Name: Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Leer kinetische screening van nuclease-activiteit als biomarker voor ziekten met behulp van nucleïnezuur sondes. Deze flexibele methode identificeert zowel bekende als onbekende activiteiten voor diagnostisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Luiza I. Hernandez (Linköping University) erkennen voor haar zorgvuldige revisie van het manuscript en waardevol advies. Dit werk werd gesteund door de Stichting Knut en Alice Wallenberg en de strategische onderzoeksruimte van de Zweedse overheid in Materials Science over geavanceerde functionele materialen aan de Universiteit van Linköping (faculteits subsidie SFO-mat-LiU nr. 2009-00971).

1. ontwerp en voorbereiding van een oligonucleotide-bibliotheek
<ol><li>Bibliotheek ontwerp<ol>
<li>Op basis van de volgende criteria ontwerp een bibliotheek van afgeschrikt fluorescerende oligonucleotide sondes tussen 8 en 12-Mer lang om secundaire structuur vorming te voorkomen, met gelijke lengte voor alle sondes.<ol>
<li>Omvatten ten minste één DNA en één RNA willekeurige sequentie met een combinatie van adenine (A), Guanine (G), cytosine (C) en thymine (T)/uracil (U) (DNA-en RNA-sondes in tabel 1). Opmerking: de DNA-en RNA-sequenties beschreven in tabel 1 zijn nuttig geweest als de eerste substraten voor het classificeren van een onbekend type Nuclease activiteit, ofwel DNase of RNase. Deze twee sequenties worden aanbevolen als uitgangspunt voor elke screening, omdat ze een breed vermogen hebben aangetoond om Nuclease-activiteitsprofielen in bacteriën en weefselmonsters te detecteren. Als Nuclease activiteit niet wordt waargenomen met deze DNA-en RNA-sequenties, is het ontwerp van extra oligonucleotiden vereist.</li>
			<li>Neem polynucleotide sequenties op die bestaan uit één type nucleotide om de sequentie afhankelijkheid voor een bepaalde Nuclease activiteit te bepalen (DNA-poly A, DNA-poly T, DNA-poly C, DNA-Poly G, RNA-poly A, RNA-poly U, RNA-poly C en RNA-Poly G in tabel 1).</li>
			<li>Met behulp van dezelfde sequentie van nucleotide residuen als de initiële DNA en RNA sequenties, omvatten sequenties die nucleoside analogen harkotteren chemische modificaties op de 2 '-positie van de ribose suiker, zoals 2 '-fluoro en 2 '-O-methyl bevatten, als een strenge stap voor het verhogen van de selectiviteit van de nucleasen.<ol>
<li>Omvatten volledig gemodificeerde sequenties die volledig bestaan uit 2 '-fluoro nucleoside analogen of 2 '-O-methyl nucleoside analogen (alle 2 '-F en alle 2 '-OMe, tabel 1)</li>
				<li>Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke purines en 2 '-fluoro pyrimidine nucleoside analogen (RNA Pyr-2'F, tabel 1).</li>
				<li>Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke purines en 2 '-O-methyl pyrimidine nucleoside analogen (RNA Pyr-2'OMe, tabel 1).</li>
				<li>Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke pyrimidinen en 2 '-fluoro purine nucleoside analogen (RNA PUR-2'f, tabel 1).</li>
				<li>Omvatten chimerische sequenties bestaande uit niet-gemodificeerde natuurlijke pyrimidinen en 2 '-O-methyl purine nucleoside analogen (RNA PUR-2'ome, tabel 1).</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding en opslag van oligonucleotide sonde Opmerking: oligonucleotiden worden gesynthetiseerd door de fosforamidtische methode. Na synthese worden de oligonucleotiden gezuiverd met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en wordt de massa gemeten met massaspectrometrie.<ol>
<li>Draai de gelyofiliseerde oligonucleotide sondes met een centrifuge af en Verdun ze in tris-EDTA (TE) buffer om Nuclease afbraak te voorkomen. Bepaal het verdunningsvolume volgens de opbrengst van elke sonde om een stamoplossing met een concentratie van 500 pmol/μL te genereren.</li>
		<li>Bewaar gelyofiliseerd oligonucleotiden bij 4 °c of op kamertemperatuur voor een korte termijn. Voor lange termijn opslag (maanden tot jaren), bewaar gelyofiliseerd oligonucleotiden bij-20 °c. Bij resuspensie van gelyofiliseerde oligonucleotiden in TE, bewaar de stamoplossingen bij-20 °C of bij voorkeur bij-80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bacteriële cultuur
<ol><li>Neem een poreuze glazen kraal van de cryogene opslag flacon onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>Om individuele bacteriële kolonies (salmonella en E. coli) te isoleren, gebruikt u de Kwadrant methode24 door de kraal direct op een Petri schaaltje met tryptische soja agar (TSA) medium, aangevuld met gedefibreerde schapen, te streaking/te rollen Bloed.</li>
	<li>Incuberen de cultuur bij 37 °C gedurende 24 uur.</li>
</ol>3. supernatant voorbereiding
<ol><li>Breng een enkele kolonie over van vaste media naar 50 mL Tryptische soja Bouillon (TSB) en inincuberen bij 37 °C gedurende 24 uur bij 200 rpm.</li>
	<li>Verdun de kweek (1:500) in TSB (subcultuur) en incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur bij 200 rpm in een schud incubator. NB: verwacht wordt dat na 24 uur incubatie de bacterieculturen in stationaire fase waarden van meer dan 109 kve/ml bereiken.</li>
	<li>Na de incubatieperiode, breng de culturen over naar afgetopte steriele buizen en Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 4.500 x g .</li>
	<li>Verzamel het supernatant en gebruik het onmiddellijk. U ook de supernatanten bewaren bij 4 °c of-20 °c.</li>
</ol>4. Nuclease activiteit assay
<ol><li>Voorbereiding van werkoplossingen<ol>
<li>Bereid een werkoplossing van 20 μL voor elke sonde in 1,5 mL Nuclease vrije microcentrifuge buizen door verdunning (1:10 ratio) de stamoplossing (500 pmol/μL) voor een uiteindelijke werkconcentratie van 50 pmol/μL. Meng hiervoor 18 μL fosfaat buffer zout (PBS) met MgCl2 en CACL2 met 2 μL sonde voorraadoplossing. Opmerking: Houd er rekening mee dat in de werkoplossing de oligonucleotiden kwetsbaarder zijn voor Nuclease afbraak, daarom wordt het aanbevolen om de werkoplossingen te bereiden vlak voordat de reactie wordt ingesteld.</li>
		<li>Vermijd direct licht contact tijdens de bereiding en houd in het donker (verpakt in folie), bij het omgaan met fluoroforen.</li>
	</ol></li>
	<li>Reactie ingesteld<ol>
<li>Verwarm de fluometer (bv. Cytatie 1) voor op 37 °C.</li>
		<li>Bereid een set (één buis/sonde) van 1,5 mL Nuclease vrije microcentrifuge buizen voor elk monster (TSB, E. coli en salmonella) en etiket dienovereenkomstig.</li>
		<li>Voeg voorzichtig 96 μL TSB steriele kweekmedia, salmonella supernatant of E. coli supernatant toe (uit de stap 3,4.). Voeg vervolgens 4 μL/buis van de probe-werkoplossing dienovereenkomstig toe. Deze stap bij kamertemperatuur uitvoeren. Opmerking: 10 sondes werden gebruikt voor de eerste ronde van de screening en 6 sondes voor de tweede ronde.</li>
		<li>Meng grondig door Pipetteer op en neer om een homogene oplossing te verkrijgen. Vermijd het inbrengen van luchtbellen in de monsters tijdens het mengen.</li>
		<li>Laad 95 μL van elke oplossing (sonde + supernatant of cultuur media) in een aparte put van een zwarte bodem, niet-behandelde 96 goed plaat. Minimaliseer de vorming van bubbels in de putten bij het laden door voorzichtig te doseren met de punt dicht bij de wand van de put.</li>
		<li>Dek de plaat af met het deksel. Inspecteer het deksel visueel en controleer op penmarkeringen of ophoping van stofdeeltjes die meet artefacten kunnen introduceren. Vervang het deksel voor een nieuwe als dat het geval is.</li>
	</ol></li>
	<li>Instellen van de meting<ol>
<li>Open de verwervings software (GEN5 3,05) door te klikken op het pictogram Software snelkoppeling (figuur S1A).</li>
		<li>Selecteer nu lezen in het venster Taakbeheer en kies Nieuw... om het Kinetic MEASUREMENT Protocol (afbeelding S1B) te maken.</li>
		<li>Klik op temperatuur instellen in het dialoogvenster met de titel Procedure en selecteer 37 °c. Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S1C).</li>
		<li>Klik op Start kinetiek in het dialoogvenster met de titel procedure. Selecteer vervolgens in het pop-upvenster Kinetic Step, 2 h in het invoerveld voor de runtime en 2 min in het interval invoerveld. Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S1D).</li>
		<li>Klik op lezen in het dialoogvenster met de titel procedure. Vervolgens in het pop-upvenster met de titel leesmethode, selecteer intensiteit fluorescentie als een detectiemethode, endpoint/Kinetic als een lees type en filters als optica type. Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S1E).</li>
		<li>Selecteer groen in de Filtersetin het pop-upvenster met de titel Read Step (Kinetic). Bevestig en sla de instellingen op door op OK te drukken (afbeelding S2A).</li>
		<li>In het dialoogvenster met de titel procedure, selecteer deksel gebruiken en klik op valideren om ervoor te zorgen dat het gemaakte Protocol geldig is. Dit wordt bevestigd door een pop-upvenster (afbeelding S2b).</li>
		<li>Selecteer protocol in de menubalk en kies procedure (afbeelding S2C).</li>
		<li>Definieer in het dialoogvenster met de titel procedurede putjes die moeten worden gemeten (figuur S2D).</li>
		<li>Voer de naam van het experiment in de bestandsnaam invoer vak (afbeelding S2E).</li>
		<li>Laad de plaat met het deksel in de plaat lezer. Zorg ervoor dat de plaat zich in de juiste richting bevindt.</li>
		<li>Start de overname door te klikken op nieuwe knop lezen op de werkbalk (afbeelding S2F).</li>
	</ol></li>
	<li>Data-analyse<ol>
<li>Klik op een van de gemeten putjes in het dialoogvenster met de titel Plate 1 (afbeelding S3A).</li>
		<li>Klik op Wells selecteren en neem alle gemeten putten op in het dialoogvenster goed selecteren . Bevestig en sla de instellingen op door op OKte drukken. (Afbeelding S3B).</li>
		<li>Selecteer gegevens in het dialoogvenster met de titel plaat 1 om de getabelleerde resultaten te visualiseren (afbeelding S3C).</li>
		<li>Exporteer de gegevens naar een spreadsheet door snel exporteren te selecteren in het contextmenu (afbeelding S3C).</li>
		<li>Label in het spreadsheet de gegevenskolommen dienovereenkomstig voor elk monster en elke sonde.</li>
		<li>Genereer kinetische grafieken, met behulp van lijn met markers stijl, door het uitzetten van relatieve fluorescentie eenheden (RFU) versus tijd (x-as: tijdlijn van de reactie en y-as: rfus). Opmerking: de beschrijving van het genereren van een grafiek is van toepassing bij het gebruik van spreadsheet programma's (bijvoorbeeld Excel). Andere Programma's kunnen echter worden gebruikt om grafieken te genereren uit de verkregen onbewerkte gegevens, door RFU versus tijd te plotten.</li>
		<li>Bereken de snelheid van de enzymatische reactie voor elk gemeten interval volgens de volgende formule25: rate = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq1.jpg"> </img>, waarbij if is RFU op het maximale INTERVALTIJD punt en II is RFU op het minimale intervaltijd punt, en TF en Ti zijn respectievelijk de maximale en minimale intervaltijd punten.</li>
		<li>Selecteer de snelheid met de hoogste waarde (RMax) voor elke curve. Als er meer dan één RMax per sample, selecteert u degene die plaatsvindt op het vroegste meet tijdpunt.</li>
		<li>Bereken de verhouding tussen RMax en de gemiddelde waarde van het tijdsinterval waarbij rMax optreedt: tarief coëfficiënt =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60005/60005eq2.jpg">
</li>
		<li>Bereken het vouw verschil (FD) tussen de tarief coëfficiënt van salmonella en E. coli voor elke sonde.</li>
		<li>Overweeg een vouw verschil waarde hoger dan 3 als significant.</li>
		<li>Overweeg de belangrijke sondes met de hoogste vouw verschil waarden (FD) als kandidaat-voelers en als basis voor het bibliotheek ontwerp in de volgende screening ronde.</li>
	</ol></li>
</ol>5. selectie criteria voor de screening rondes (Figuur 1)
<ol><li>Eerste screening ronde<ol>
<li>Voer de Nuclease-activiteitstest (zoals beschreven in rubriek 4) uit met behulp van DNA-, RNA-en polynucleotide-sondes.</li>
		<li>Evalueer de voorkeur voor DNA-chemie of RNA-chemie door het aantal en de prestaties (FD-waarde) van DNA-en RNA-kandidaat-sondes te vergelijken.</li>
		<li>Selecteer het type nucleïnezuur chemie die het grootste aantal kandidaatsondes weergeven, zoals geïllustreerd in Figuur 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tweede screening ronde<ol>
<li>Voer de Nuclease activiteit assay (zoals beschreven in sectie 4) met behulp van volledig gemodificeerde sondes en CHIMERE sondes ontworpen op basis van het nucleïnezuur substraat geselecteerd in de eerste screening ronde.</li>
		<li>Evalueer de voorkeur naar sequenties met 2 '-fluoro en 2 '-O-methyl nucleoside analogen door vergelijking van de resultaten verkregen voor 2 '-fluoro en 2 '-O-methyl gemodificeerde kandidaat-sondes.</li>
		<li>Selecteer het type nucleoside analoge modificatie die het grootste aantal kandidaat-sondes weergeven, zoals geïllustreerd in Figuur 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleases%3A+diversity+of+structure%2C+function+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li>
<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911(2018).</li>
<li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li>
<li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li>
<li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional%2C+surface-attached+extracellular+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574(2014).</li>
<li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125(2014).</li>
<li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).</li>
<li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li>
<li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li>
<li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li>
<li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity%3A+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death & Disease. 7 (11), 2458(2016).</li>
<li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnases+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li>
<li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li>
<li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tipping+the+balance%3A+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li>
<li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li>
<li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li>
<li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li>
<li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li>
<li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communication+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li>
<li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064(2012).</li>
<li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Clinical+Enzyme+Measurements%22">Manual of Clinical Enzyme Measurements</a>. , Worthington Diagnostics. (1972).</li>
<li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234(2016).</li>
<li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+confidence+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li>
<li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+overview%3A+selection%2C+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li>
<li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+concept%2C+innovations%2C+applications+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li>
<li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+binding+proteins%3A+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li>
<li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Aptamers%3A+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+peptide+libraries%3A+mining+for+cell-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Veranderingen van Nuclease activiteit zijn in verband gebracht met een breed scala aan ziekten fenotypes, met inbegrip van verschillende soorten kanker en bacteriële infecties. Deze wijzigingen worden voorgesteld als de veroorzaker van een aandoening14, terwijl in andere gevallen zij het gevolg zijn van een schadelijk fysiologisch voorval20 of pathogene agens16,26. Niet verrassend, pogingen om nucleasen en Nuclease ...

Nucleasen zijn een klasse van enzymen die in staat zijn om de fosfodiësterbindingen die de ruggengraat structuur van nucleïnezuur moleculen vormen, te cleaven. De enorme diversiteit van nucleasen maakt hun classificatie nogal moeilijk. Er zijn echter enkele gemeenschappelijke criteria die worden gebruikt om nucleasen te beschrijven, zoals substraat voorkeur (deoxyribonucleïnezuur (DNA) of ribonucleïnezuur (RNA)), decolleté (endonucleases of exonucleases), of metaalionen afhankelijkheid, onder andere1. Nucleasen zijn sterk geconjugeerde katalytische enzymen die fundamentele rollen hebben in zowel prokaryote als eukaryote organismen en zijn gebruikt, en blijven worden gebruikt, als gen editing tools2. Ze zijn ook fundamentele actoren in DNA-onderhoud en-replicatie, helpen om genoom stabiliteit te houden en deel te nemen aan proof-reading processen3. In bacteriën, bijvoorbeeld, nucleasen zijn geïdentificeerd als belangrijke virulentie factoren, in staat om bacteriële overleving te bevorderen door het verminderen van de werkzaamheid van het immuunsysteem van de gastheer4,5,6,7 ,8. Bij zoogdieren zijn nucleasen gesuggereerd om betrokken te zijn bij apoptosis9, mitochondriale biogenese en onderhoud10 en bemiddeling van antibacteriële en antivirale aangeboren immuunresponsen11. Niet verrassend, Nuclease activiteit veranderingen, of verbetering of gebrek aan, zijn betrokken bij een breed scala van menselijke ziekten. Deze ziekten variëren van een breed scala aan kankers12,13 tot cardiale hypertrofie10 of auto-immuunziekten14. Daarom zijn nucleasen interessante kandidaten geworden als biomarkers voor een heterogene groep menselijke aandoeningen. In feite hebben nucleasen al hun potentieel aangetoond als succesvolle diagnostische hulpmiddelen voor het opsporen van infecties veroorzaakt door specifieke bacteriële agentia, zoals Staphylococcus aureus of Escherichia coli15, 16. in veel soorten kanker is expressie van stafylokokken Nuclease Domain-bevattende proteïne 1 (SND1) ribonuclease indicatief voor slechte prognose17. Bij patiënten met pancreaskanker zijn verhoogde ribonuclease I (RNase I) serumspiegels gemeld18 en voorgesteld om te worden geassocieerd met kankerachtige cel fenotypes19. In ischemische hartaandoeningen, zoals myocardinfarct of instabiele angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumspiegels is aangetoond dat een geldige diagnostische marker20,21.
Het heeft zijn veronderstelde dat de globale blauwdruk van Nuclease activiteit kan verschillen in gezonde en ziektetoestanden. In feite hebben recente rapporten gebruik gemaakt van verschillen in Nuclease activiteit om onderscheid te maken tussen gezonde en kankerachtige fenotypes22 of om pathogene bacteriële infecties te identificeren op een soortspecifieke manier15,23. Deze bevindingen hebben een nieuwe laan geopend voor het gebruik van nucleasen als biomarkers van de ziekte. Daarom bestaat er een noodzaak voor de ontwikkeling van een uitgebreide screeningsmethode die in staat is om systematisch met de ziekte samenhangende verschillen in Nuclease activiteit te identificeren, wat van cruciaal belang kan zijn bij de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten.
Hierin introduceren en beschrijven we een nieuwe in-vitro screening aanpak (Figuur 1) om gevoelige en specifieke sondes te identificeren die kunnen discrimineren tussen Nuclease activiteit in gezond en ongezond, of activiteit specifiek voor een type cel of bacteriën. Door gebruik te maken van de modulariteit van nucleïnezuren, ontwierpen we een initiële bibliotheek van gebluste fluorescerende oligonucleotide sondes bestaande uit een uitgebreide set van verschillende sequenties en chemici, beide zijn belangrijke parameters voor het ontwerp van de bibliotheek. Deze oligonucleotide sondes worden geflankeerd door een de (fluorescein amidite, fam) en een dorstlesser (Tide dorstlesser 2, TQ2) aan respectievelijk 5 ' en 3 ' uiteinden (tabel 1). Door gebruik te maken van deze fluorometrische assay op basis van fluorescerende resonantie energie overdracht (FRET) om de kinetiek van enzymatische afbraak te meten, konden we kandidaatsondes identificeren met het potentieel om differentiaal patronen van Nuclease activiteit te discrimineren geassocieerd met gezonde of ziektetoestanden. We ontwierpen een iteratief proces, waarin nieuwe bibliotheken worden gemaakt op basis van de beste kandidaat-sondes, die het mogelijk maakt om steeds specifiekere kandidaat-sondes te identificeren in volgende screenings stappen. Bovendien maakt deze aanpak gebruik van de katalytische aard van nucleasen om de gevoeligheid te verhogen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van de activeerbaar aard van de reporter sondes en het vermogen van nucleasen om substraat moleculen voortdurend te verwerken, die beide belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve antilichamen of kleine op moleculen gebaseerde screeningsmethoden vertegenwoordigen.
Deze aanpak biedt een zeer modulair, flexibel en eenvoudig te implementeren screening tool voor de identificatie van specifieke nucleïnezuur voelers die kunnen discrimineren tussen gezonde en ziektetoestanden, en een uitstekend platform voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast voor toekomstige klinische toepassingen. Als zodanig werd deze benadering gebruikt om de Nuclease activiteit te identificeren die is afgeleid van salmonella typhimurium (hierna salmonellagenoemd) voor de specifieke identificatie van deze bacteriën. In het volgende Protocol rapporteren we over een methode voor het scherm voor bacteriële Nuclease-activiteit met behulp van kinetische analyse.

<table><tbody><tr><td>Black bottom, niet-behandelde 96-wellplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000631</td><td></td></tr><tr><td>Cytation1</td><td>BioTek</td><td>CYT1FAV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfbuisjes</td><td>Thermofisher</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>Microbank cryogeen opslagbuisje met kralen</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>22-286-155</td><td></td></tr><tr><td>Nucleïnezuursondes</td><td>Biomers.net</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing met MgCl2 en CaCl2</td><td>Gibco&trade;</td><td>14040117</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica subs. Enterica</td><td>ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647633</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone Soya Agar met gedefibrineerde schapenbloed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362223</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetische screening van nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleasen zijn een klasse van enzymen die nucleïnezuren afbreken door de hydrolyse van de fosfodiësterbindingen die de ribose-suikers koppelen, te katalyseren. Nucleasen vertonen een verscheidenheid aan vitale fysiologische rollen in prokaryotische en eukaryote organismen, variërend van het handhaven van genoom stabiliteit tot het bieden van bescherming tegen pathogenen. Veranderde Nuclease activiteit is geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen, waaronder bacteriële infecties en kanker. Om dit te doen, Nuclease activiteit heeft aangetoond groot potentieel om te worden uitgebuit als een specifieke biomarker. Een robuuste en reproduceerbare screeningsmethode op basis van deze activiteit blijft echter zeer wenselijk.
Hierin introduceren we een methode die screening mogelijk maakt voor Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes als substraten, met de reikwijdte van het differentiëren tussen pathologische en gezonde omstandigheden. Deze methode biedt de mogelijkheid van het ontwerpen van nieuwe probe-Bibliotheken, met toenemende specificiteit, op een iteratieve manier. Zo zijn meerdere screenings rondes nodig om het ontwerp van de probes te verfijnen met verbeterde functies, waarbij gebruik wordt maken van de beschikbaarheid van chemisch gemodificeerde nucleïnezuren. Het aanzienlijke potentieel van de voorgestelde technologie ligt in de flexibiliteit, hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid voor de screening van Nuclease activiteit in verband met ziekte omstandigheden. Verwacht wordt dat deze technologie de ontwikkeling van veelbelovende diagnostische hulpmiddelen mogelijk maakt met een groot potentieel in de kliniek.

Figuur 1 toont de werkstroom van deze methodologie, die is onderverdeeld in twee screenings rondes. In de eerste screening ronde gebruikten we 5 DNA-sondes (DNA, DNA poly A, DNA poly T, DNA poly C en DNA Poly G) en ook 5 RNA sondes (RNA, RNA poly A, RNA poly U RNA poly C en RNA Poly G). De ruwe gegevens van deze screening ronde zijn te vinden in aanvullende tabel 1. In de tweede ronde werden chemisch gemodificeerde sondes gesynthetiseerd door de RNA-sequentie te vervangen do...

Veranderde Nuclease activiteit is in verband gebracht met verschillende menselijke omstandigheden, die onderliggende zijn potentieel als een biomarker. De modulaire en eenvoudig te implementeren screenings methodiek die in dit document wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk specifieke nucleïnezuur voelers te selecteren voor het benutten van Nuclease activiteit als een biomarker van de ziekte.

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Dit protocol biedt een krachtig alternatief voor het screenen van nuclease-activiteit als biomarker van de ziekte, met een eenvoudig te implementeren methodologie, zelfs voor onderzoekers die niet zo gespecialiseerd zijn in nucleïnezuursondes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om nucleïnezuursondes te selecteren die zowel bekende als onbekende nuclease-activiteiten kunnen identificeren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de sonde-nuclease dynamische interactie. Andere voordelen van deze methodologie zijn de flexibiliteit, hoge reproduceerbaarheid en gebruiksgemak.De demonstratie wordt uitgevoerd door Khadija, een masters student, en Baris, een postdoc uit ons laboratorium. Bij het ontwerpen van een oligonucleotide bibliotheek, omvatten ten minste een DNA en een RNA willekeurige sequentie met een combinatie van adenine, guanine, cytosine en thiamine of uracil. Om de oligonucleotidesondes voor te bereiden, draai je de lyophilized oligonucleotidesondes naar beneden en verdun je elke sonde in tris-EDTA-buffer bij een 500 picomolar per microliterconcentratie om nuclease afbraak te voorkomen.Voor bacteriële cultuur op vast medium, rol een enkele poreuze glazen kraal van cryogene opslag rechtstreeks op een cultuur schotel met TSA aangevuld met gedefibrineerd schapenbloed te strepen uit individuele bacteriële kolonies. Plaats de plaat dan 24 uur op 37 graden Celsius. Voor bacteriële cultuur in vloeibaar medium, breng een enkele kolonie van een solide medium cultuur naar 50 milliliter TSB voor incubatie bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur bij 200 rotaties per minuut.De volgende dag, verdun de cultuur op een een tot 500 verhouding in verse TSB en broeden de bacteriën voor een extra 24 uur op 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut in een schudden incubator. Om een nuclease activiteitstest op te zetten, verwarm eerst een fluorometer tot 37 graden Celsius en voeg voorzichtig 96 microliter steriele TSB of supernatant van een Salmonella of E.Coli vloeibare medium cultuur toe aan één 1,5 milliliter nuclease-vrije microcentrifuge buis per sonde. Voeg vier microliters van sonde werkoplossing aan elke buis en gebruik een pipet om grondig mengen elke buis inhoud tot homogene oplossingen zijn bereikt, het verzorgen van bubbels te voorkomen.Laad vervolgens voorzichtig 95 microliter van elke oplossing dicht bij de wand van individuele putten van een zwarte bodem, niet-behandelde 96 putplaat, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Wanneer alle oplossingen zijn toegevoegd, dek de plaat af en inspecteer visueel het deksel op penmarkeringen of stof dat meetartefacten kan introduceren. Open een geschikt acquisitiesoftwareprogramma om de software voor nuclease-activiteitsmeting in te stellen.Selecteer Nu lezen in het venster Taakbeheer en selecteer Nieuw om het kinetische metingsprotocol te maken. Klik op Temperatuur instellen om 37 graden Celsius te selecteren en bevestig en sla de instellingen op door op OK te klikken. Klik op Kinetiek starten. Selecteer in het pop-upvenster twee uur in het invoervak Tijd uitvoeren en twee minuten in het intervalinvoervak voordat u op OK klikt om de instellingen te bevestigen en op te slaan.Klik op Lezen. Selecteer in het pop-upvenster Fluorescentieintensiteit als detectiemethode, Eindpunt kinetisch als leestype en filters als optiektype. Klik vervolgens op OK. Selecteer Groen in het pop-upvenster in de filterset en klik op OK. Selecteer in het venster Procedure het deksel gebruiken en klik op Valideren.Er verschijnt een pop-upvenster waarin wordt bevestigd dat het gemaakte protocol geldig is. Selecteer procedure onder het menu Protocol. Definieer in het venster Procedure de te meten putten en voer de naam van het experiment in het invoervak Bestandsnaam in.Laad vervolgens de plaat in de plaatlezer, zorg ervoor dat de plaat in de juiste richting en klik op de knop Nieuw lezen om de overname te beginnen. Open voor gegevensanalyse de gegevens in de juiste analysesoftware en selecteer een van de gemeten putten in de plaat één venster. Klik op Putten selecteren en voeg alle gemeten putten toe in het dialoogvenster Putselectie voordat u op OK klikt. Selecteer vervolgens Gegevens in het hoofdvenster van de plaat om de getabuleerde resultaten te visualiseren en klik op QuickExport om de gegevens naar een spreadsheet te exporteren.Label in een spreadsheet de gegevenskolommen naar gelang van het geval voor elk monster en elke sonde en zet de relatieve fluorescentie-eenheden in kaart ten opzichte van de tijd voor de gegevens om kinetische grafieken te genereren. In dit representatieve experiment, na de eerste testronde, rapporteerden de Salmonella-cultuursupernatants een duidelijke voorkeur voor RNA-sondes boven de DNA-sondes. Op basis van de identificatie van RNA als het gewenste nucleïnezuurtype door Salmonella nucleases, is een nieuwe RNA-only bibliotheek ontworpen om te worden gebruikt in de tweede screeningsronde.E.Coli in de medium controles in de cultuur toonde daarentegen een zeer beperkt vermogen om RNA-sondes te degraderen. Na een tweede screeningsronde met behulp van chemisch gemodificeerde nucleotiden die gericht zijn op het verhogen van de specificiteit van de RNA-sondes, kon RNA pyrimidine 2'O-methyl en RNA purine 2'O-methyl op basis van hun chemische modificaties worden geïdentificeerd als het best presterende kinetische gedrag in vergelijking met respectievelijk het RNA pyrimidine 2'fluoro en RNAine 2'fluoro. Deze resultaten suggereren dat Salmonella heeft een belangrijke RNAse activiteit met differentiële substraat chemie voorkeur die kan worden gebruikt voor het selecteren van sondes in staat om specifiek te herkennen deze bacteriën.Deze procedure maakt het mogelijk om sondes te selecteren die in staat zijn om nuclease-activiteiten in verband met ziekteomstandigheden te identificeren, zoals kanker of bacteriële infectie, waardoor nieuwe klinische diagnostische instrumenten kunnen worden ontwikkeld.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate the procedure to determine the helicase activity of a target protein to unwind the biotin-labeled dsRNA substrate. The activity of the enzyme was identified by analyzing the electrophoretic mobility shift, followed by a chemiluminescence assay using chemiluminescent enzyme-conjugated streptavidin.

Helicase Activity Measurement of a Target Protein Using Biotin-Labeled RNA Duplexes

Exonucleasen spelen een cruciale rol bij het waarborgen van de stabiliteit van het genoom. Verlies van de WRN-exonucleasefunctie resulteert in voortijdige veroudering. Het bestuderen van substraten en andere vereisten van de nuclease in vitro kan helpen bij het verduidelijken van zijn rol in vivo. Hier demonstreren we een snelle en reproduceerbare fluorescentie-gebaseerde assay om zijn nuclease-activiteit te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde Exonuclease Assay te karakteriseren DmWRNexo, ortholoog van Human Progeroid WRN Exonuclease, en de toepassing ervan op andere Nucleasen

We beschrijven gevoelige, gel-gebaseerde discontinue assays om de kinetiek van lagging-strandinitiatie te onderzoeken met behulp van de replicatie-eiwitten van bacteriofaag T7.

Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Door de bacteriofaag T7 Replication Eiwitten

Hier zijn de protocollen voor in vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten die algemeen toepasbaar voor het bestuderen van eiwit-nucleïnezuur interacties.

In vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten om eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen

NMR-based activiteit assays zijn ontwikkeld om te identificeren en te karakteriseren remmers van twee nucleoside ribohydrolase enzymen. De protocollen worden verstrekt voor aanvankelijke samenstellings analyses bij 500 μM en 250 μM, dosis-reactie analyses voor het bepalen van IC50 waarden, detergent tegen het scherm analyses, sprong-verdunnings tegen het scherm analyses, en analyses in de gehele cellen van E. coli .

NMR-based activiteit assays voor het bepalen van samengestelde remming, IC50 waarden, artefactuele activiteit, en de hele cel activiteit van nucleoside Ribohydrolases

Een zeer parallelle methode voor het meten van het site-specifieke decolleté van DNA op het niveau van één molecuul wordt beschreven. Dit protocol toont de techniek met behulp van de beperking endonuclease NdeI. De methode kan eenvoudig worden aangepast om elk proces dat resulteert in site-specifieke DNA-decolleté te bestuderen.

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

Deze studie presenteert een eenvoudige, gebruiksvriendelijke ratiometrische FRET-test voor de detectie en kwantitatieve beoordeling van DNase-activiteit, en demonstreert de toepassing ervan bij de analyse van een zwakke nuclease.

Beoordeling van DNase-activiteit door ratiometrische fluorescentieresonantie energieoverdracht

Dit protocol beschrijft een biochemische test met gelverschuiving voor het meten van de activiteit van FEN1 (Flap Endonuclease 1) en de ontwikkeling van remmers.

Op fluorescentie gebaseerde detectie van FEN1-nuclease-activiteit en screening van kleinmoleculaire remmers

Leer kinetische screening van nuclease-activiteit als biomarker voor ziekten met behulp van nucleïnezuur sondes. Deze flexibele methode identificeert zowel bekende als onbekende activiteiten voor diagnostisch onderzoek.

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Meer video's verkennen