescent staining. The kidney is subjected to tissue clearing, wherein the kidney is delipidated, decolorized, and treated with a refractive index matching solution to make the tissue transparent for optimum three-dimensional imaging. The tissue is stained with fluorescently labeled...

A Whole-Mount Organ Staining Technique for Three-Dimensional Imaging of the Kidney

ACT-PRESTO (actieve duidelijkheid techniek drukgerelateerde efficiënte en stabiele overdracht van macromoleculen in organen) maakt een snelle, efficiënte, maar goedkope weefsel clearing en snelle antilichaam penetratie in de weefsels ontruimd door passieve diffusie of druk bijgestaan ​​levering. Met behulp van deze methode, kan een breed scala van weefsels worden gewist, immunolabeled door meerdere antilichamen en volume-afgebeeld.

ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.

Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken

Het doel van dit protocol is om intacte pacemakergebieden van het nierbekken van de muis te isoleren met behulp van vibratoomsecties. Deze secties kunnen vervolgens worden gebruikt voor in situ Ca2+ beeldvorming om Ca2+ transiënte eigenschappen van pacemakercellen en andere interstitiële cellen in vibratoomsegmenten te verduidelijken.

Isoleren en beeldvorming Live, intact pacemakergebieden van het nierbekken van de muis door vibratoomsecties

Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

Het identificeren van het celtype dat verantwoordelijk is voor het afscheiden van cytokinen is noodzakelijk om de pathobiologie van nierziekte te begrijpen. Hier beschrijven we een methode om nierweefsel kwantitatief te kleuren voor cytokines geproduceerd door nierepitheel- of interstitiële cellen met behulp van brefeldin A, een secretieremmer, en celtypespecifieke markers.

Identificatie van de bron van uitgescheiden eiwitten in de nier door Brefeldin A-injectie

Hier presenteren we een protocol met behulp van 2-fotonmicroscopie in München Wistar Fromter-ratten met oppervlakteglomeruli om de effecten van langdurige ureterale obstructie op glomerulaire dynamiek en functie te kwantificeren.

2-fotonenmicroscopie gebruiken om de effecten van chronische unilaterale ureterale obstructie op glomerulaire processen te kwantificeren

Het huidige protocol beschrijft een weefselzuiveringsmethode en immunofluorescente kleuring met volledige mount voor driedimensionale (3D) nierbeeldvorming. Deze techniek kan macroscopische perspectieven bieden in de nierpathologie, wat leidt tot nieuwe biologische ontdekkingen.

Whole-Kidney Driedimensionale Kleuring met CUBIC

Deze studie presenteert een gebruiksvriendelijke, complete en eenvoudige reeks methoden om glomeruli uit CUBIC-gezuiverde muizennieren te labelen en te analyseren. Gegevens zoals het aantal en het volume van de glomerulus kunnen eenvoudig en betrouwbaar worden verkregen met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-Dextran, light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) of gewone confocale microscopie en software zoals Imaris.

Een efficiënte en snelle methode voor het labelen en analyseren van muizenglomeruli

Leer optische clearing en beeldvorming van immunolabeled nierweefsel voor driedimensionale analyse. Deze methode maakt visualisatie en kwantificering van grote structuren in transparante organen mogelijk.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Meer video's verkennen