Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie

Het protocol maakt de specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden in levende cellen en de kwantitatieve studie van hun beweging in een hoge resolutie mogelijk. Incubatie met de fluorescerende kleurstof omzeilt alleen de noodzaak van fluorescerend eiwit boven expressie, het vermijden van gerelateerde artefacten en beperkingen en waardoor ons protocol kan worden toegepast op niet-transfecteerbare cellen. Om preferentiële nucleoïde kleuring te bereiken, moet men SYBR Gold gebruiken en niets anders onder de omstandigheden die we hebben geoptimaliseerd.

Anders kan het totale cellulaire DNA worden gekleurd. Één dag vóór de etiketteerprocedure, cultuur vier keer 10 aan de vijfde cellen HeLa in twee milliliters van middel in een 35 millimeter Petri schotel. De volgende ochtend, was de cellen in twee milliliter PBS alvorens een milliliter fenol rode vrije cultuurmedium en één milliliter van de aangewezen 2X etiketteeroplossing toe te voegen.

Na 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, zorgvuldig aanzuigen de kleurstof met supernatant van elke 35-millimeter petrischaal en was de cellen met twee milliliter PBS. Voer vervolgens de cellen met verse fenol rode vrije cel cultuur medium en de cultuur terug te keren naar de cel cultuur incubator beschermd tegen licht tot live imaging. Voor live celbeeldvorming, ten minste een uur voor de beeldvorming sessie, plaats het podium top incubator op de super resolutie gestructureerde verlichting microscoop stadium en stel de temperatuur op 37 graden Celsius en de kooldioxide concentratie op 5%Schakel op alle componenten van de microscoop met inbegrip van de lasers en selecteer een hoge vergroting, hoge numerieke diafragma onderdompeling doelstelling zoals aanbevolen voor Super resolutie gestructureerde verlichting microscopie door de microscoop fabrikant.

Wanneer de lasers zijn opgewarmd, installeer de 35-millimeter Petri schotel op de microscoop stadium en gebruik de oculair om een gebied van belang met cellen aan de onderkant van de schotel te lokaliseren. Om super resolutie gestructureerde verlichting microscopie beelden te verwerven, gebruik maken van een back-end high-end elektron vermenigvuldigen lading gekoppelde apparaat camera. In de beeldverwervingssoftware stelt u een hoge vermenigvuldigingswinst in, zoals aanbevolen voor de camera.

Voordat het verwerven van de time lapse-serie voor nucleoïde tracking, verwerven van een twee kleur super resolutie gestructureerde verlichting microscopie beeld van hetzelfde gezichtsveld in een kanaal voor mitochondriale vlekken en een andere voor SYBR goud. Stel het mitochondriale kleurkanaal in op de juiste excitatie en emissie voor de gebruikte mitochondriale vlek en stel de juiste excitatie- en bang Pass-emissiefilter in voor de SYBR-goudkleurstof. Stel de laagst mogelijke laserkracht in voor beide kanalen.

Als de microscoop alleen sequentiële kanalen verwerft, schakelt u het kanaal uit voor de mitochondriale vlekdetectie. untick de Z-stack box in de software uit te schakelen van de Z-stack acquisitie om de verwerving van een enkel brandpuntsvlak in te stellen en de kortst mogelijke camera belichtingstijd in te stellen. Stel drie rotaties van het raster in en verkrijg tweedimensionale beelden van de gelabelde cellen bij verschillende laserkrachtwaarden en meerdere belichtingstijden om de laserkracht in de belichtingstijd van de camera te optimaliseren.

Selecteer de laserkracht en camerabelichtingstijden die gestructureerde verlichtingsmicroscopiebeelden opleveren met lichtpuntjes in de mitochondriën met weinig of geen artefacten en start de aankoop van de time lapse-serie met behulp van de geoptimaliseerde instellingen. Voor analyse van de time lapse-afbeeldingen opent u de geconverteerde gestructureerde verlichtingsmicroscopiebeelden en een geschikte beeldanalysesoftware met een spottrackingmodule en klikt u op nieuwe spots om de wizard spotscreatie op te starten. Klik onder het tabblad Maken op plekken na verloop van tijd bijhouden en ga naar de tweede stap van de wizard.

Stel de geschatte x-y diameter in op 0,1 tot 0,15 micrometer. Klik op achtergrondaftrekken en ga naar de derde stap in de wizard. Sleep de verticale lijn in het histogram om de drempel van het kwaliteitsfilter aan te passen totdat de meerderheid van de nucleotiden wordt gedetecteerd omdat vlekken in de artefacten niet in elk frame worden gedetecteerd.

Ga naar de vierde en vijfde stap van de wizard en selecteer het autoregressieve bewegingsalgoritme. Stel de maximale afstand in op 0,5 micrometer en de maximale tussenruimte op nul. Wanneer de fijnafgestelde parameters de software in staat stellen om alle vlekken te detecteren en tracks correct te bouwen, klik op de knop arrow now om het maken van de tracks te bevestigen en klik op het statistiekenpictogram om de tracksstatistieken te extraheren.

Selecteer vervolgens de benodigde statistiekenparameters en klik op Opslaan als om de waarden als punt-CSV-bestanden te exporteren voor kwantificering en visualisatie. Etikettering met hoge concentraties SYBR goud of PicoGreen resulteert in overvloedige kleuring van de kernen en punctate vlekken in het cytoplasma. Bij lagere concentraties verschijnt een zwak SYBR-gouden signaal in de kernen in een patroon van lichtpuntjes wordt waargenomen binnen het cytoplasma.

PicoGreen etikettering bij lage concentraties levert vooral nucleaire vlekken op. Gelijktijdige kleuring met lage concentraties SYBR-goud in een veel rode mitochondriale kleurstof blijkt dat bijna alle SYBR-goudkleuring optreedt in de mitochondriën terwijl etikettering bij hoge concentraties resulteert in significante kleuring van de kernen en cytoplasma. Time-Lapse beeldvorming blijkt dat na 45 minuten de nucleoïde kleuring dicht bij verzadiging is.

Fixatie veroorzaakt een lichte herverdeling van de kleurstof naar de kern, terwijl permeablisatie van de vaste cellen het gestippelde kleuringspatroon van de mitochondriën elimineert en de nucleaire kleuring verbetert. Als SYBR goud wordt toegevoegd aan de cellen na fixatie en permeablisatie, dan is de kleurstof gelijkmatig verdeeld over het cytoplasma en de kern resulteert in het verlies van de kleuring specificiteit. Live cel 3D beeldvorming door super resolutie gestructureerde verlichting microscoop onthult de mitochondriale nucleoid als lichtpuntjes binnen de mitochondriën.

Het bijhouden van de posities van de nucleoïde op een resolutie buiten de diffractie limiet toont aan dat de meerderheid van de nucleoïden vertonen korte afstand willekeurige bewegingen die waarschijnlijk beperkt zijn tot het mitochondriale netwerk. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol niet compatibel is met de fixatie van het monster. Echter, ons protocol moet compatibel zijn met een breed scala van live cel imaging gebaseerde testen voor de studie van morfologie, dynamiek en activiteiten van moleculen en organellen.

Onze studie illustreert de voordelen van retargeting niet-organische kleurstoffen voor celgebaseerde technieken. Het kan inspireren de exploratie van andere fluorescerende kleurstoffen voor hun toepassing in cellulaire studies.