Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen

Dit protocol kan worden gebruikt voor de postmortemdiagnose van dierlijke hondsdolheid vanaf de eerste weergave van de dictie in het veld tot de moleculaire conformatie in een gecentraliseerd niveau van activiteit. Snelle immunochromatografische diagnosetesten is een nuttig alternatief voor landelijke en landelijke eigenschappen in Afrika en Azië, waarbij referentiematerialen voor rabiësdiagnose niet beschikbaar zijn. Het aantonen van de procedure zal Simon Bonas een technicus van mijn laboratorium zijn.

Het aantonen van het eerste deel van de procedure zal Ibrahima Dicko, een technicion van de Laboratoire Central Veterinaire in Bamako, Mali. Gebruik een mes om het hoofd van het dier te verwijderen voor de eerste halswervels om toegang te krijgen tot de foramen magnum. En gebruik een geschikt hulpmiddel om een hersenstammonster te verzamelen.

Zoals een wegwerp pipet, drinkstro, klem of druppelaar zoals hier getoond. De hersenstam is dan duidelijk zichtbaar zoals hier aangetoond met het puntje van deze pipet. Gebruik een geschikt hulpmiddel om een deel van deze hersenstam te verzamelen, zoals een drinkstro.

Steek het voorzichtig en draai voorzichtig om het hersenweefsel te verzamelen. Vergeet niet om het stro met uw vinger te sluiten alvorens het te verwijderen, om de biopsie te verzamelen. Het gebruik van een klem is ook mogelijk.

Om grotere stukken hersenstam te verzamelen op het niveau van de foramen magnum. Als alternatief is het mogelijk om direct de druppelaar in de kit te gebruiken om de hersenstam te verzamelen. Net als bij het drinkstro, steek de druppelaar zorgvuldig tijdens het drukken en draai zachtjes om het hersenweefsel te verzamelen.

Dan aspirate het hersenweefsel en plaats het in een container als de stop van een buis. Voor een nauwkeurige diagnose is het van cruciaal belang om de hersenstam te verzamelen die de medulla ablongata bevat, tijdens de monsterverzameling. Plet het hersenmateriaal voorzichtig direct in de buis met de buffer met het wattenstaafje of de druppel gedurende ongeveer 30 seconden totdat een homogene suspensie is verkregen.

Met behulp van de druppelaar, deponeren vier druppels ongeveer 100 microliter van de suspensie in het monster inlaat op het testapparaat. In geval van vertraging als gevolg van een hoge viscositeitsuspensie of om het begin van de migratie te versnellen, krab dan voorzichtig de onderkant van de afzettingsplaats van het apparaat met de druppelaar. Wacht één tot vijf minuten voordat u het testapparaat leest.

Een monster wordt als positief beschouwd voor hondsdolheid wanneer twee lijnen zichtbaar zijn. Negatief, als alleen de controlelijn aanwezig is. En ongeldig als alleen de testlijn of geen lijnen zichtbaar zijn.

Als u het RNA uit een apparaatmonster wilt extraheren, opent u het apparaat voorzichtig en verwijdert u het filterpapier. Verzamel het deponagegebied van het monster en plaats het monster in een milliliter trireagent ls. Na een uur bij kamertemperatuur met regelmatige zachte handmatige agitatie, extract het RNA uit de buizen supernatant volgens de standaard RNA extractie protocollen. Het toevoegen van twee microliters van glycogeen om de RNA-neerslag te vergemakkelijken volgens de aanbevelingen van de fabrikanten.

Pas het uiteindelijke volume van de RNA-resuspensie aan op 50 microliter met nucleasevrij water. En bereid de master mix reactie oplossing voor de drie verschillende omgekeerde transcriptase kwantitatieve PCR testen volgens de tabel. Met behulp van de primers en sondes zoals aangegeven in de tabel.

Bij vijf microliter van de verdunde RNA-monsters. En 15 microliters van master mix aan elk van de drie verschillende tests in duplicaat in de juiste 96 goed reactieplaten. Voeg de juiste positieve en negatieve besturingselementen voor elke test toe aan elke plaat in tweevoud.

Voer vervolgens de verschillende tests uit volgens de thermische fietsomstandigheden zoals aangegeven in de tabel. De resultaten kunnen worden geanalyseerd zoals beschreven in de tabel. Het verzamelen van een hersenbiopsie is zo eenvoudig mogelijk om het verzamelen van monsters van hoge kwaliteit te garanderen.

Vergeleken met de referentietechniek was de gevoeligheid en specificiteit van de snelle immunochromatografische diagnostische test hoog in alle laboratoria die deze protocollen gebruikten. Op basis van het cumulatieve aantal geteste monsters was de algehele gevoeligheid en specificiteit meer dan 95%De snelle immunochromatografische diagnostische test is geschikt voor het opsporen van lisavirus in hersenbiopten van geïnfecteerde dieren. Aangezien het niveau van lisavirusantigenen belangrijk is voor de diagnose van hondsdolheid, blijft de detectielimiet echter hoog bij het testen van getitreerde virussuspensaties.

In deze representatieve resultaten, verkregen na RNA-detectie door dubbele gecombineerde panlisavirus omgekeerde transcriptase kwantitatieve PCR targeting van de virale polymerase van lisavirus, een panel van 51 positieve snelle immunochromatografische diagnostische tests werden uitgevoerd. Bovendien kan genotypering worden uitgevoerd voor veertien van de monsters met behulp van de hemi-geneste PCR targeting van het gedeeltelijke nucleoproteïne gen. Diagnose en extrahering voor de teststrip voor genotyperen op basis van na RT PCR, of door voor extra lange snaaranalyse.

De snelle immunochromatografische diagnosetest kan een snelle en nauwkeurige diagnose van hondsdolheid bieden. Dat is cruciaal voor het behoud van golffunctie in continue golf gebaseerde bewakings- en controlesystemen. En het minimaliseren van humanennes.